一种高灵敏度的tmb显色液及其制备方法
【专利摘要】市场上以TMB作为显色底物的显色液多表现出灵敏性不高这一缺点，针对这一缺点本发明提供了一种高灵敏度的TMB显色液及其制备方法。其特征在于，各组分的浓度为：显色液A：三羟甲基氨基甲烷（Tris）为12.11g/L、亚铁氰化钾为1g/L、焦磷酸钠为5g/L、双氧水为1mL/L；显色液B：NaH2PO4·2H2O为2.96g/L、Na2HPO4·12H2O为29g/L、TMB为5g/L、乙二胺四乙酸二钠为1-2g/L、二甲基亚砜为10mL/L、十二烷基二甲基甜菜碱为0.1-1g/L。本发明增益效果是极大的提高了酶联免疫法检测丙型肝炎的灵敏度，具有很重要的实用性。
【专利说明】—种高灵敏度的TMB显色液及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及临床体外检测技术，特别涉及一种高灵敏度的TMB显色液及其制备方法。
【背景技术】
[0002]HCV抗原的主要检测方法有荧光免疫法，酶联免疫法和放射免疫测定法。其中酶联免疫法具有特异性强，操作简单，成本低等优点得到人们的好评，但是普通的HCV感染后一般到抗体转阳有一个较长的窗口期，平均70天，有的患者窗口期可延长至6-9月或更长，窗口期约I %?3%的患者抗HCV可持续阴性，通过现有酶联免疫法配套的显色试剂很难检测出病情，虽然丙肝病毒核酸RNA检测方法能够利用病人基因组的复制出现得很早，感染后数天即出现病毒血症的特点，有助于早期发现丙肝患者，但是，需要较高的设备条件和技术力量，不宜在基层医院推广，费用较高，不太适合普及使用，因此需要探索出一种高灵敏度的酶联免疫显色液以提高使用酶联免疫法检测丙型肝炎的灵敏度。
[0003]TMB (3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺)是一种新型HRP (辣根过氧化物酶)色原底物。相对其他显色底物而言，TMB以显色高效、无毒、不致癌、稳定性好等特点成为ELISA检测的主流显色剂。在ELISA检测时，HRP催化过氧化物释放出氧使TMB被氧化成蓝色的产物，加入酸性的终止液终止反应后，蓝色溶液变成橙黄色，在450nm波长有最大吸收峰。通过测量吸光度，便可定性或定量判断出被检测物的含量，现有的市场上以TMB作为显色底物的显色液多表现出灵敏性不高这一缺点，很难准确检测出处在窗口期的感染HCV的患者，给病人带来很大不便。本发明旨保证常规性能的基础上，提高TMB显色液的显色性能。
【发明内容】
[0004]针对上述技术背景，本发明提供了一种高灵敏度的TMB显色液及其制备方法。
[0005]本发明的一种高灵敏度的TMB显色液，其特征在于，各组分的浓度为:显色液A:三羟甲基氨基甲烷(Tris)为12.llg/L、亚铁氰化钾为lg/L、焦磷酸钠为5g/L、双氧水为ImL/L ;显色液 B =NaH2PO4.2H20 为 1.96g/L、Na2HPO4.12H20 为 29g/L、TMB 为 5g/L、乙二胺四乙酸二钠为l_2g/L、二甲基亚砜为10mL/L、十二烷基二甲基甜菜碱为0.l_lg/L。
[0006]所述的一种高灵敏度的TMB显色液的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
A液:取三羟甲基氨基甲烷(Tris)、亚铁氰化钾和焦磷酸钠，依次在缓慢搅拌条件下溶解于蒸馏水中，再在所述混合液中加入双氧水，搅拌30分钟，待其完全搅拌均匀，放置到2-8 °C环境中储藏。
[0007]B液:取TMB缓慢搅拌溶解于二甲基亚砜中后，将所述混合液缓慢搅拌溶解到蒸馏水中，再依次加入NaH2PO4.2H20,Na2HPO4.12H20、乙二胺四乙酸二钠和十二烷基二甲基甜菜碱，搅拌30分钟，待其完全搅拌均匀，放置到2-8°C环境中储藏。
[0008]本发明的使用方法:
利用丙型肝炎核心抗原检测试剂盒(双抗夹心ELISA)使用本TMB显色液。[0009](I)设定好加样孔，将系列HCV定标品加在HCV试剂盒的包被板上，再加抗HCV单抗-HRP酶结合物，37°C反应I小时后，洗板5次，拍干。
[0010](2)每孔加入显色液A液和B液各50uL，避光37°C显色15min，并用酶标仪验证检测被检测样本的阴阳性。
[0011]相比市场常见两相TMB显色液而言，A液和B液分别采用三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液和磷酸盐缓冲液以保证各自体系的稳定性，并在B液中新加入了添加了在l-2g/L的乙二胺四乙酸二钠和百分比为0.1%_1%十二烷基二甲基甜菜碱两种物质，以促进TMB的显色能力。本发明增益效果是极大的提高了酶联免疫法检测丙型肝炎的灵敏度，具有很重要的实用性。
【具体实施方式】
[0012]实施列I
一种市场上现有的TMB显色配方，其各组分的摩浓度为:
显色液A:
三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.llg/L
亚铁氰化钾lg/L
焦磷酸钠5g/L
双氧水lmL/L 显色液B:
NaH2PO4.2H202.96g/L
Na2HPO4.12H2029g/L
TMB5 g/L
二甲基亚砜lOmL/L 实施例2
本发明所述的一种高灵敏度的TMB显色液，其各组分的浓度为:
显色液A:
三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.llg/L
亚铁氰化钾lg/L
焦磷酸钠5g/L
双氧水lmL/L 显色液B:
NaH2PO4.2H202.96g/L
Na2HPO4.12H2029g/L
TMB5 g/L
二甲基亚砜lOmL/L
乙二胺四乙酸二钠I g/L
十二烷基二甲基甜菜碱0.lg/L
本实施例中所述的一种高灵敏度的TMB显色液的制备方法为:A液取12.1Ig三羟甲基氨基甲烷(Tris)Ug亚铁氰化钾和5g焦磷酸钠，依次在缓慢搅拌条件下溶解于IL蒸馏水中，再在所述混合液中加入ImL双氧水，搅拌30分钟，待其完全搅拌均匀，放置到2-8°C环境中储藏。B液取TMB5g缓慢搅拌溶解于IOmL 二甲基亚砜中后，将所述混合液缓慢搅拌溶解到IL蒸馏水中，再依次加入2.96gNaH2P04.2H20、29gNa2HP04.12H20、2g乙二胺四乙酸二钠和0.1g十二烷基二甲基甜菜碱，搅拌30分钟，待其完全搅拌均匀，放置到2-8°C环境中储藏。
[0013]本实施例描述的是一种灵敏度高的丙型肝炎核心抗原检测试剂(双抗夹心ELISA法)TMB显色检测试剂，并利用丙型肝炎核心抗原检测试剂(双抗夹心ELISA法)对显色底物液进行检测验证。
[0014]具体操作步骤为:选取23个阳性病人样本，将每个样本都按比例稀释成为1:1、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320六个浓度梯度，分别使用PCR技术、一种市场上现有的TMB显色液和含有本实施例中配制的一种高灵敏度的TMB显色液的丙型肝炎核心抗原检测试剂(双抗夹心ELISA法)，三组同步进行检测，比对稀释后的丙型肝炎检出数量(见表1)。
[0015]表1 23个丙型肝炎阳性样本按比例稀释后三种方法阳性检出量
【权利要求】
1.一种高灵敏度的TMB显色液，其特征在于，各组分的浓度为:显色液A:三羟甲基氨基甲烷12.llg/L、亚铁氰化钾lg/L、焦磷酸钠5g/L、双氧水lmL/L ;显色液B =NaH2PO4.2H20为 1.96g/L,Na2HPO4.12H20 为 29g/L、TMB5g/L、乙二胺四乙酸二钠 l_2g/L、二甲基亚砜 IOmL/L、十二烷基二甲基甜菜碱0.1-lg/L。
2.根据权利要求1中的一种高灵敏度的TMB显色液的制备方法，其特征在于包括以下步骤: A液:取Tris、亚铁氰化钾和焦磷酸钠，依次在缓慢搅拌条件下溶解于蒸馏水中，再在所述混合液中加入双氧水，搅拌30分钟，待其完全搅拌均匀，放置到2-8°C环境中储藏； B液:取TMB缓慢搅拌溶解于二甲基亚砜中后，将所述混合液缓慢搅拌溶解到蒸馏水中，再依次加入NaH2PO4.2H20、Na2HPO4.12H20、乙二胺四乙酸二钠和十二烷基二甲基甜菜碱，搅拌30分钟，待其完全搅拌均匀，放置到2-8°C环境中储藏。
【文档编号】G01N33/576GK103712982SQ201310679434
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】谭柏清, 罗维晓, 甘宜梧 申请人:山东博科生物产业有限公司