荧光显微镜中聚焦的装置和方法
【专利摘要】请求保护的发明提供了一种用于荧光显微镜中聚焦的装置和方法，其能够缩短聚焦时间，增加系统速度，并避免不希望的光漂白。本发明的荧光显微镜使用一部分激发光，以形成样品的图像，来确定荧光成像的焦平面。由于这部分激发光的强度大大高于荧光的强度，所以大大减小了用于聚焦目的图像形成的曝光时间。本发明的荧光显微镜能够进行预聚焦和多路聚焦。
【专利说明】荧光显微镜中聚焦的装置和方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种荧光显微镜，具体涉及一种用于荧光显微镜的聚焦装置和方法。【背景技术】
[0002]突光显微镜是一种使用突光和磷光生成图像的光学显微镜。试样用被突光吸收的至少一种特定波长的光照射，使它们发射更长波长的光。典型的荧光显微镜包括:如汞弧灯的光源、激发滤光器、二向色光束分离器和发射滤光器。选择滤光器和二向色光束分离器，以与用于标记试样的荧光团的光谱激发和发射特性相匹配。在用的大多数荧光显微镜都是落射荧光显微镜，其中荧光团的激发和荧光的检测都是通过同一物镜进行的。这些显微镜被广泛用于生物学和医学。
[0003]为了在荧光显微镜系统中获得高质量的图像，聚焦是至关重要的因素。按照惯例，显微镜聚焦算法依赖于图像本身。检查在不同焦平面的一系列图像，并且选择具有最大量细节的图像正确聚焦。例如，聚焦系统在估计焦点位置周围获取一系列图像。对于每个图像，该系统记录它的位置，并计算出表征各个图像锐度的聚焦得分。最后，该系统计算聚焦得分最大的位置，并选取计算的位置作为焦点位置。
[0004]US7，141，773提供了 一种成像装置，具有用于获得聚焦图像的自动对焦机制。该装置包括:物镜、用于改变物镜和样品之间距离的聚焦控制器、用于在样品内寻找所关心目标的目标取景器、和测量由此确定的所关心目标的光强度等级的光强度测量单元。聚焦控制改变了样品-物镜距离，以使测量的光强度等级最大，从而到达焦点位置。所关心目标可通过过滤出大目标和可选地通过遮住背景区域来确定。
[0005]W02007138369公开了一种用于数字化处理显微镜载片上具有突光目标点的试样的方法和荧光成像系统。该方法使用该荧光显微镜系统，用于检测和扫描荧光目标点，并包括步骤:通过可视标记工具标记载片上试样的位置，以定义包含试样和荧光目标点的试样区；以第一光学放大倍率捕获包含试样区的至少一部分载片的明视场图像，并由可视标记工具确定落在试样区内的目标视场的位置；和用比第一光学放大倍率高的第二光学放大倍率扫描试样区的目标视场，其中扫描包括至少聚焦在一部分目标视场上。
[0006]上述现有技术使用基于荧光的聚焦法，其能够高精度聚焦。然而，低荧光强度需要长时间曝光以获得具有高信噪比的图像，因此基于多图像比较的焦点搜索很慢。此外，远离焦平面荧光强度迅速降低，从而使远离焦平面启动焦点搜索变困难。对焦时间长，需要持续的激发，这可能会导致光漂白。聚焦慢对于扫描宽视场荧光显微应用问题尤其严重。最终，当聚焦花费时间太多时，系统速度变低。
[0007]为了缩短聚焦时间和避免光漂白，也可以使用非荧光进行对焦。如卤素灯泡的附加光源与荧光显微镜集成在一起，用于聚焦。大多数情况下，为了获得高质量的聚焦，需要使用其他的光学技术，如相衬(PC)和微分干涉差(DIC)。
[0008]相衬是光学显微镜技术，其将穿过透明试样的光的相移转变成图像中的亮度变化。相移本身是看不见的，但当显示为亮度变化时就成为可见的了。在相衬显微镜法中使相变可见的基本原理是从试样散射光分离照明背景光，这弥补了前景细节，并不同地操纵它们。为了执行这样的技术，需使用专用光学器件，像相衬环、聚光器和相移片。
[0009]微分干涉差显微镜法也是一种用于增强纯净、透明样品的对比的光学显微镜照明技术。DIC以干涉测量原理工作，以获得关于样品的光学路径长度的信息，以看到否则不可见的特征。DIC通过将偏振光源分离成两个相互正交偏振的相干部分，它们在样品表面上空间移位(切变)，并在观察前重组。偏振器、DIC棱镜、聚光器、分析仪是实现DIC技术必需的。
[0010]US5, 790, 710教导了一种用于突光显微镜的相衬自动对焦。
[0011]US6，674，574提供了一种用于显微镜的聚焦系统，包括:物镜；样品台；用于产生来自样品的荧光的反射照明系统；传播照明系统，用于样品上照明光以捕捉传播的光学图像；一组光学元件，用来依据包含在通过样品传播的光的相位信息，形成传播的光学图像；用来使荧光图像和传播的光学图像分开的光学元件；用于捕捉由用于分开光的光学元件所分开的传播的光学图像的传感器；用来依据从该传感器输出的信号，检测传播的光学图像的聚焦等级的聚焦检测部分；和驱动器，依据聚焦等级，用于将物镜和载物台的至少一个移动以聚焦到样品。
[0012]US5, 790，710和US6，674，574都是使用基于非荧光的对焦方法。它们具有对焦速度快的优势。然而，它们的缺点是，所有荧光通道仅提供一个焦点，显微镜的结构复杂，且需要相当多的专用光学设备。
[0013]因此，对于荧光显微镜的聚焦装置和方法，尤其是宽视场扫描荧光显微镜应用，像整体载片成像和数字病理学，有一个未满足的需求，需要提供简单结构下快速对焦，且不使用太多的专用光学设备。
【发明内容】
[0014]因此，所要求保护的发明是提供一种用于荧光显微镜的聚焦装置和方法，其能够减少聚焦时间。
[0015]本发明的第一个方面是提供一种用于荧光显微镜中聚焦的装置。
[0016]根据所要求保护的发明的第一实施例，一种用于荧光显微镜的聚焦装置，包括:激发光源，用于发射激发光以激发样品；光束分离器，用于通过物镜向样品反射激发光，并透射由样品发出的荧光；和聚焦模块，其位于激发光源和光束分离器之间，其中聚焦模块包括用于光反射的反射光学器件和聚焦成像相机，其中反射光学器件位于激发光源和光束分离器之间的激发光的通路中；其中样品向光束分离器反射、向后散射、或者反射和向后散射第一部分激发光，并且光束分离器向反射光学器件反射第一部分激发光，且反射光学器件向聚焦成像相机反射第二部分激发光；和其中被聚焦成像相机捕获的第二部分激发光形成用于聚焦荧光成像的样品的至少一个激发光图像。
[0017]根据所要求保护的发明的第二实施例，一种用于荧光显微镜的聚焦装置，包括:激发光源，用于发射激发光以激发样品；光束分离器，用于通过物镜向样品反射激发光，并透射由样品发出的荧光；和聚焦模块，位于样品下面，其中聚焦模块包括用于会聚光的会聚透镜和聚焦成像相机，其中会聚透镜位于样品和聚焦成像相机之间；其中一部分激发光透射通过样品，并且这部分激发光向会聚透镜传播，并通过会聚透镜向聚焦成像相机会聚；以及其中被聚焦成像相机捕获的第二部分激发光形成用于聚焦荧光成像的样品的至少一个激发光图像。
[0018]本发明的第二方面是提供一种用于荧光显微镜中聚焦的方法。
[0019]根据所要求保护的发明的一个实施例，用于荧光显微镜的聚焦方法，包括:通过物镜发出激发光用来照射样品，其中激发光被光束分离器朝向样品反射；通过样品向光束分离器反射、向后散射、或者反射和向后散射第一部分激发光，通过光束分离器向反射光学器件反射第一部分激发光，和通过反射光学器件向聚焦成像相机反射第二部分激发光；并且通过用来聚焦荧光图像的聚焦成像相机，用第二部分激发光形成至少一个激发光图像。
[0020]根据所要求保护的发明的另一个实施例，用于荧光显微镜的聚焦方法，包括:通过物镜发出激发光，用来照射样品，其中激发光被光束分离器朝向样品反射；一部分激发光透射通过样品，并向聚焦成像相机会聚这部分激发光；和由用来聚焦荧光图像的聚焦成像相机用这部分激发光形成至少一个激发光图像。
[0021]由于使用了一部分激发光来聚焦，与传统基于荧光的聚焦系统相比，在为了聚焦形成详细图像时这部分激发光携带高得多的强度，从而能够在短期间内准确聚焦，并避免了不希望的光漂白。
[0022]与传统的基于非荧光的聚焦系统不同，本发明的荧光显微镜只需要一个光源。此夕卜，不需要如PC或DIC的专用光学系统，并且荧光不受专用光学系统和用于聚焦的非荧光的任何干扰。
[0023]更重要的是，本发明的聚焦装置是能够同时执行多路聚焦和预聚焦，而基于荧光和非荧光的聚焦系统都不能这样做。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]在下文中，参考附图，更详细地描述本发明的实施例，其中
[0025]图1示出了根据所要求保护的发明的第一实施例的具有在反射和/或向后散射模式下利用一部分激发光的聚焦装置的荧光显微镜的示意图；
[0026]图2示出了根据所要求保护的发明的第二实施例的具有在反射和/或向后散射模式下利用一部分激发光的聚焦装置的荧光显微镜的示意图；
[0027]图3是示出根据所要求保护的发明的实施例的在反射和/或向后散射模式下利用一部分激发光的荧光显微镜的聚焦方法的步骤的流程图；
[0028]图4示出了根据所要求保护的发明的实施例的具有在透射模式下利用一部分激发光的聚焦装置的荧光显微镜的示意图；
[0029]图5是示出根据所要求保护的发明的实施例的在透射模式下利用一部分激发光的荧光显微镜的聚焦方法的步骤的流程图；
[0030]图6是示出根据所要求保护的发明的实施例的通过改变透镜与样品距离的聚焦方法的步骤的流程图；
[0031]图7是示出根据所要求保护的发明的实施例的扫描荧光显微镜的预聚焦方法的步骤的流程图；
[0032]图8A是根据所要求保护的发明的实施例的由一部分激发光获得的样品的激发光图像；和[0033]图SB是由荧光获得的样品的荧光图像。
【具体实施方式】
[0034]在下面的描述中，作为优选实例列出了荧光显微镜的聚焦装置和方法。对于本领域的技术人员来说很显然，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以进行一些修改，包括添加和/或替换。具体的细节会被省略，免得使本发明不明显；然而，其公开内容被写入，以使本领域技术人员实践本文的教导，而无需过多的实验。
[0035]图1示出了根据所要求保护的发明的第一实施例的具有在反射和/或向后散射模式下利用一部分激发光的聚焦装置的荧光显微镜的示意图。该荧光显微镜包括:激发光源
1、聚焦模块2a、聚光透镜3、激发滤光器4、二向色光束分离器5、物镜6、样品7、载物台8、发射滤光器9、镜筒透镜10和突光成像相机11。聚焦模块2a位于激发光源I和聚光透镜3之间，并且包括光束分离器12和聚焦成像相机13。光束分离器12位于激发光源I和聚光透镜3之间的激发光通路上，并且聚焦成像相机13位于光束分离器12的顶上。
[0036]激发光源I可以是汞弧灯、氙弧灯、激光器或发光二极管，其发射具有特定波长的用来照射样品7的激发光。样品7含有荧光染料，且当被照射时会发出荧光。聚焦模块2a用来确定用于荧光成像的样品7的焦平面。焦平面是样品表面位置在荧光成像相机上形成焦点对准图像的平面。聚光透镜3用于会聚来自激发光源I的激发光。激发滤光片4是用来选择具有特定频带波长的激发光通过。二向色光束分离器5用来反射激发光，并透射从样品7发射的荧光。载物台8是用来存放样品7。物镜6用来将激发光聚焦到样品7上，并聚集发射的荧光和反射/向后散射的激发光。发射滤光器9用于过滤掉影响荧光成像的任何光噪声信号。镜筒透镜10,用于将突光会聚到突光成像相机上。突光成像相机11用于形成荧光图像，并包括用于捕获来自样品7的荧光的光传感器。优选地，荧光成像相机11是电荷耦合器件(CCD)相机。光束分离器12可将光束分离成两个，包括透射光束和反射光束。利用不同的光束分离器12可以调整被透射和反射的光的量。聚焦成像相机13用来形成样品的激发光图像，用于荧光成像的聚焦，并包括光传感器，用于捕获被样品7反射和/或向后散射的任何部分的激发光。激发光图像由这部分激发光形成。
[0037]激发光经过光束分离器12、聚光透镜3和激发滤光器4，然后到达二向色光束分离器5。然后激发光被二向色光束分离器5反射,通过物镜6,最后会聚在样品7上。箭头101示出了激发光的路径。
[0038]在激发光照射样品7之后,第一部分激发光被样品7反射和/或向后散射，并被物镜6和二向色光束分离器5收集。二向色光束分离器5朝向激发滤光器4、聚光透镜3、之后光束分离器12反射第一部分激发光。光束分离器12朝向聚焦成像相机13反射第二部分激发光，以形成用于荧光成像聚焦的激发光图像。因此，第二部分激发光是第一部分激发光的一部分。箭头102a和102b分别示出了第一和第二部分激发光的路径。
[0039]根据所要求保护的发明的各种实施例，光束分离器12可以被任何如下反射光学器件替换:能够朝向聚焦成像相机13完全或部分反射第一部分激发光同时在透射期间最小化来自激发光源I的激发光强度的减小。
[0040]根据所要求保护的发明的另一个实施例，光束分离器12可以被能够朝向聚焦成像相机13全反射第一部分激发光的反射镜替换。因此，第二部分激发光与第一部分激发光是相同的。优选，反射镜比定位反射镜的激发光路径的横截面小，使得激发光的透射不受很大影响。
[0041]在激发光的照射下，样品7发射波长比激发光长的荧光。荧光通过物镜6、二向色光束分离器5、发射滤光器9和镜筒透镜10，并最终到达用于形成荧光图像的荧光成像相机
11。箭头103示出了荧光的路径。
[0042]使用聚焦成像相机13以用第二部分激发光形成样品7的激发光图像。当第二部分激发光的强度远高于荧光的强度时，甚至在某些情况下有几个数量级的区别，样品的激发光图像也可以在短时间内形成，因为大大减少了存储用于成像的足够量的光的时间。然后，所形成的激发光图像进一步用于找出样品用于荧光成像的焦平面。
[0043]与使用荧光聚焦的传统方法相比，本发明能够缩短聚焦时间，从而根本上提高了系统的速度，并避免了不希望的荧光光漂白。另外，与基于非荧光的聚焦方法相比，本发明的荧光显微镜的体系结构要简单得多，因为只需要一个光源，并且也没有用于PC或DIC的专用光学设备。更重要的是，由于本发明中不需要专用光学设备，可避免荧光被光路中的专用光学器件干涉。并且由于简单的系统架构，避免了用来聚焦和成像的PC/DIC和荧光组合显微镜中的复杂的信号同步和机械运动控制。
[0044]图2示出了根据所要求保护的发明的第二实施例的具有在反射和/或向后散射模式下利用一部分激发光的聚焦装置的荧光显微镜的示意图。该荧光显微镜包括激发光源1、聚焦模块2b、聚光透镜3、激发滤光器4、二向色光束分离器5、物镜6、样品7、载物台8、发射滤光器9、镜筒透镜10和突光成像相机11。聚焦模块2b位于聚光透镜3和激发滤光器4之间，并包括光束分离器12、镜筒透镜10’和聚焦成像相机13。光束分离器12位于聚光透镜3和激发滤光器4之间的激发光的路径中，并且镜筒透镜10，位于光束分离器12和聚焦成像相机13之间。
[0045]镜筒透镜10凋来将这部分激发光会聚到聚焦成像相机13上。与第一实施例相t匕，虽然需要额外的镜筒透镜，但是由于通过聚焦成像相机13形成激发光图像不再由聚光透镜3支配，主要功能是向激发滤光器4和二向色光束分离器5聚焦激发光，所以这种配置增强了光学设计的灵活性。因此，在聚焦模块2b的光学设计中能够提供更高的自由度，如本实施例中聚焦模块2的大小和覆盖的样品面积。
[0046]根据所要求保护的方法的各种实施例，光束分离器12可以由任何如下反射光学器件替换:能够朝向聚焦成像相机13完全或部分反射第一部分激发光同时最小化来自激发光源I的激发光强度的减小。
[0047]根据所要求保护的发明的另一个实施例，光束分离器12可以被能够朝向聚焦成像相机13全反射第一部分激发光的反射镜替换。因此，第二部分激发光与第一部分激发光是相同的。优选，反射镜比定位反射镜的激发光路径的横截面小，使得激发光的透射不受很大影响。
[0048]图3是根据所要求保护的发明的实施例的在反射和/或向后散射模式下利用一部分激发光的荧光显微镜的聚焦方法的步骤的流程图。在步骤301中，激发光通过聚焦模块和聚光透镜，从激发光源朝向二向色光束分离器发射。聚焦模块包括:反射光学器件和聚焦成像相机，且反射光学器件位于激发光源和二向色光束分离器之间的激发光的通路中。在步骤302中，激发光通过物镜被二向色光束分离器朝向涂有荧光材料的样品反射。在步骤303中，第一部分激发光通过物镜被样品向着二向色光束分离器反射和/或向后散射。在步骤304中，第一部分激发光被二向色光束分离器朝向反射光学器件反射。在步骤305中，第二部分激发光被反射光学器件朝向聚焦成像相机反射。第二部分激发光是第一部分激发光的一部分，或者与第一部分激发光相同。在步骤306中，样品的激发光图像是用第二部分激发光通过聚焦成像相机形成的。在步骤307中，依据形成的激发光的图像，确定用于荧光成像的样品的焦平面。
[0049]图4示出了根据所要求保护的发明的实施例的具有在透射模式下利用一部分激发光的聚焦装置的荧光显微镜的示意图。荧光显微镜包括激发光源1、聚焦模块2c、聚光透镜3、激发滤光器4、二向色光束分离器5、物镜6、样品7、载物台8、发射滤光器9、镜筒透镜10和荧光成像相机11。聚焦模块2c位于载物台8下方，并包括会聚透镜14和聚焦成像相机13。会聚透镜14位于载物台8和焦点成像摄像机13之间，并且在这部分激发光的路径中，用来将这部分激发光会聚到聚焦成像相机13上。
[0050]在样品7被来自激发光源I的激发光照射期间，一部分激发光透射通过样品7。这部分激发光通过包含用于光透射的通孔的载物台8，到达会聚透镜14，然后通过会聚透镜14被聚焦在成像相机13上。优选，会聚透镜14是长工作距离的物镜，低倍率的物镜或形成高精度图像的透镜组。箭头104示出了这部分激发光的路径。
[0051]同样地，在透射模式下的这部分激发光用于通过聚焦成像相机13形成样品7的激发光图像。当这部分激发光的强度远高于荧光的强度时，就会大大缩短聚焦曝光时间。
[0052]图5是根据所要求保护的发明的实施例的在透射模式下利用一部分激发光的荧光显微镜的聚焦方法的步骤的流程图。在步骤501中，激发光从激发光源通过聚光透镜向二向色光束分离器发射。在步骤502中，激发光，通过物镜，被二向色光束分离器朝向涂有荧光材料的样品反射。在步骤503中，一部分激发光通过样品透射朝向聚焦模块。该聚焦模块包括会聚透镜和聚焦成像相机，会聚透镜位于样品和聚焦成像相机之间。在步骤504中，这部分激发光被会聚透镜朝向聚焦成像相机会聚。在步骤505中，通过聚焦成像相机，用这部分激发光形成样品的激发光图像。在步骤506中，依据形成的激发光图像，确定样品的焦平面，用于荧光成像。
[0053]根据本发明的一个实施例，为了确定样品的焦平面，该荧光显微镜还包括中央处理单元CPU。该CPU，与聚焦成像相机、载物台和荧光成像相机相连接，用于分析由聚焦成像相机拍摄的激发光图像，确定荧光图像是否在焦平面上，通过移动载物台调节透镜与样品的距离，并且一旦样品焦点对准，就指示荧光相机拍摄荧光图像。
[0054]图6是示出根据所要求保护的发明的实施例的通过改变透镜与样品距离的聚焦方法的步骤的流程图。在步骤601中，聚焦成像相机拍摄由一部分激发光形成的样品的激发光图像。在步骤602中，检查激发光图像，样品是否在用于荧光成像的焦平面上。如果没有在焦平面上，则在步骤603中改变透镜与样品的距离，并重复步骤601至602。如果在焦平面上，则在步骤604中由荧光图像相机拍摄荧光图像。优选，通过由马达控制的载物台的线性运动，改变透镜与样品的距离。
[0055]由于聚焦成像相机的视场与荧光成像相机的视场不同，本发明的荧光显微镜能够进行预聚焦，其是在视场上拍摄荧光图像期间也可以进行下一个视场上的聚焦的聚焦方法。由于拍摄荧光图像和聚焦是并行发生的，所以预聚焦能够进一步减少荧光成像时间。[0056]图7是示出根据所要求保护的发明的实施例的扫描荧光显微镜的预聚焦方法的步骤的流程图。在步骤701中，由激发光照射样品，并且利用来自样品的荧光，通过荧光成像相机在第i个视场上拍摄荧光图像。在步骤702中，用一部分激发光，通过聚焦成像相机在第i+Ι个视场上拍摄激发光图像。在步骤703中，依据激发光图像，确定第i+Ι个视场的焦平面。在步骤704中，用在步骤703中确定的焦平面，在第i+Ι个视场上拍摄荧光图像。
[0057]传统的基于荧光的聚焦不能执行预聚焦，因为只有一个成像相机用于荧光成像和聚焦成像，而这两个任务不能由单个相机同时进X行。另一方面，虽然基于非荧光的聚焦能够执行预聚焦，但是荧光成像质量经常恶化，因为在同一光通路中有来自两个不同光源的两束光，从而会导致两个光束之间的干扰。相反，本发明的预聚焦避免了上述问题，因为只使用一个光源。
[0058]本发明能够进行多路聚焦，这用来找到不同荧光激发和发射信道的样品的焦平面。根据本发明的一个实施例，一个以上的激发滤光器、二向色光束分离器和发射滤光器用于形成各种滤光组合光学块。该滤光的组合光学块可以进一步被配置形成滤光块转台，它可以在荧光显微镜下旋转，以改变用于样品照射的不同波段的激发光。因此，基于非荧光的聚焦方法，如PC或DIC，无法进行多路聚焦，因为仅一个聚焦光源不能适应不同波段的频率变化的激发光。与此相反，本发明能够在改变用于荧光的激发光的同时改变用于聚焦的光。
[0059]图8A是根据所要求保护的发明的实施例的由一部分激发光获得的样品的激发光图像。图8B是由荧光获得的样品的图像。虽然图8A的激发光图像的曝光时间比图SB短，但是图8A比图SB更亮，这意味着通过使用这部分激发光接收到了更多的光用于成像。
[0060]根据所要求保护的发明的一个实施例，当激光器或LED作为激发光源时，由于LED能够提供特定波段，所以可能并不需要激发滤光器。
[0061]根据所要求保护的发明的一个实施例，聚焦模块中由光束分离器进行的透射与反射的比率为80至20。
[0062]根据所要求保护的发明的一个实施例，激发滤光器可以作为分离的滤光器改变设备(滤光器轮或滤光器滑块)远离滤光器转台放置。并且这样的分离的滤光器改变设备可以放置在激发光源和聚焦模块之间。
[0063]这里公开的实施例可以用通用或专用计算设备、计算机处理器或电子电路来实现，包括但不限于数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)和根据本公开的教导配置或编程的其它可编程逻辑器件。运行在通用或专用计算设备、计算机处理器或可编程逻辑器件中的计算机指令或者软件代码，可以依据本公开的教导容易地由软件或电子技术的从业技术人员来准备。
[0064]在一些实施例中，本发明包括具有计算机指令或软件代码存储于其中的计算机存储介质，其可用于编程计算机或微处理器，以执行本发明的任何处理。存储介质可包括，但并不限于:软盘、光盘、蓝光光盘、DVD、CD-ROM、磁光盘、ROM、RAM、闪存设备或适用于存储指令、代码和/或数据的任何类型的媒质或装置。
[0065]为了说明和描述的目的，已经提供了本发明的前文的描述。它的目的不是穷举或将本发明限定为所公开的精确形式。对于本领域从业技术人员来说，显然可以进行许多修改和变化。
[0066]为了最好地解释本发明的原理及其实际应用，选择和描述了这些实施例，从而对于各种实施例及适合于特定预期用途的各种修改，能使本领域技术人员理解本发明。目的是，本发明的范围由所附权利要求和它们的等效物来定义。
【权利要求】
1.一种用于荧光显微镜的聚焦装置，包括: 激发光源，用于发射激发光以激发样品； 第一光束分离器，用于通过物镜向样品反射激发光，并透射由样品发出的荧光；和聚焦模块，位于激发光源和第一光束分离器之间，其中聚焦模块包括用于光反射的反射光学器件和聚焦成像相机，其中反射光学器件位于激发光源和第一光束分离器之间的激发光的通路中； 其中样品向第一光束分离器反射、向后散射、或者反射和向后散射第一部分激发光，并且第一光束分离器向反射光学器件反射第一部分激发光，且反射光学器件向聚焦成像相机反射第二部分激发光；和 其中被聚焦成像相机捕获的第二部分激发光形成用于聚焦荧光成像的样品的至少一个激发光图像。
2.根据权利要求1所述的聚焦装置，其中反射光学器件是第二光束分离器，并且第二部分激发光是第一部分激发光的一部分。
3.根据权利要求1所述的聚焦装置，其中反射光学器件是反射镜，且第二部分激发光与第一部分激发光相同。
4.根据权利要求1所述的聚焦装置，进一步包括: 位于第一光束分离器和反射光学器件之间的聚光透镜。
5.根据权利要求1所述的聚焦装置，进一步包括: 位于激发光源和反射光学器件之间的聚光透镜。
6.根据权利要求5所述的聚焦装置，其中聚焦模块还包括位于反射光学器件和聚焦成像相机之间的镜筒透镜。
7.根据权利要求1所述的聚焦装置，进一步包括: 位于激发光源和第一光束分离器之间的激发滤光器。
8.根据权利要求7所述的聚焦装置，进一步包括: 多于一个激发滤光器和多于一个第一光束分离器，以形成多于一个过滤器组合光学块，以进行多路聚焦。
9.根据权利要求1所述的聚焦装置，进一步包括: 中央处理单元，用于根据激发光图像确定荧光图像的焦平面。
10.一种用于荧光显微镜的聚焦装置，包括: 激发光源，用于发射激发光以激发样品； 光束分离器，用于通过第一物镜向样品反射激发光，并透射由样品发出的荧光；和位于样品下方的聚焦模块，其中聚焦模块包括用于会聚光的会聚透镜和聚焦成像相机，其中会聚透镜位于样品和聚焦成像相机之间； 其中一部分激发光透射通过样品，并且这部分激发光向会聚透镜传播，并通过会聚透镜向聚焦成像相机会聚；以及 其中被聚焦成像相机捕获的这部分激发光形成用于聚焦荧光成像的样品的至少一个激发光图像。
11.根据权利要求10所述的聚焦装置，其中会聚透镜是第二物镜。
12.根据权利要求10所述的聚焦装置，进一步包括:位于激发光源和光束分离器之间的激发滤光器。
13.根据权利要求12所述的聚焦装置，进一步包括: 多于一个激发滤光器和多于一个光束分离器，以形成多于一个过滤器组合光学块，进行多路聚焦。
14.根据权利要求10所述的聚焦装置，进一步包括: 中央处理单元，用于依据激发光图像确定荧光图像的焦平面。
15.一种用于荧光显微镜的聚焦方法，包括: 通过物镜发出激发光，用来照射样品，其中激发光被第一光束分离器朝向样品反射； 执行下面的任一个: 通过样品向第一光束分离器反射、向后散射、或者反射和向后散射第一部分激发光，通过第一光束分离器向反射光学器件反射第一部分激发光，和通过反射光学器件向聚焦成像相机反射第二部分激发光；或者 将第三部分激发光透射通过样品，并向聚焦成像相机会聚第三部分激发光；和 由用来聚焦荧光图像的聚焦成像相机用第二部分激发光或第三部分激发光形成至少一个激发光图像。
16.根据权利要求15所述的聚焦方法，进一步包括: 改变物镜和样品之间的距离，并重复上述步骤，直到确定了用于荧光成像的样品的焦平面。
17.根据权利要求15所述的聚焦方法，进一步包括: 经由第一光束分离器向突光成像相机透射从样品发射的突光，用于形成至少一个突光图像。
18.根据权利要求15所述的聚焦方法，进一步包括: 与形成激发光图像的步骤同时，通过荧光成像相机捕捉具有从样品发出的荧光的至少一个荧光图像，以进行预聚焦，其中荧光图像的视场与激发光图像的视场是不同的。
19.根据权利要求15所述的聚焦方法，其中反射光学器件是第二光束分离器，并且第二部分激发光是第一部分激发光的一部分。
20.根据权利要求15所述的聚焦方法，其中反射光学器件是反射镜，并且第二部分激发光与第一部分激发光相同。
【文档编号】G01N21/64GK103513411SQ201310450223
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】吴晓华 申请人:香港应用科技研究院有限公司