唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒，由显色剂和参比品液组成，其中，显色剂是由邻苯二甲酸二乙酯、乙酸乙酯、2,4-二硝基苯肼、过氧化氢、盐酸和水组成的，其中，各组分的浓度如下：邻苯二甲酸二乙酯0.35mol/L；乙酸乙酯0.46mol/L；2,4-二硝基苯肼0.07mol/L；过氧化氢0.006mol/L；盐酸（氯化氢）0.62mol/L；参比品液是由唾液酸、L-羟脯氨酸和水组成的，各组分的浓度如下：唾液酸0.3g/L；L-羟脯氨酸0.25g/L。本发明采用特定的显色分析技术，在同一检测体系中，通过一次反应使多种肿瘤标志物（唾液酸、羟脯氨酸）反应显色，由于显色迭加，因而提高了检测的灵敏度，顺应了肿瘤标志物联合检测的潮流，并且操作简便，无须贵重仪器，便于推广应用。
【专利说明】唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒，属于医学检验【技术领域】。
【背景技术】
[0002]唾液酸，又称N-乙酰神经氨酸，是一种天然神经氨酸衍生物，其母体结构是由九个碳原子组成的内环氨基酸，是一族化合物的总称。唾液酸广泛分布于动物体内，人体血清中唾液酸，包括游离唾液酸和结合唾液酸，其中前者含量较低，与脂蛋白和糖蛋白结合的结合唾液酸为血清中唾液酸的主要存在形式。羟脯氨酸，是一种亚氨基酸，为脯氨酸羟化后的产物，通常在第4位上带有羟基，但有时也在第3位上。由于有两个不对称的碳原子，所以有4种立体异构体。在自然界中天然存在的为L-羟脯氨酸，不存在D-羟脯酸。L-羟脯氨酸是胶原蛋白所特有的氨基酸，其它蛋白含量甚微，人体血清中的羟脯氨酸主要为胶原蛋白降解时释放出的游离羟脯氨酸。
[0003]正常代谢时，人体血清中唾液酸、羟脯氨酸含量稳定。当组织细胞发生恶变时，细胞表面糖蛋白在结构和功能上均发生明显改变，结合在糖蛋白上的唾液酸随异常表达的糖蛋白脱落入血，是血液中唾液酸含量升高的原因之一。而血清羟脯氨酸升高是因为在肿瘤发生、发展过程中，肿瘤细胞发生浸润、转移，破坏胶原组织、弹性蛋白甚至于骨组织，导致羟脯氨酸释放增加所致。目前多项研究发现，肿瘤患者血清中唾液酸、羟脯氨酸含量增加，因此在临床检验中常把唾液酸、羟脯氨酸作为检测指标，用于恶性肿瘤的诊断当中。
[0004]目前唾液酸的检测方法主要有酶法、化学比色法和高效液相色谱法。但酶法测定敏感性较低，而化学比色法特异性差，高效液相色谱方法虽具有灵敏度高、特异性好的优点，但是仪器昂贵且不适合临床批量检测。羟脯氨酸的检测方法主要有化学比色法、高效液相色谱法、氨基酸自动分析仪法。氯胺T比色法是羟脯氨酸传统的测定方法，但该方法特异性差、灵敏度低，目前已应用不多。高效液相色谱法、氨基酸自动分析仪法检测羟脯氨酸则同样存在仪器昂贵，检测不方便等问题，限制了临床批量应用。
[0005]由此可见，虽然目前唾液酸、羟脯氨酸各自的检测方法较多，但均存在各种问题，无法常规应用于临床，更是缺乏两者联合检测的方法，因而探寻一种快速、准确、成本低廉、方便适用的唾液酸、羟脯氨酸联合检测的方法，对于提高肿瘤诊断的敏感性、特异性具有重要意义。
【发明内容】
[0006]针对上述现有技术，本发明所要解决的问题是提供一种快速、准确、成本低廉、方便适用的唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒，以及检测方法。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0008]一种唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒，由显色剂和参比品液组成，其中，显色剂是由邻苯二甲酸二乙酯、乙酸乙酯、2，4-二硝基苯肼、过氧化氢、盐酸和水组成的，其中，各组分的浓度如下:[0009]
【权利要求】
1.一种唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒，其特征在于:由显色剂和参比品液组成，其中，显色剂是由邻苯二甲酸二乙酯、乙酸乙酯、2，4-二硝基苯肼、过氧化氢、盐酸和水组成的，其中，各组分的浓度如下:
邻苯二甲酸二乙酯 0.35 mo I/L
乙酸乙酯0.46mol/L
2，4-二硝基苯肼 0.07 mol/L过氧化氢0.006 mol/L盐酸(氯化氢)0.62 mol/L 参比品液是由唾液酸、L-羟脯氨酸和水组成的，各组分的浓度如下: 唾液酸0.3g/L L-羟脯氨酸 0.25g/L。
2.利用权利要求1所述的唾液酸、羟脯氨酸联合检测试剂盒检测唾液酸、羟脯氨酸的方法，其特征在于:取样品，加入显色剂，充分混匀，置沸水浴(能够保持持续沸腾)中准确反`应15分钟，迅速取出置于室温水(< 25°C)中冷却5分钟，终止反应；以3000转/分离心10分钟，取上清液，测量在波长450nm、光径0.5cm处的吸光度值，以蒸馏水调零；同时，对参比品液进行同样的操作，参比品液理论值为100U/ml ;根据以下公式计算检测值:
,...样品吸光度值
检测值(U/ml) = ~P估-χ100参比品液吸光度值
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【文档编号】G01N21/78GK103512880SQ201310430261
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】王传新, 张义, 张欣, 杜鲁涛, 李培龙 申请人:山东大学齐鲁医院