一种石斛炮制方法及其工艺筛选方法
【专利摘要】本发明提供一种石斛炮制方法及其工艺筛选方法，其特征在于包括酒润和蒸制步骤，提取的有效成分含量高，石斛碱含量可达0.303%，多糖含量可达到12.3%。工艺筛选方法精度高、准确度高、可考察各因素之间交互作用。
【专利说明】一种石斛炮制方法及其工艺筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药材的炮制方法，特别涉及石斛的炮制方法以及炮制工艺筛选方法。技术背景
[0002]石斛始载于《神农本草经》，列为上品，具有“益胃生津，滋阴清热”的功能。《中华人民共和国药典》2010年版一部所载的干品石斛炮制方法为“除去残根，洗净，切段，干燥”。《四川省中药饮片炮制规范》和《重庆市中药饮片炮制规范及标准》中石斛炮制方法都与药典相同。
[0003]石斛中主要含生物碱及多糖类成分，生物碱水溶性不好，不易提取。传统炮制多以个人经验操作为主，炮制品的质量取决于操作者的个人主观判断，容易造成炮制品质量不稳定的现象。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种石斛炮制方法，提取的有效成分，如石斛碱、石斛多糖 的含量高。
[0005]本发明的目的是通过以下措施实现的:
[0006]一种石斛炮制方法，包括酒润和蒸制步骤。酒润是指用乙醇溶液浸润石斛，蒸制是指用水蒸汽加热或隔水加热石斛。
[0007]上述酒润步骤中，乙醇溶液质量浓度为45-50%，乙醇溶液与石斛的重量比为15-20:100 ;蒸制的时间为6-8小时。优选地，上述乙醇质量浓度为48%，乙醇溶液与石斛的重量比为17:100，蒸制时间为6.78小时。
[0008]上述石斛炮制方法，包括以下步骤:取净石斛段加入45-50%乙醇溶液进行酒润，乙醇与石斛的重量比为15-20:100，密闭闷润1-1.5h使药材内断面湿润度均匀，水蒸汽加热蒸制6-8小时，取出，晾干。
[0009]具体地，上述石斛炮制方法，包括以下步骤:
[0010](I)取石斛茎除去残根，洗净，切段呈圆柱形或扁圆柱形的段，长度5-10mm，80摄氏度干燥2-3h ；
[0011](2)酒润:将步骤I得到的石斛置于容器内，加入48%的乙醇溶液拌匀，密闭闷润1-1.5h，乙醇溶液徐徐渗透到石斛组织内部，并全部被药材吸尽为度，使切开后的石斛断面保持均一的湿润度，达到内外湿润度一致；
[0012](3)蒸制:将酒润后的石斛段装入不锈钢蒸锅或瓷罐内，水蒸汽加热6.78小时，取出，晾干。
[0013]本发明的另一目的在于提供一种精密度高、稳定性好、重复性好的石斛炮制的工艺筛选方法。
[0014]一种石斛酒润蒸制法的工艺筛选方法，采用星点设计-效应面法，其特征在于:自变量为乙醇浓度、乙醇用量、蒸制时间，效应变量为石斛碱含量和石斛多糖含量。[0015]上述石斛酒润蒸制法的工艺筛选方法，包括以下步骤:
[0016]以石斛碱、石斛多糖含量为指标，每个指标均标准化为O~I之间的“归一值”，各指标“归一值”求算几何平均数，得到总评“归一值”。公式为:0D=(dld2…dk)l/k(k为指标数)，由于石斛碱及石斛多糖含量均为越大越好，所以采用Hassan方法进行数学转换求“归一值”，公式为:dmax= (Y1-Ymin) / (Ymax-Ymin)。
[0017]使用Design-Expert8.0软件对实验数据进行拟合，方程为0D=5.46-15.9A-16.5B-0.615C+21.1AB+1.01AC+0.452BC+10.9A2+27.3B2+0.0226C2 (R2=0.8257ρ=0.0076)。根据响
应曲面分析绘出各因变量的曲面图，见图2~图4。
[0018]效应面分析得知，随着蒸制时间的增加OD值显著升高，酒浓度与酒用量对于OD值影响并不太显著，综合考虑确定最佳炮制工艺为:酒浓度48%、酒用量17%、蒸制时间6.78h。使用最佳工艺进行三次验证实验，石斛碱平均值为0.303，预测值为0.292。相对偏差3.76%。多糖平均值12.3，预测值11.8。相对偏差4.24%。表明所建立的模型有较好的预测性。
[0019]有益效果
[0020]1.本发明的石斛炮制方法,提取的有效成分含量闻，石斛碱含量可达0.303%,多糖含量可达到12.3%。
[0021]2.本发明的石斛炮制方法，操作简单，步骤、参数、结果易控可量化，质量稳定，适合大规模的产业应用，且产物纯净，无杂质，药物品质优异。
[0022]3.本发明的工艺筛选方法，对于石斛炮制过程中的关系参数进行考察，量化了几个关键的参数，为石斛炮制品的标准操作流程的建立提供了依据。本实验所采用的星点设计能很好的弥补正交设计及均匀设计中试验精度不够、最佳工艺条件不准确、各因素之间交互作用无法考察等问题。优选出的最佳工艺量化了炮制过程中主要的影响因素，最佳工艺条件下的预测值与实测值偏差较小。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1实施例4的2.1.1中对照品及样品HPLC色谱图；A.对照品，B.样品。
[0024]图2实施例4中A和B对OD值的效应面图
[0025]图3实施例4中A和C对OD值的效应面图
[0026]图4实施例4中B和C对OD值的效应面图
【具体实施方式】
[0027]下面通过实施例的方式进一步说明本发明方法进行具体描述，有必要指出的是，以下实例只是对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述
【发明内容】
对本发明作一些非本质的改进和调整。
[0028]实施例1
[0029]石斛炮制方法，包括以下步骤:
[0030]1.取石斛茎除去残根，洗净，切段呈圆柱形或扁圆柱形的段，长度5mm，80摄氏度干燥2h ；
[0031]2.酒润:将切制后的石斛，置容器内，加入50%的乙醇溶液拌匀，乙醇溶液与石斛的重量比为15:100，密闭闷润lh，乙醇溶液徐徐渗透到石斛组织内部，使切开后的石斛断面保持均一的湿润度，达到内外湿度一致。
[0032]3.蒸制:将酒润后的石斛装入瓷罐内，水蒸汽加热6小时，取出，晾干。
[0033]提取的有效成分含量高，石斛碱含量0.256%，多糖含量11.05%，无杂质残留。
[0034]实施例2[0035]石斛炮制方法，包括以下步骤:
[0036]1.取石斛茎除去残根，洗净，切段呈圆柱形或扁圆柱形的段，长度10mm，80摄氏度干燥3h ；
[0037]2.酒润:将净制或切制后的石斛，置容器内，加入45%的乙醇溶液拌匀，乙醇溶液与石斛的重量比为20:100，密闭闷润1.5h，乙醇溶液徐徐渗透到石斛组织内部，使切开后的石斛断面保持均一的湿润度，达到内外湿度一致。
[0038]3.蒸制:将酒润后的石斛装入不锈钢蒸锅内，水蒸汽加热8小时，取出，晾干。
[0039]提取的有效成分含量高，石斛碱含量可达到0.278%，多糖含量可达到10.18%，无杂质残留。
[0040]实施例3
[0041]石斛炮制方法，包括以下步骤:
[0042]1.取石斛茎除去残根，洗净，切段呈圆柱形或扁圆柱形的段，长度6mm，80摄氏度干燥2.5h ；
[0043]2.酒润:将净制或切制后的石斛，置容器内，加入48%的乙醇溶液拌匀，乙醇溶液与石斛的重量比为17:100，密闭闷制1.2h，乙醇溶液徐徐渗透到石斛组织内部，使切开后的石斛断面保持均一的湿润度，达到内外湿度一致。
[0044]3.蒸制:将酒润后的石斛装入不锈钢蒸锅内，水蒸汽加热6.78小时，取出，晾干。
[0045]提取的有效成分含量高，石斛碱含量可达0.303%，多糖含量可达到12.3%，无杂质残留。
[0046]实施例4
[0047]I仪器与试药
[0048]1.1 仪器
[0049]安捷伦1200型高效液相色谱仪(G1312B 二元泵，G1315C型DAD检测器)、UV-6000紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)、BD61电子天平(德国SART0RIUS公司，感量为0.lmg)，TGL-18C型离心机(上海安亭科学仪器厂)，RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，HH-4型数显恒温水浴锅(金坛市科析仪器有限公司)
[0050]1.2 试药
[0051]对照品:石斛碱(成都曼思特生物科技有限公司，批号:MUST_12030205)，无水葡萄糖(中国药品生物制品检定所，批号:110833-200503)
[0052]药材:购于成都荷花池药材市场，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为兰科植物金钦石斛 Dendrobium nobile Lindl 干燥莖。
[0053]试剂:高效液相色谱使用色谱纯试剂，其余为分析纯试剂。
[0054]2.实验方法
[0055]2.1石斛碱的含量测定[0056]2.1.1色谱条件
[0057]色谱柱Diamonsil钻石二代C18色谱柱(4.6_X 250mm, 5 μ m),流动相乙腈-水(0.1%三乙胺)进行梯度洗脱(O~30min乙腈30~80% ；30~40min乙腈80%) [3]，流速ImL.min-? ;检测波长240nm ;柱温30°C ;进样量10 μ L, HPLC图见图1。
[0058]2.1.2供试品溶液的制备
[0059]取本品粉末(过三号筛)0.5g,精密称定,加2mL氨水浸润30min后加氯仿50mL,称重。回流提取2h，以氯仿补足失重。精密量取续滤液10mL，减压回收溶剂至干，加甲醇溶解，精密转入2mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μ m微孔滤膜过滤，密塞，备用。
[0060]2.1.3标准曲线的制备
[0061]精密称取石斛碱对照品适量，加甲醇制成每Iml含石斛碱0.168mg的溶液。分别吸取2，4，6，8，10，20 μ L，按照2.2.2色谱条件进行HPLC分析，以峰面积和进样量进行线性回归，得石斛碱线性方程分别为:Υ=0.0008Χ-0.213(R2=0.9998);线性范围为0.336~
3.36 μ g0
[0062]2.1.4精密度试验取石斛样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，石斛碱峰面积的RSD(n=6)为1.24%。
[0063]2.1.5稳定性试验
[0064]取石斛样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12h进样测定，石斛碱峰面积的RSD (n=6)·为1.63%。
[0065]2.1.6重复性试验
[0066]精密称取石斛样品0.5g6份按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液后进样测定，石斛碱含量RSD (n=6)为1.06%ο
[0067]2.1.7加样回收率试验精密称取已测知含量的石斛样品粉末0.5g，平行6份，加入石斛碱对照品溶液适量，按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，进样测定。计算得石斛碱平均回收率(η=6)为 97.62%, RSD 为 1.45%。
[0068]2.2石斛多糖含量测定
[0069]2.2.1供试品的制备
[0070]取石斛粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，加水200mL，加热回流2h，放冷，转移至250ml量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，置离心管中，精密加入无水乙醇50ml，摇匀，冷藏lh，取出，离心(转速为每分钟4000转)20分钟，弃去上清液，沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次40ml，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25ml量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。
[0071]2.2.2标准曲线的制备
[0072]精密称取无水葡萄糖对照品适量，加蒸馏水制成ImL含无水葡萄糖0.1016mg的溶液。精密量取对照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8、1.0mL，分别置IOmL具塞试管中，各加水补至
1.0mL，精密加入5%苯酚溶液lmL(临用配制)，摇匀，再精密加硫酸5mL，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，置冰浴中冷却5min，以相应试剂为空白，在488nm的波长处测定吸光度，以浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。Y=0.0967X+0.0006 (R2=0.9971)线性范围 0.02032 ~0.1016mg.mL-1。
[0073]2.2.3精密度试验[0074]取石斛供试品溶液1.0mL,按“2.2.2”项下自“精密加入5%苯酚溶液”起连续测定样品溶液吸光度，RSD (n=6)为1.71%。
[0075]2.2.4稳定性试验
[0076]取石斛供试品溶液1.0mL,按“2.2.2”项下自“精密加入5%苯酚溶液”起每隔Ih测定吸光度连续6h，结果吸光度的RSD (n=6)为1.55%。
[0077]2.3.5重复性试验
[0078]精密称取石斛样品0.5g6份，按“2.2.2”项下自“精密加入5%苯酚溶液”起测定多糖含量，多糖含量RSD (n=6)为1.90%。
[0079]2.3.星点设计与数据分析
[0080]2.3.1实验设计
[0081]在结合文献及预实验的基础上，选取在石斛酒润蒸制过程中主要的影响因素A白酒浓度、B白酒用量、C蒸制时间为考察对象具体参数见表1，使用Design Expert8.0软件进行优化。以石斛碱含量Yl、多糖含量Y20D值作为考察指标，结果见表2。
[0082]表1星点设计因素水平表
[0083]
【权利要求】
1.一种石斛炮制方法，其特征在于包括酒润和蒸制步骤。
2.如权利要求1所述的石斛炮制方法，所述酒润是采用质量浓度为45-50%乙醇溶液进行，乙醇溶液与石斛的重量比为15-20:100，所述蒸制的时间为6-8小时。
3.如权利要求1或2所述的石斛炮制方法，所述乙醇质量浓度为48%，乙醇溶液与石斛的重量比为17:100，蒸制时间为6.78小时。
4.如权利要求1所述的石斛炮制方法，包括以下步骤:取净石斛加入45-50%乙醇溶液进行酒润，乙醇与石斛的重量比为15-20:100，密闭闷润1-1.5h使药材内断面湿润度均匀，水蒸汽加热蒸制6-8小时，取出，晾干。
5.如权利要求1所述的石斛炮制方法，包括以下步骤: (1)取石斛茎除去残根，洗净，切段成长度为5-10mm，80摄氏度干燥2_3h； (2)酒润:将步骤I得到的石斛置于容器内，加入48%的乙醇溶液拌匀，密闭闷润1-1.5h，乙醇溶液徐徐渗透到石斛组织内部，使切开后的石斛断面保持均一的湿润度，达到内外湿度一致； (3)蒸制:将酒润后的石斛段装入不锈钢蒸锅或瓷罐内，水蒸汽加热6.78小时，取出，晾干。
6.如权利要求1-5任一所述的石斛炮制方法的工艺筛选方法，采用星点设计-效应面法，其特征在于:自变量为乙醇浓度、乙醇用量、蒸制时间，效应变量为石斛碱含量和石斛多糖含量。
7.如权利要求6所述的石斛炮制方法的工艺筛选方法，，包括以下步骤: 以石斛碱、石斛多糖含量为指标，每个指标均标准化为(Tl之间的“归一值” [6]，各指标“归一值”求算几何平均数，得到总评“归一值”；公式为:OD= (dld2-dk) 1/k (k为指标数)，由于石斛碱及石斛多糖含量均为越大越好，所以采用Hassan方法进行数学转换求“归一值”，公式为:dmax= (Y1-Ymin) / (Ymax-Ymin)； 使用Design-Expert 8.0软件对实验数据进行拟合，方程为0D=5.46-15.9A-16.5B-0? 615C+21.1AB+1.01AC+0.452BC+10.9A2+27.3B2+0.0226C2 (R2=0.8257 p=0.0076);根据响应曲面分析绘出各因变量的曲面图，分析效应面筛选工艺条件。
【文档编号】G01N30/02GK103623240SQ201310450250
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】欧德明 申请人:重庆桐君阁股份有限公司