利用单个粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序的制作方法

利用单个粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序的制作方法
【专利摘要】提供一种在使用了利用共焦显微镜或多光子显微镜的光测量的扫描分子计数法中能够提高其灵敏度和/或S/N比的技术。在本发明的检测样本溶液中的单个粒子的存在的光分析技术中，使光检测区域的位置在样本溶液内移动，测量来自光检测区域的光的强度并生成光强度数据，计算光强度数据上的光强度的时间变化的、假定为在光检测区域内不存在单个粒子的第一状态的情况下的第一产生概率和假定为在光检测区域内存在单个粒子的第二状态的情况下的第二产生概率，根据它们的产生概率检测在光检测区域内单个粒子存在的时间，来检测表示各个单个粒子的存在的信号。
【专利说明】利用单个粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析 用计算机程序

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种光分析技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等 能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测分散或溶解在溶液中的原子、分子 或它们的聚合体（以下将它们称为"粒子"。）、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或 它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子，来获取在分 析或解析它们的状态（相互作用、结合/离解状态等）时有用的信息，更详细地说，涉及一 种能够使用如上所述的光学系统逐个检测由于存在单个粒子而引起的光的变化（单个粒 子发出的光或单个粒子所产生的阴影）并进行各种光分析的光分析装置、光分析方法以及 光分析用计算机程序。此外，在本说明书中，所检测的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物 发光、散射光等。发光的粒子（以下称为"发光粒子"。）可以是其自身发光的粒子、或附加 了任意的发光标识或发光探针的粒子。

【背景技术】
[0002] 由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子 计数（单光子检测）的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水 平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光测量技术对生物体分子等的特性、分子 间相互作用、或结合/离解反应进行检测的光分析技术。作为这样的光分析技术，例如已 知有突光相关光谱分析（Fluorescence Correlation Spectroscopy :FCS。例如参照专利 文献1_3、非专利文献1-3)、突光强度分布分析（Fluorescence-Intensity Distribution Analysis :FIDA。例如专利文献4、非专利文献4)、光子计数直方图（Photon Counting Histogram :PCH。例如专利文献5)等。另外，在专利文献6?8中，提出了根据利用共焦显 微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。
[0003] 并且，本申请的 申请人:在专利文献9?11中提出了利用共焦显微镜或多光子显微 镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的、基于与FCS、FIDA等 光分析技术不同的原理的新的光分析技术。在上述的FCS、FIDA等光分析技术的情况下，通 过计算统计性的波动的运算处理来针对通过连续地测量来自浮游于作为样本溶液内的光 的检测区域的微小区域（以下称为"光检测区域"。）的荧光分子的光而得到的光强度数据 进行解析，从而检测荧光分子的浓度和/或其它特性。对于此，在专利文献9?11所提出的 新的光分析技术中，一边使光检测区域的位置在样本溶液中移动、即一边通过光检测区域 对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子 时逐个检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐一地进行检测， 来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该光 分析技术（以下称为"扫描分子计数法"），与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所 需要的样本可以是微量的（例如几十UL左右），另外，测量时间短（在一次测量中反复进 行多次秒级时间的测量。），并且能够在作为观测对象的粒子的浓度低于FCS、FIDA等光分 析技术能够良好地进行测量的水平（ΙηΜ左右）的样本溶液中检测发光粒子的存在，并定量 地检测其浓度、数密度或其它特性。
[0004] 这样，期待"扫描分子计数法"在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀 少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体 数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查且能够 检测无法良好地执行FCS、FIDA等的程度的更低浓度的粒子的浓度和/或特性的强力工具。
[0005] 专利文献1 :日本特开2005-098876
[0006] 专利文献2 :日本特开2008-292371
[0007] 专利文献3 :日本特开2009-281831
[0008] 专利文献4 :日本特许第4023523号
[0009] 专利文献5 :国际公开2008-080417
[0010] 专利文献6 :日本特开2007-20565
[0011] 专利文献7 :日本特开2008-116440
[0012] 专利文献8 :日本特开平4-337446号公报
[0013] 专利文献9 :国际公开第2011/108369
[0014] 专利文献10 :国际公开第2011/108370
[0015] 专利文献11 :国际公开第2011/108371
[0016] 非专利文献1 :金城政孝、蛋白质核酸酶Vol. 44、No. 9、1431-1438页1999年
[0017] 非专利文献 2 :F. J. Meyer-Alms、突光相关谱（Fluorescence Correlation Spectroscopy)、R. Rigler 编、Springer、柏林、2000 年、204-224 页
[0018] 非专利文献3 :加藤则子及其他4名、遗传医学、Vol. 6、No. 2、271-277页
[0019] 非专利文献4:卡斯柯（Kask)及其他3名、美国科学学院纪要、1999年、96卷、 13756-13761 页（P. Kask，K. Palo, D. Ullmann，K. Gall PNAS96, 13756-13761(1999))
[0020] 非专利文献 5 :Anal. Chem. Vol. 70、No. 3、632 页 1998 年


【发明内容】

[0021] 发明要解决的问是页
[0022] 在上述的专利文献9?11所记载的扫描分子计数法中，典型的是，在来自光检测 区域的光强度的时序数据（时序光强度数据）中，在吊钟状的光强度的变化对应作为观测 对象的单个粒子的存在的假定下，进行所述吊钟状的光强度的变化的检测。例如在观测对 象粒子是发光粒子的情况下（如后述那样，也有可能存在观测对象粒子是不发出检测波长 频带的光的粒子（非发光粒子）的情况。），时序光强度数据中观测出的吊钟状或脉冲状的 光强度增大中的符合发光粒子通过光检测区域内时假定的光强度增大的轮廓（峰值强度、 半峰全宽等）条件的光强度的变化被检测为表示粒子的存在的信号。而且，不符合发光粒 子的光强度增大的轮廓条件的光强度增大被判定为噪声。
[0023] 然而，在时序光强度数据中检测出如上所述的吊钟状的信号的情况下，当粒子的 信号的大小变弱时，难以辨别粒子的信号和噪声信号。
[0024] 如后述的实施方式一栏中更加详细地说明的那样，为了捕捉观测对象粒子的微弱 的光强度或其变化，典型地通过光子计数来执行光强度的测量，时序光强度数据为离散的 光子计数数据（参照图2的（A))。在这种情况下，为了容易地进行吊钟状的信号的检测，优 选的是，将时序光强度数据按时间平滑化，在平滑化后的时序光强度数据中检测符合粒子 的光强度变化的轮廓条件的吊钟状的信号。然而，在所述方式中，在粒子的信号的强度变化 小时，导致该信号在光子计数数据的阶段被埋没于噪声中，即使在平滑化处理后该信号也 不呈现粒子的光强度变化的吊钟状的轮廓的特征，从而不会被检测为粒子的信号。特别地， 与粒子的存在对应的信号的大小根据光检测区域内的粒子的通过路径的不同而变化，通过 光检测区域的周边部的粒子的信号的强度变化小。因而，很多微弱的通过光检测区域的周 边部的粒子的信号被遗漏，或者噪声信号被错误判定为微弱的粒子的信号，该情况成为提 高扫描分子计数法的灵敏度或精度的妨碍之一。
[0025] 这样，本发明的主要课题在于提供一种在上述的扫描分子计数法中能够进一步提 高其灵敏度和/或精度的新的粒子信号的检测手段或方法。
[0026] 另外，本发明的另一个课题在于提供一种在上述的扫描分子计数法中能够更高精 度地辨别微弱的粒子的信号和噪声信号的新的粒子信号的检测手段或方法。
[0027] 关于上述课题，本发明的发明人发现，在扫描分子计数法的时序光强度数据上，在 与粒子的信号对应的部分和噪声信号的部分光强度的时间变化（光子数列）的产生图案存 在差异。即，在噪声信号的情况下，总是随机地检测出光子，与此相对地，在粒子的信号的情 况下，在时间上集中地检测出光子。在本发明中，通过能够检测所述的光强度的时间变化的 产生图案的差异的新算法，能够实现扫描分子计数法中的粒子的信号的检测精度的提高。 另外，光强度的时间变化的产生图案也根据粒子的特性（偏振特性、发光波长特性）而变 化，因此也尝试根据光强度的时间变化的产生图案的差异对不同特性的粒子进行辨别。
[0028] 用于解决问题的方案
[0029] 这样，根据本发明，通过下述装置来达成上述课题，该装置是利用共焦显微镜或多 光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分散并随机运动的单个粒子的光分析装置，该光 分析装置的特征在于，包括：光检测区域移动部，其使显微镜的光学系统的光检测区域的位 置在样本溶液内移动；光检测部，其检测来自光检测区域的光；以及信号处理部，其生成一 边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边由光检测部检测出的来自光检测区域的光 的按时间序列的光强度数据，在按时间序列的光强度数据上逐个地检测表示各个单个粒子 的存在的信号，其中，信号处理部计算在按时间序列的光强度数据上按时间序列设定的各 个解析窗中的光强度值的时间变化的、假定为在光检测区域内不存在单个粒子的第一状态 的情况下的第一产生概率和假定为在光检测区域内存在单个粒子的第二状态的情况下的 第二产生概率，根据第一产生概率和第二产生概率，在按时间序列的光强度数据上检测表 示各个单个粒子的存在的信号。
[0030] 在上述本发明的结构中，"在样本溶液中分散并随机运动的单个粒子"是指在样本 溶液中分散或溶解的原子、分子或它们的聚合体等粒子，只要是不固定在基板等上而在溶 液中自由地进行布朗运动的粒子，则可以是任意的粒子。作为观测对象的单个粒子可以是 发光的粒子（发光粒子），也可以是（在检测波长频带）不发光的粒子（非发光粒子）。在 观测对象粒子是发光粒子的情况下，"表示各个单个粒子的存在的信号"成为与发光粒子通 过该光检测区域内时发出的光对应的在时序光强度数据上的"光强度值的暂时性的增大"。 发光粒子典型地是荧光性粒子，但也可以是通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等而发 光的粒子。另外，观测对象粒子也可以是非发光粒子，在这种情况下，来自光检测区域的光 包含有意义的背景光，"表示各个单个粒子的存在的信号"成为来自背景光的光强度的暂时 性的下降（反转型扫描分子计数法）。此外，共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统的"光 检测区域"是指这些显微镜中检测光的微小区域，从物镜提供照明光的情况下，相当于该照 明光会聚到的区域（在共焦显微镜中，特别地根据物镜和针孔之间的位置关系来确定。在 发光粒子没有照明光而发光的情况下，例如通过化学发光或生物发光来发光的粒子的情况 下，在显微镜中不需要照明光。）。另外，典型的是，光检测部通过对每个规定的测量单位时 间（BIN --ΜΕ)来到的光子数进行计数的光子计数检测来自光检测区域的光，在这种情况 下，按时间序列的光强度数据为按时间序列的光子计数数据。
[0031] 如从上述理解的那样，在本发明的装置中，基本上与专利文献9?11所记载的"扫 描分子计数法"同样地，一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区 域对样本溶液内进行扫描，一边逐次进行光的检测和表示按时间序列的光强度值的时序光 强度数据的生成，在时序光强度数据上检测表示单个粒子的存在的信号。在检测所述的表 示单个粒子的存在的信号时，在本发明中，不是简单地根据光强度值的增加和减少量是否 超过了规定量来执行单个粒子的信号的检测，而是按时间序列对时序光强度数据上的光强 度值的时间变化的图案是在光检测区域内没有单个粒子的情况和在光检测区域内存在单 个粒子的情况中的哪一个情况下容易产生的图案进行评价。即，如已经提及的那样，在时序 光强度数据中与粒子的信号对应的部分和噪声信号的部分光强度的时间变化的产生图案 存在差异，因此在时序光强度数据上的某部分中的光强度值的时间变化的图案为在光检测 区域内没有单个粒子的情况下容易产生的图案时，能够判定为该部分是只有噪声信号的部 分，在该图案为在光检测区域内存在单个粒子的情况下容易产生的图案时，能够判定为该 部分是与粒子的信号对应的部分。而且，能够根据某光强度值的时间变化的图案在光检测 区域内存在单个粒子的情况和不存在单个粒子的情况下分别的产生概率，来判定该光强度 值的时间变化的图案是在光检测区域内存在单个粒子的情况和不存在单个粒子的情况中 的哪一个情况下容易产生的图案。
[0032] 这样，在本发明的装置中，为了在时序光强度数据上检测在光检测区域内存在粒 子的部分、即表示单个粒子的存在的信号，而如上所述那样，计算"在按时间序列的光强度 数据上按时间序列设定的各个解析窗中的光强度值的时间变化的、假定为在光检测区域内 不存在单个粒子的第一状态的情况下的第一产生概率和假定为在光检测区域内存在单个 粒子的第二状态的情况下的第二产生概率"。在此，"解析窗"是指在时序光强度数据上的任 意时间宽度的区域，"解析窗"在时序光强度数据上逐次地或按时间序列设定。另外，"第一 产生概率"是指在光检测区域内不存在单个粒子的情况下产生在"解析窗"中测量出的光强 度的时间变化的概率，"第二产生概率"是指在光检测区域内存在单个粒子的情况下产生在 "解析窗"中测量出的光强度的时间变化的概率。而且，如果在光检测区域内存在单个粒子， 贝1J "第二产生概率"相对于"第一产生概率"增大，因此通过参照"第一产生概率"和"第二产 生概率"，来在按时间序列的光强度数据上确定在光检测区域内存在单个粒子的时间区域， 由此，能够进行表示各个单个粒子的存在的信号的检测。
[0033] 此外，在上述的结构中，解析窗的宽度例如可以设定为单个粒子通过光检测区域 所需要的时间以上的任意的宽度。另外，解析窗也可以在时序光强度数据上按每个单位 时间或每个规定的时间间隔进行设定（在这种情况下，按时间序列设定的解析窗相互重 叠。），或者也可以通过将时序光强度数据以规定的时间宽度分割来设定。"单位时间"是指 在光测量中提供一个光强度值的宽度的时间，如果是光子计数的情况，则可以是一个或一 个以上的个数的BIN --ΜΕ的宽度的时间。
[0034] 在上述的结构中，能够根据解析窗内的、实际测量出的光强度值的时间变化的图 案相对于假定为第一状态和第二状态的情况下的光强度值的时间变化的平均的图案的偏 移来分别确定第一产生概率和第二产生概率。实测值的图案相对于平均的图案的偏移越 小，该实测值的图案产生的概率越高。因而，能够根据解析窗内的在每个单位时间检测出的 光强度值及假定为第一状态和第二状态的情况下的每个单位时间的预期值来分别计算第 一产生概率和第二产生概率。另外，在时序光强度数据上出现的光强度值是从光检测区域 内释放的光子数或与其成比例的量，因此认为每个单位时间的光强度值依照泊松分布。因 此，在上述的结构中，优选的是，设每个单位时间的光强度值依照具有每个单位时间的预期 值的泊松分布来计算每个单位时间的光强度值的单位时间产生概率，第一产生概率和第二 产生概率可以分别使用对应的单位时间产生概率来进行计算。
[0035] 这样，在上述的装置中，简单地说，可以判定为在第二产生概率大于第一产生概率 的解析窗的时间内在光检测区域内存在单个粒子。另外，也可以按时间序列计算第一产生 概率和第二产生概率之比或比值比（Odds ratio)，根据所述的概率之比或比值比的值来确 定在光检测区域内存在单个粒子的时间。
[0036] 另外，在上述的扫描分子计数法中，能够分别检测来自光检测区域的光的至少两 个互不相同的成分并生成各个成分的按时间序列的光强度数据。在这种情况下，能够选择 要检测的成分使得在要检测的成分的数据中反映单个粒子的任意特性。例如，如果选择偏 振方向互不相同的成分作为要检测的多个成分，则在多个成分的时序光强度数据中能够反 映粒子的偏振特性。另外，如果选择互不相同的波长频带的光成分作为要检测的多个成分， 则在多个成分的时序光强度数据中能够反映粒子的发光波长特性。而且，在多个成分的时 序光强度数据中的光强度值的时间变化的图案中也能够反映观测对象粒子的如上所述那 样的特性。
[0037] 因此，上述的本发明的装置还可以构成为，光检测部分别检测来自光检测区域的 光的至少两个互不相同的成分，信号处理部生成各个上述成分的按时间序列的光强度数 据，并且，信号处理部能够计算各个成分的第一产生概率和第二产生概率。在所述结构中， 通过适当选择检测成分，能够使所检测出的光的各个成分的第二产生概率反映作为观测对 象的单个粒子所具有的规定的特性值，即能够将第二产生概率设为单个粒子所具有的规定 的特性值的函数。然后，参照每个成分的第一产生概率和第二产生概率的产生概率，在作为 规定的特性值的函数的第二产生概率相对高的区域能够判定为存在具有规定的特性值的 粒子（在存在不具有规定的特性值的粒子的情况下，作为规定的特性值的函数的第二产生 概率变低。）。即，通过使用每个成分的第一产生概率和第二产生概率的产生概率，不只是 检测光检测区域内有无粒子的存在，还能够在按时间序列的光强度数据上确定在光检测区 域内具有规定的特性值的粒子存在的时间，并检测出具有规定的特性值的粒子的存在。
[0038] 并且，如上所述，根据使用至少两个互不相同的成分的第一产生概率和第二产生 概率的产生概率的方式，在作为单个粒子包含具有互不相同的规定的特性值的多个种类的 单个粒子的情况下，对各个种类的单个粒子，能够在按时间序列的光强度数据上确定粒子 存在的时间。即，按单个粒子的每个种类计算它们的作为互不相同的规定的特性值的函数 的各个成分的第二产生概率（在第一状态下不存在粒子，因此第一产生概率不反映粒子的 特性值。），在参照多个成分各自的第一产生概率和多个种类的各个单个粒子的各个成分的 第二产生概率时，能够估计为在光检测区域内存在提供相对高的值的第二产生概率的种类 的粒子。这样，在单个粒子包含具有互不相同的规定的特性值的多个种类的单个粒子的情 况下，上述本发明的装置可以构成为按单个粒子的每个种类计算作为互不相同的规定的特 性值的函数的各个成分的第二产生概率,根据各个成分的第一产生概率和多个种类的各个 单个粒子的各个成分的第二产生概率，在按时间序列的光强度数据上，按单个粒子的每个 种类检测表示该单个粒子的存在的信号。总之，根据所述结构，在样本溶液中包含有多个种 类的单个粒子的情况下，能够对种类进行辨别并且进行粒子的检测。
[0039] 此外，作为上述的要使第二产生概率反映的粒子的特性值，如已经提及的那样，可 以是表示单个粒子的偏振特性的指标值例如荧光各向异性、表示单个粒子的发光波长特性 的指标值例如互不相同的发光波长频带的发光强度之比等。
[0040] 可以根据作为观测对象的单个粒子的特性或样本溶液中的数密度或浓度适当地 变更上述本发明的装置中的样本溶液内的光检测区域的位置的移动速度。如果光检测区域 的移动速度变快，则在单个粒子是发光粒子的情况下，从一个发光粒子获得的光量减少，另 夕卜，在单个粒子是非发光粒子的情况下，由于存在一个非发光粒子而导致的光强度值的减 少量变小。因而，优选的是能够适当地变更光检测区域的移动速度以能够高精度或高灵敏 度地测量单个粒子的光强度值的变化。另外，优选的是，将样本溶液内的光检测区域的位置 的移动速度设定得比作为检测对象的单个粒子的扩散移动速度（由布朗运动引起的粒子 的平均移动速度）高。如上述说明的那样，在本发明的装置中，在使用假定为在光检测区域 内没有粒子的情况和存在粒子的情况（第一状态和第二状态）而计算出的时间变化图案的 (第一和第二）产生概率对所检测出的光强度值的时间变化的图案进行评价时，如果还考 虑在粒子通过光检测区域内时粒子通过布朗运动而移动的情形，则第二产生概率的计算变 得复杂。因此，在本发明中，优选的是，将光检测区域的移动速度设定得比作为检测对象的 单个粒子的扩散移动速度快以能够忽略在粒子通过光检测区域内的过程中粒子的布朗运 动所产生的效果。此外，扩散移动速度根据单个粒子的不同而变化，因此如上所述，优选的 是本发明的装置构成为能够根据其特性（特别是扩散系数）适当地变更光检测区域的移动 速度。
[0041] 可以通过任意的方式进行样本溶液内的光检测区域的位置的移动。例如，可以使 用在激光扫描型光学显微镜中所采用的检电镜（Galvano-mirror)等变更显微镜的光学系 统的光路来变更光检测区域的位置，或者可以（例如移动显微镜的台等）移动样本溶液的 位置来移动光检测区域在样本溶液内的位置。光检测区域的位置的移动轨迹可以任意地设 定，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。特别是在变更显微镜的光学 系统的光路来变更光检测区域的位置的情况下，光检测区域的移动迅速，并且在样本溶液 中实质上不发生机械振动、流体动力的作用，因此作为检测对象的单个粒子不会受到力学 作用的影响而能够在稳定的状态下进行光的测量，在这点上是有利的。
[0042] 在上述本发明的一个实施方式中，可以对信号的个数进行计数来对包含在光检测 区域中的单个粒子的个数进行计数（粒子的计数）。在这种情况下，通过将所检测出的单 个粒子的个数和光检测区域的位置的移动量组合，能够获得与样本溶液中的被分类的单个 粒子的数密度或浓度有关的信息。具体地说，例如可以计算多个样本溶液的数密度或浓度 之比，或者计算相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之 t匕，或者使用相对于作为浓度或数密度的基准的标准样本溶液的相对的数密度或浓度之比 来确定绝对的数密度值或浓度值。或者，如果通过任意的方法、例如以规定的速度移动光检 测区域的位置等而能够确定出光检测区域的位置的移动轨迹的总体积，则能够具体估算单 个粒子的数密度或浓度。
[0043] 通过通用的计算机也能够实现上述本发明的装置中一边使光检测区域的位置在 样本溶液内移动一边进行光检测来逐个地检测来自单个粒子的信号、参照产生所检测出的 光强度值的时间变化的图案的概率（第一产生概率和第二产生概率）来确定单个粒子的有 无的光分析技术的处理。
[0044] 因而，根据本发明的另一个方式，提供一种光分析用计算机程序，用于使用共焦显 微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分散且随机运动的单个粒子，该计算机 程序的特征在于，使计算机执行以下步骤：使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样 本溶液内移动；一边使光检测区域的位置在样本溶液内移动一边测量来自光检测区域的 光的强度，并生成光强度数据；计算在按时间序列的光强度数据上按时间序列设定的各个 解析窗中的光强度的时间变化值的、假定为在光检测区域内不存在单个粒子的第一状态的 情况的第一产生概率和假定为在光检测区域内存在单个粒子的第二状态的情况的第二产 生概率；以及根据第一产生概率和第二产生概率，在按时间序列的光强度数据上检测表示 各个单个粒子的存在的信号。在这种情况下，也与本发明的装置同样地，典型的是，在检测 来自光检测区域的光并生成按时间序列的光强度数据的步骤中，通过对每个测量单位时间 (BIN TIME)来到的光子数进行计数的光子计数来检测来自光检测区域的光，按时间序列的 光强度数据是按时间序列的光子计数数据。"解析窗"可以与本发明的装置的情况同样地设 定。在作为观测对象的粒子是发光粒子的情况下，时序光强度数据上的"光强度值的暂时性 的增大"成为"表示各个单个粒子的存在的信号"。另外，在作为观测对象的粒子是（在检 测波长频带）非发光粒子的情况下，来自光检测区域的光包含有意义的背景光，来自背景 光的光强度的暂时性的下降成为"表示各个单个粒子的存在的信号"。此外，将计算机程序 通过存储到计算机能够读取的存储介质中来提供。计算机通过读出存储在存储介质中的程 序来执行信息的加工、运算处理，由此实现上述的步骤。在此，计算机能够读取的存储介质 可以是磁盘、磁光盘、⑶-R0M、DVD-R0M、半导体存储器等。并且，上述的程序也可以通过通信 线路传输到计算机，由接受该传输的计算机来执行程序。
[0045] 在上述结构中也同样，典型的是，第一产生概率和第二产生概率可以是根据解析 窗内的每个单位时间的光强度值和假定为第一状态和第二状态的情况下的每个单位时间 的预期值而分别计算出的，更具体地说，设每个单位时间的光强度值依照具有每个单位时 间的预期值的泊松分布来计算每个单位时间的光强度值的单位时间产生概率，第一产生概 率和第二产生概率分别是利用对应的单位时间产生概率而计算出的。而且，可以在第二产 生概率大于第一产生概率的解析窗的时间内判定为在光检测区域内存在单个粒子、或者根 据第二产生概率与第一产生概率的比值比来确定在光检测区域内存在单个粒子的时间区 域。
[0046] 另外，上述的计算机程序也可以构成为分别检测来自光检测区域的光的至少两个 互不相同的成分，生成各个所述成分的按时间序列的光强度数据，并且，对各个成分计算第 一产生概率和作为观测对象即单个粒子的规定的特性值的函数的第二产生概率，根据每个 成分的第一产生概率和第二产生概率的产生概率，在按时间序列的光强度数据上检测表示 具有规定的特性值的单个粒子的存在的信号。而且，在单个粒子包含具有互不相同的规定 的特性值的多个种类的单个粒子的情况下，在上述的计算机程序中，可以按单个粒子的每 个种类计算作为互不相同的规定的特性值的函数的各个成分的第二产生概率，根据各个成 分的第一产生概率和多个种类的各个单个粒子的各个成分的第二产生概率，在按时间序列 的光强度数据上，按单个粒子的每个种类检测表示该单个粒子的存在的信号。
[0047] 并且，可以根据单个粒子的特性、样本溶液中的数密度或浓度适当地变更样本溶 液内的光检测区域的位置的移动速度，优选的是，将样本溶液内的光检测区域的位置的移 动速度设定得比作为检测对象的单个粒子的扩散移动速度高。可以通过任意的方式进行样 本溶液内的光检测区域的位置的移动，优选的是，可以通过变更显微镜的光学系统的光路 或者移动样本溶液的位置来变更光检测区域的位置。光检测区域的位置的移动轨迹可以任 意地设定，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。
[0048] 并且，在上述的计算机程序中也同样，可以包括以下步骤：对逐个检测出的来自单 个粒子的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的单个粒子 的个数进行计数；和/或根据检测出的单个粒子的个数来确定样本溶液中的单个粒子的数 密度或浓度。
[0049] 根据上述本发明的装置或计算机程序，实现如下一种新的光分析方法：一边使光 检测区域的位置在样本溶液内移动一边进行各个发光粒子的光的检测，该方法参照产生所 检测出的光强度值的时间变化的图案的概率（第一产生概率和第二产生概率）来确定单个 粒子的有无。
[0050] 这样，根据本发明，还提供一种方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统 检测在样本溶液中分散并随机运动的单个粒子，该光分析方法的特征在于，包括以下过程： 使显微镜的光学系统的光检测区域的位置在样本溶液内移动；一边使光检测区域的位置在 样本溶液内移动一边测量来自光检测区域的光的强度并生成光强度数据；计算在按时间序 列的光强度数据上按时间序列设定的各个解析窗中的光强度值的时间变化的、假定为在光 检测区域内不存在单个粒子的第一状态的情况下的第一产生概率和假定为在光检测区域 内存在单个粒子的第二状态的情况下的第二产生概率；以及根据第一产生概率和第二产生 概率，在按时间序列的光强度数据上检测表示各个单个粒子的存在的信号。在这种情况下 也与本发明的装置同样地，典型的是，在检测来自光检测区域的光并生成按时间序列的光 强度数据的过程中，通过对每个测量单位时间（BIN --ΜΕ)来到的光子数进行计数的光子计 数来检测来自光检测区域的光，按时间序列的光强度数据是按时间序列的光子计数数据。 "解析窗"可以与本发明的装置的情况同样地设定。在作为观测对象的粒子是发光粒子的情 况下，时序光强度数据上的"光强度值的暂时性的增大"成为"表示各个单个粒子的存在的 信号"。另外，在作为观测对象的粒子是（在检测波长频带）非发光粒子的情况下，来自光 检测区域的光包含有意义的背景光，来自背景光的光强度的暂时性的下降成为"表示各个 单个粒子的存在的信号"。
[0051] 在上述的结构中也同样，典型的是，第一产生概率和第二产生概率可以是根据解 析窗内的每个单位时间的光强度值和假定为第一状态和第二状态的情况下的每个单位时 间的预期值而分别计算出的，更具体地说，设每个单位时间的光强度值依照具有每个单位 时间的预期值的泊松分布来计算每个单位时间的光强度值的单位时间产生概率，第一产生 概率和第二产生概率是利用各自对应的单位时间产生概率而计算出的。而且，可以在第二 产生概率大于第一产生概率的解析窗的时间内判定为在光检测区域内存在单个粒子、或者 根据第二产生概率和第一产生概率的比值比来确定在光检测区域内存在单个粒子的时间 区域。
[0052] 另外，上述的方法也可以构成为分别检测来自光检测区域的光的至少两个互不相 同的成分，生成各个所述成分的按时间序列的光强度数据，并且，对各个成分计算第一产生 概率和作为观测对象即单个粒子的规定的特性值的函数的第二产生概率，根据每个成分的 第一产生概率和第二产生概率的产生概率，在按时间序列的光强度数据上检测表示具有规 定的特性值的单个粒子的存在的信号。而且，在单个粒子包含具有互不相同的规定的特性 值的多个种类的单个粒子的情况下，在上述的方法中，可以按单个粒子的每个种类计算作 为互不相同的规定的特性值的函数的各个成分的第二产生概率，根据各个成分的第一产生 概率和多个种类的各个单个粒子的各个成分的第二产生概率，在按时间序列的光强度数据 上，按单个粒子的每个种类检测表示该单个粒子的存在的信号。
[0053] 并且，可以根据单个粒子的特性、样本溶液中的数密度或浓度适当地变更样本溶 液内的光检测区域的位置的移动速度，优选的是，将样本溶液内的光检测区域的位置的移 动速度设定得比作为检测对象的单个粒子的扩散移动速度高。可以通过任意的方式进行样 本溶液内的光检测区域的位置的移动，优选的是，可以通过变更显微镜的光学系统的光路 或者移动样本溶液的位置来变更光检测区域的位置。光检测区域的位置的移动轨迹可以任 意地设定，例如可以从圆形、椭圆形、矩形、直线以及曲线中选择即可。
[0054] 并且，在上述的方法中也同样，可以包括以下过程：对逐个检测出的来自单个粒子 的信号的个数进行计数来对在光检测区域的位置的移动过程中检测出的单个粒子的个数 进行计数；和/或根据检测出的单个粒子的个数来确定样本溶液中的单个粒子的数密度或 浓度。
[0055] 上述本发明的光分析技术典型地用于分析或解析蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨 基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的生物学对象物在溶液中的状态 的用途，但是也可以用于分析或解析非生物学粒子（例如原子、分子、胶束（micelles)、金 属胶体等）在溶液中的状态，应该理解为这种情况也属于本发明的范围。
[0056] 发明的效果
[0057] 这样，根据本发明，在扫描分子计数法中，不是简单地参照时序光强度数据上的光 强度值的增加和减少，而是确定容易产生光强度值的时间变化的图案的状态，从而估计在 光检测区域内是否存在单个粒子。根据所述结构，即使在单个粒子所引起的光强度值的变 化比较小、只根据光强度值变化的绝对值难以判断是粒子的信号还是噪声信号的情况下， 也能够期待能够高精度地对粒子的信号和噪声信号进行辨别。另外，通过提高粒子的信号 与噪声信号的辨别精度，由此期待扫描分子计数法中能够检测的样本溶液中的单个粒子的 浓度范围扩大至低浓度侧。并且，在使用考虑作为观测对象的单个粒子的规定的特性值而 计算出的光强度值的时间变化产生概率的情况下，还能够对作为观测对象的单个粒子与除 此以外的粒子进行辨别，在混合存在杂质等的样本溶液中也能够期待测量的精度或灵敏度 的提商。
[0058] 通过本发明的以下优选实施方式的说明可清楚本发明的其它目的和优点。

【专利附图】

【附图说明】
[0059] 图1的（A)是执行本发明的扫描分子计数法的光分析装置的内部结构的示意图。 图1的（B)是共焦区组织（共焦显微镜的观察区域）的示意图。图1的（C)是变更反射镜 7的朝向使光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构的示意图。图1的（D)是移动微板 的水平方向位置来移动样本溶液内的光检测区域的位置的机构的示意图。
[0060] 图2的（A)、(B)分别是说明应用本发明的扫描分子计数法中的检测发光粒子的光 的原理的示意图以及所测量的光强度的时间变化的示意图。图2的（C)、（D)分别是说明应 用本发明的反转型扫描分子计数法中的检测在检测光波长频带不发光的单个粒子的存在 的原理的示意图以及所测量的光强度的时间变化的示意图。
[0061] 图3的（A)示出时序光强度数据的示意性的例子。（左）存在亮度大的发光粒子 的情况。（中）存在亮度小的发光粒子的情况。（右）不存在发光粒子的情况。图3的（B) 是说明在本发明中在时序光强度数据上设定的解析窗的图。图3的（C)是表示通过以比发 光粒子的扩散移动速度快的速度使样本溶液内的光检测区域的位置移动而发光粒子横穿 光检测区域时的粒子的运动方式的模型图。图3的（D)是从光检测区域中的发光粒子释放 并被检测出的光的在光检测区域的半径r方向的强度分布的示意图。
[0062] 图4的㈧是为了说明而示意性地示出的时序光强度数据，上部示出分别假定为 存在发光粒子的状态（左：第二状态）和不存在发光粒子的状态（右：第一状态）的情况 下的时序光强度数据上的光强度值的预期值，中部示出实际测量出的光强度值，下部示出 分别假定为存在发光粒子的状态（左）和不存在发光粒子的状态（右）的情况下的测量出 的光强度值的产生概率。图4的（B)示出了从发光粒子释放出的光的相互的偏振成分的模 型图（上）、各成分的光强度值的平均时间变化（左下）以及合计的光强度值的平均时间 变化（右下）。图4的（C)是具有互不相同的发光波长特性的发光粒子D1、D2的发光波长 谱，示出了在分别检测互不相同的波长频带的光的成分的情况下来自以各波长频带检测出 的各发光粒子的成分的光强度值。阴影部分的面积相当于各成分的光强度值。
[0063] 图5是以流程图的形式表示依照本发明执行的扫描分子计数法的处理过程的图。
[0064] 图6示出了依照本发明的扫描分子计数法获得的时序光强度数据（光子计数数 据）的一部分（A)、对（A)的时序光强度数据进行平滑而得到的平滑化后的时序光强度数 据（B)以及（A)的时序光强度数据的、依照本发明的教导分别假定为存在粒子的情况和不 存在粒子的情况而计算出的产生概率（第二产生概率和第一产生概率）的比值比（C)。
[0065] 图7是与图6相同的图，示出了时序光强度数据的另一部分。
[0066] 图8是表示依照本发明的扫描分子计数法进行了发光粒子的检测和计数的情况 下的样本溶液中的发光粒子（ATT0647N)浓度与检测出的粒子数的关系的图。
[0067] 图9的（A)示出了依照本发明的反转型扫描分子计数法得到的时序光强度数据 (光子计数数据）的一部分（上部）以及该时序光强度数据的、依照本发明的教导分别假定 为存在粒子的情况和不存在粒子的情况而计算出的产生概率（第二产生概率和第一产生 概率）的比值比（下部）。图9的（B)是将（A)的一部分放大后的图。
[0068] 图10是将图9的（B)进一步放大得到的图。
[0069] 图11的（A)是表示依照本发明的反转型扫描分子计数法进行了粒子的检测和计 数的情况下的样本溶液中的粒子浓度与检测出的粒子数的关系的图，图11的（B)是表示在 与（A)相同的时序光强度数据中样本溶液中的粒子浓度与通过平滑化和吊钟型函数的拟 合而检测出的粒子数的关系的图。在图中，误差条（error bar)是标准偏差。
[0070] 图12示出了在依照本发明的扫描分子计数法进行光的测量而分别检测互不相同 的偏振方向的成分所获得的时序光强度数据中、使用考虑发光粒子的荧光偏振各向异性计 算出的产生概率来进行发光粒子的检测以及发光粒子的种类的辨别时的结果。在图中，左 边是在含有质粒的溶液中检测出的发光粒子的种类的辨别结果，右边是在含有荧光色素 (TAMRA)的溶液中检测出的发光粒子的种类的辨别结果。
[0071] 附图标记说明
[0072] 1 :光分析装置（共焦显微镜）；2 :光源；3 :单模光纤（single-mode optical fiber) ;4 :准直透镜；5 :分色镜；6、7、11 :反射镜；8 :物镜；9 :微板；10 :皿（样本溶液容 器）；12 :聚光镜（condenser lens) ; 13 :针孔；14 :屏蔽滤波器；14a :分色镜或分束器；15 : 多模光纤（multi-mode optical fiber) ; 16 :光检测器；17 :反射镜偏转器；17a :台位置变更 装置；18 :计算机。

【具体实施方式】
[0073] 下面，详细说明本发明的优选实施方式。
[0074] 光分析裝置的结构
[0075] 实现本发明的光分析技术的光分析装置可以是如下的装置：在基本结构中，如图 1的（A)示意性地例示那样，组合能够执行FCS、FIDA等的共焦显微镜的光学系统和光检测 器而成。参照该图，光分析装置1由光学系统2?17以及用于控制光学系统的各部分的动 作并且获取并解析数据的计算机18构成。光分析装置1的光学系统可以与通常的共焦显 微镜的光学系统相同，在此，使从光源2发射并在单模光纤3内传播的激光（Ex)在光纤的 出射端成为以由固有的NA决定的角度发散的光而发射，通过准直器4成为平行光，被分色 镜5、反射镜6、7反射，入射到物镜8。典型的是，在物镜8的上方配置有微板9,该微板9排 列有注入了 1 μ L?几十μ L的样本溶液的样本容器或皿10,从物镜8射出的激光在样本容 器或皿10内的样本溶液中聚焦，形成光强度强的区域（激励区域）。
[0076] 在作为观测对象的单个粒子是发光粒子的情况下，在样本溶液中分散或溶解有发 光粒子、典型的是荧光性粒子或附加有荧光色素等发光标识的粒子，当所述发光粒子进入 激励区域时，在其间发光粒子被激励而释放出光。另一方面，在作为观测对象的单个粒子是 非发光粒子的情况下，典型地，在样本溶液中分散或溶解有在检测波长频带不发光的粒子 和产生背景光的任意的发光物质，在检测波长频带不发光的粒子未进入激励区域时，发光 物质被激励而释放出实质上固定的光，成为背景光，当在检测波长频带不发光的粒子进入 激励区域时，背景光减少。
[0077] 这样，从激励区域释放出的光（Em)通过物镜8、分色镜5,被反射镜11反射后被聚 光镜12聚光，通过针孔13,透过屏蔽滤波器14 (在此，只选择特定波长频带的光成分。），被 导入到多模光纤15,到达光检测器16,在被变换为按时间序列的电信号之后输入到计算机 18,以后面说明的方式进行用于光分析的处理。此外，如本领域技术人员所了解的那样，在 上述结构中，针孔13配置在与物镜8的焦点位置共轭的位置，由此仅从如图1的（B)示意 性地表示的激光的焦点区域、即光检测区域内发出的光通过针孔13,来自光检测区域以外 的光被遮断。图1的（B)所例示的激光的焦点区域通常是具有lfL?10fL左右的有效体 积的本光分析装置中的光检测区域（典型的是光强度以区域中心为顶点的高斯型分布。有 效体积是以光强度为中心光强度的Ι/e 2的面为边界的大致椭圆球体的体积。），被称为共 焦区组织。另外，在本发明中，检测来自一个发光粒子的光、例如来自一个荧光色素分子的 微弱光，或检测因非发光粒子的存在而导致的背景光的减少，因此作为光检测器16,优选的 是使用能够在光子计数中使用的超高灵敏度的光检测器。在光的检测是通过光子计数进行 的情况下，以在规定时间内按每个测量单位时间（BIN --ΜΕ)逐次测量来到光检测器的光子 的个数的方式执行光强度的测量。因而，在这种情况下，按时间序列的光强度数据是按时间 序列的光子计数数据。另外，可以在显微镜的台（未图示）设置用于移动微板9的水平方 向位置以变更要观察的皿10的台位置变更装置17a。可以由计算机18控制台位置变更装 置17a的动作。根据所述结构，在存在多个检体的情况下也能够达成迅速的测量。
[0078] 并且，在上述的光分析装置的光学系统中，设置有用于通过光检测区域扫描样本 溶液内的、即用于使焦点区域即光检测区域的位置在样本溶液内移动的机构。作为所述的 用于使光检测区域的位置移动的机构，例如图1的（C)示意性地例示的那样，可以采用变更 反射镜7的朝向的反射镜偏转器17 (使光检测区域的绝对位置移动的方式）。所述反射镜 偏转器17可以与在通常的激光扫描型显微镜中装备的检电镜装置相同。或者，作为其它的 方式，也可以如图1的（D)所例示的那样，使台位置变更装置17a进行动作以移动注入了样 本溶液的容器1〇(微板9)的水平方向的位置来使光检测区域在样本溶液内的相对位置移 动（使样本溶液的绝对位置移动的方式）。无论在哪种方式的情况下，都在计算机18的控 制下，与光检测器16的光检测协调地驱动反射镜偏转器17或台位置变更装置17a以达成 所期望的光检测区域的位置的移动图案。可以从圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组 合中任意地选择光检测区域的位置的移动轨迹（可以设为在计算机18中的程序中能够选 择各种移动图案。）。此外，虽然没有图示，但也可以通过使物镜8或台上下移动来使光检 测区域的位置在上下方向上移动。
[0079] 在作为观测对象物的发光粒子或提供背景光的物质通过多光子吸收而发光的情 况下，上述光学系统被用作多光子显微镜。在这种情况下，只在激励光的焦点区域（光检测 区域）释放光，因此可以去除针孔13。另外，在发光粒子或提供背景光的物质不通过激励光 而通过化学发光、生物发光现象发光的情况下，可以省略用于生成激励光的光学系统2? 5。在发光粒子或提供背景光的物质通过磷光或散射而发光的情况下，能够直接使用上述的 共焦显微镜的光学系统。并且，可以在光分析装置1中如图示那样设置多个激励光源2,可 以设为能够根据发光粒子或提供背景光的物质的激励波长而适当地选择激励光的波长。
[0080] 可以构成为还具备多个光检测器16,各个光检测器16分别检测来自光检测区域 的光中的互不相同的成分。如后面更详细地记述的那样，能够通过适当地选择要检测的成 分，来选择性地检测具有特定的发光特性的单个粒子。在检测这样的来自光检测区域的光 中的互不相同的成分的情况下，在通过针孔13之后的检测光光路上设置用于将光路以任 意的方式分割的机构。例如，在将来自光检测区域的光分开为互不相同的偏振成分进行检 测的情况下，在检测光光路的附有标记14a的部位插入偏振分束器14a。在这种情况下，在 激励光光路中插入偏振片（未图示）。另外，通过在检测光光路的部位14a处插入将检测光 光路中特定的波长频带的光反射、使其它的波长频带透过的分色镜14a，能够分别检测互不 相同的波长频带的光成分。
[0081] 计算机18具备CPU和存储器，通过CPU执行各种运算处理来执行本发明的过程。 此外，各过程也可以通过硬件构成。本实施方式所说明的处理的全部或一部分可以由计算 机18使用存储有实现这些处理的程序的计算机能够读取的存储介质来执行。即，计算机18 可以通过读出存储在存储介质中的程序执行信息的加工、运算处理来实现本发明的处理过 程。在此，计算机能够读取的记录介质可以是磁盘、磁光盘、⑶-R0M、DVD-R0M、半导体存储器 等，或者也可以将上述程序通过通信线路传输到计算机，由接受该传输的计算机来执行程 序。
[0082] 本发明的光分析抟术的原理
[0083] 如"
【发明内容】
"一栏所记载的那样，在本发明的光分析技术中，如果清楚地进行描 述，则在扫描分子计数法或反转型扫描分子计数法中，在从一边使光检测区域的位置移动 一边测量得到的时序光强度数据中检测作为观测对象的单个粒子的信号时，不是简单地参 照时序光强度数据上的光强度值的增加和减少，而是估计测量出的光强度值的时间变化的 图案是在光检测区域内存在粒子的情况和不存在粒子的情况中的哪一个情况下以更高的 概率产生的图案。然后，根据其估计结果，在时序光强度数据上检测作为观测对象的单个粒 子的信号是否存在和/或其个数。下面，说明本发明的扫描分子计数法以及作为观测对象 的单个粒子的信号的检测原理。
[0084] 1.扫描分子计数法的原理
[0085] 在扫描分子计数法所执行的基本处理中，如专利文献9?11所记载的那样，如果 清楚地进行描述，则驱动用于移动光检测区域的位置的机构（反射镜偏转器17)来变更光 路或者移动注入了样本溶液的容器1〇(微板9)的水平方向的位置，如图2的（A)示意性地 描绘的那样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动、即一边通过光检测区域CV扫 描样本溶液内，一边执行光检测。这样，在观测对象粒子是发光粒子的情况下，在光检测区 域CV移动的期间（图中为时间t0?t2)通过存在一个发光粒子的区域时（tl)，从发光粒 子释放出光，如图2的（B)所描绘的那样在按时间序列的光强度数据上出现有意义的光强 度（Em)的脉冲状的信号。因此，通过执行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，逐 个地检测在该期间出现的如图2的（B)所例示那样的脉冲状的信号（有意义的光强度），来 逐个地检测发光粒子，通过对其数量进行计数，能够获取存在于所测量的区域内的发光粒 子的数量、或者与浓度或数密度有关的信息。
[0086] 另外，在作为观测对象的粒子是非发光粒子的情况下，在上述的扫描分子计数法 的光测量中，从光检测区域释放背景光（或者，用照明光照亮光检测区域），通过捕捉作为 观测对象的粒子进入光检测区域时检测出的背景光的减少，能够检测出非发光粒子的存在 (反转型扫描分子计数法）。在这种情况下，更具体地说，如图2的（C)示意性地描绘的那 样，一边使光检测区域CV的位置在样本溶液内移动一边执行光检测。在此，当事先使发光 物质分散于样本溶液中时，在光检测区域CV内存在很多的发光物质，在光检测区域CV移动 的过程中（图中为时间to?t2)，来自这些发光物质的光被大致均匀地检测出。然而，在光 检测区域CV移动的期间通过存在单个非发光粒子的区域时（tl)，由于发光物质的存在区 域的体积减少，因此发光物质所释放的光的总量减少，如图2的（D)所描绘的那样，在按时 间序列的光强度数据上出现吊钟型的脉冲状的有意义的光强度（Em)的下降。通过这样执 行上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，逐个地检测在该期间出现的如图2的（D) 所例示那样的脉冲状的有意义的光强度的下降、即表示非发光粒子的存在的信号，来逐个 地检测非发光粒子，通过对其数量进行计数，能够获取存在于所测量的区域内的单个粒子 的数量、或者与浓度或数密度有关的信息。
[0087] 另外，在如上所述的扫描分子计数法中，在实际测量出的时序光强度数据上，除了 存在发光粒子的信号以外，还存在因热噪声、漫反射、水的拉曼散射等引起的光强度值的增 大（噪声信号）。另外，在反转型扫描分子计数法的情况下，存在因背景光的强度波动引起 的光强度值的下降（下面，这种情况也称为噪声信号。）。因此，在时序光强度数据上进行 单个粒子的信号的检测时，首先，检测脉冲状的信号，然后检查所检测出的脉冲状的信号的 强度、时间宽度以及形状，只将符合在单个粒子通过光检测区域的情况下应该获得的信号 的强度、时间宽度以及形状的条件的信号判定为单个粒子的信号，除此以外的信号被判定 为噪声信号。
[0088] 然而，当单个粒子的信号的强度值变弱时，难以基于信号的强度、时间宽度以及形 状对单个粒子的信号和噪声信号进行辨别。特别是在观测对象粒子是发光粒子的情况下， 从发光粒子释放的光子数是微量的，并且光子是概率性地释放出的，因此光强度值的轮廓 实际上不会形成为图2的（B)所描绘那样的平滑的吊钟状，而如图3的（A)左边所例示的 那样是离散的。因而，如果从发光粒子释放的光子数变少，则该情况下的光强度数据上的信 号的强度、时间宽度以及形状（图3的（A)中）很难与不存在粒子而只存在噪声信号的光 强度数据（图3的（A)右边）的情况进行区分。另外，发光粒子的位置距光检测区域的大 致中心越远，从光检测区域中的发光粒子释放并被检测出的光的强度值越低（参照图3的 (D))，并且距光检测区域的大致中心越远，发光粒子的数量越多，因此难以与噪声信号区别 的粒子的信号数变大。同样的状况也在观测对象粒子是非发光粒子的反转型扫描分子计数 法中的背景光的光子数减少的情况下产生。
[0089] 在扫描分子计数法和反转型扫描分子计数法中，其精度和/或灵敏度随着光检测 区域的每一个某移动距离的粒子信号的检测精度和检测数越高而越高。然而，如上所述，当 为了增加粒子信号的检测数而降低信号的强度的判定基准值时，将噪声信号错误地判定为 粒子信号的可能性增大，当为了提高粒子信号的检测精度而将信号的强度的判定基准值增 大时，很多亮度低的粒子信号不会被检测出。因此，在本发明中，提出一种能够更高精度地 达成根据信号的强度、时间宽度以及形状难以与噪声信号区分的单个粒子的信号的检测的 新算法。
[0090] 2.单个粒子的信号的检测
[0091] 在时序光强度数据是光子计数数据的情况下，光强度值为每个BIN TIME的检测光 子数。因而，如图3的（A)示意性地例示的那样，光强度值沿时间轴方向离散地分布。在这 种情况下，亮度大的粒子信号受噪声信号的影响少而具有大致吊钟状的轮廓（左图），但是 亮度小的粒子信号的强度值与噪声信号大致相同，并且由于噪声信号叠加（中图），因此难 以抽出大致吊钟状的轮廓，从而难以与没有粒子、只存在噪声信号的时间区域（右图）相区 分。然而，在存在亮度小的粒子信号的时间区域和只存在噪声信号的时间区域中，检测出光 子的事件（光子数为1以上的事件）的产生频率和图案存在差异。即，如从图中也可理解 的那样，在噪声信号的情况下，总是随机地产生光子检测事件，与此相对地，在粒子信号的 情况下，光子检测事件在时间上是集中的，特别是具有其中央附近的强度值变高的倾向。在 非发光粒子的信号与背景光的波动之间也观察到同样的现象。
[0092] 这样，在本发明中，着眼于所述的光子检测事件的产生频率和图案的差异，尝试选 择性地检测粒子信号。为此，在本发明的新的用于检测单个粒子的信号的算法中，对于时序 光强度数据上的每个规定的时间宽度的光强度值的时间变化（光子数列），计算在假定为 在光检测区域内存在粒子的情况下产生上述光强度值的时间变化的概率（产生概率（存在 粒子时）、第二产生概率）以及在假定为在光检测区域内不存在粒子的情况下产生上述光 强度值的时间变化的概率（产生概率（不存在粒子时）、第一产生概率）。然后，估计为提 供高的产生概率的状态是实际的状态。
[0093] 更具体地说，首先，参照图3的（B)，在时序光强度数据上设定任意的时间宽度的 区间（以下称为解析窗。）。该解析窗具有在每个单位时间（通常可以是BIN TIME。）ti(i =1，2,…以下相同）检测出的光子数Ci。另外，考虑在各单位时间内产生的光子检测事件 的数量依照该单位时间内的具有预期值的泊松分布，因此通过下式提供在任意的单位时间 ti中成为检测光子数Ci的概率（单位时间产生概率）。
[0094] [数 1]
[0095]

【权利要求】
1. 一种光分析装置，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中分 散并随机运动的单个粒子，该光分析装置的特征在于，包括： 光检测区域移动部，其使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 光检测部，其检测来自上述光检测区域的光；以及 信号处理部，其生成一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边由上述 光检测部检测出的来自上述光检测区域的光的按时间序列的光强度数据，在上述按时间序 列的光强度数据上逐个地检测表示各个上述单个粒子的存在的信号， 其中，上述信号处理部计算在上述按时间序列的光强度数据上按时间序列设定的各个 解析窗中的光强度值的时间变化的、假定为在上述光检测区域内不存在上述单个粒子的第 一状态的情况下的第一产生概率和假定为在上述光检测区域内存在上述单个粒子的第二 状态的情况下的第二产生概率，根据上述第一产生概率和上述第二产生概率，在上述按时 间序列的光强度数据上检测表示各个上述单个粒子的存在的信号。
2. 根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述第一产生概率和上述第二产生概率分别是根据上述解析窗内的每个单位时间的 光强度值和假定为上述第一状态和上述第二状态的情况下的上述每个单位时间的预期值 而计算出的。
3. 根据权利要求2所述的光分析装置，其特征在于， 设上述每个单位时间的光强度值依照具有上述每个单位时间的上述预期值的泊松分 布来计算上述每个单位时间的光强度值的单位时间产生概率，上述第一产生概率和上述第 二产生概率分别是利用对应的上述单位时间产生概率而计算出的。
4. 根据权利要求1?3中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 在上述第二产生概率大于上述第一产生概率的解析窗的时间内判定为在上述光检测 区域内存在上述单个粒子。
5. 根据权利要求1所述的光分析装置，其特征在于， 上述单个粒子具有规定的特性值，上述光检测部分别检测来自上述光检测区域的光 的至少两个互不相同的成分，上述信号处理部生成各个上述成分的按时间序列的光强度数 据，并且，上述信号处理部计算各个上述成分的上述第一产生概率和上述第二产生概率，各 个上述成分的上述第二产生概率是上述规定的特性值的函数，根据每个上述成分的上述第 一产生概率和上述第二产生概率的产生概率，在上述按时间序列的光强度数据上检测表示 具有上述规定的特性值的上述单个粒子的存在的信号。
6. 根据权利要求5所述的光分析装置，其特征在于， 上述单个粒子包含具有互不相同的规定的特性值的多个种类的单个粒子，按上述单个 粒子的每个种类计算作为上述互不相同的规定的特性值的函数的各个上述成分的上述第 二产生概率，根据各个上述成分的上述第一产生概率和上述多个种类的各个单个粒子的各 个上述成分的上述第二产生概率，在上述按时间序列的光强度数据上，按上述单个粒子的 每个种类检测表示该单个粒子的存在的信号。
7. 根据权利要求1?6中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述单个粒子是发光粒子，表示各个上述单个粒子的存在的信号为光强度的暂时性的 增大。
8. 根据引用权利要求5或6的权利要求7所述的光分析装置，其特征在于， 上述规定的特性值是上述单个粒子的偏振各向异性。
9. 根据引用权利要求5或6的权利要求7所述的光分析装置，其特征在于， 上述规定的特性值是上述单个粒子的互不相同的发光波长频带的发光强度之比。
10. 根据权利要求1?4中的任一项所述的光分析装置，其特征在于， 上述单个粒子是在检测波长频带不发光的粒子，来自上述光检测区域的光包含背景 光，表示各个上述单个粒子的存在的信号为来自上述背景光的光强度的暂时性的下降。
11. 一种光分析方法，使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测在样本溶液中 分散并随机运动的单个粒子，该光分析方法的特征在于，包括以下过程： 使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边测量来自上述光检测区域 的光的强度并生成光强度数据； 计算在按时间序列的上述光强度数据上按时间序列设定的各个解析窗中的光强度值 的时间变化的、假定为在上述光检测区域内不存在上述单个粒子的第一状态的情况下的第 一产生概率和假定为在上述光检测区域内存在上述单个粒子的第二状态的情况下的第二 产生概率；以及 根据上述第一产生概率和上述第二产生概率，在按时间序列的上述光强度数据上检测 表示各个上述单个粒子的存在的信号。
12. 根据权利要求11所述的光分析方法，其特征在于， 上述第一产生概率和上述第二产生概率分别是根据上述解析窗内的每个单位时间的 光强度值和假定为上述第一状态和上述第二状态的情况下的上述每个单位时间的预期值 而计算出的。
13. 根据权利要求12所述的光分析方法，其特征在于， 设上述每个单位时间的光强度值依照具有上述每个单位时间的上述预期值的泊松分 布来计算上述每个单位时间的光强度值的单位时间产生概率，上述第一产生概率和上述第 二产生概率分别是利用对应的上述单位时间产生概率而计算出的。
14. 根据权利要求11?13中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 在上述第二产生概率大于上述第一产生概率的解析窗的时间内判定为在上述光检测 区域内存在上述单个粒子。
15. 根据权利要求11所述的光分析方法，其特征在于， 上述单个粒子具有规定的特性值，分别检测来自上述光检测区域的光的至少两个互不 相同的成分，生成各个上述成分的按时间序列的光强度数据，并且，计算各个上述成分的上 述第一产生概率和上述第二产生概率，各个上述成分的上述第二产生概率是上述规定的特 性值的函数，根据每个上述成分的上述第一产生概率和上述第二产生概率的产生概率，在 上述按时间序列的光强度数据上检测表示具有上述规定的特性值的上述单个粒子的存在 的信号。
16. 根据权利要求15所述的光分析方法，其特征在于， 上述单个粒子包含具有互不相同的规定的特性值的多个种类的单个粒子，按上述单个 粒子的每个种类计算作为上述互不相同的规定的特性值的函数的各个上述成分的上述第 二产生概率，根据各个上述成分的上述第一产生概率和上述多个种类的各个单个粒子的各 个上述成分的上述第二产生概率，在上述按时间序列的光强度数据上，按上述单个粒子的 每个种类检测表示该单个粒子的存在的信号。
17. 根据权利要求11?16中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 上述单个粒子是发光粒子，表示各个上述单个粒子的存在的信号为光强度的暂时性的 增大。
18. 根据引用权利要求15或16的权利要求17所述的光分析方法，其特征在于， 上述规定的特性值是上述单个粒子的偏振各向异性。
19. 根据引用权利要求15或16的权利要求17所述的光分析方法，其特征在于， 上述规定的特性值是上述单个粒子的互不相同的发光波长频带的发光强度之比。
20. 根据权利要求11?14中的任一项所述的光分析方法，其特征在于， 上述单个粒子是在检测波长频带不发光的粒子，来自上述光检测区域的光包含背景 光，表示各个上述单个粒子的存在的信号为来自上述背景光的光强度的暂时性的下降。
21. -种光分析用计算机程序，用于使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统检测 在样本溶液中分散并随机运动的单个粒子，该光分析用计算机程序使计算机执行以下步 骤： 使上述光学系统的光检测区域的位置在上述样本溶液内移动； 一边使上述光检测区域的位置在上述样本溶液内移动一边测量来自上述光检测区域 的光的强度并生成光强度数据； 计算在按时间序列的上述光强度数据上按时间序列设定的各个解析窗中的光强度值 的时间变化的、假定为在上述光检测区域内不存在上述单个粒子的第一状态的情况下的第 一产生概率和假定为在上述光检测区域内存在上述单个粒子的第二状态的情况下的第二 产生概率；以及 根据上述第一产生概率和上述第二产生概率，在按时间序列的上述光强度数据上检测 表示各个上述单个粒子的存在的信号。
22. 根据权利要求21所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 上述第一产生概率和上述第二产生概率分别是根据上述解析窗内的每个单位时间的 光强度值和假定为上述第一状态和上述第二状态的情况下的上述每个单位时间的预期值 而计算出的。
23. 根据权利要求22所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 设上述每个单位时间的光强度值依照具有上述每个单位时间的上述预期值的泊松分 布来计算上述每个单位时间的光强度值的单位时间产生概率，上述第一产生概率和上述第 二产生概率分别是利用对应的上述单位时间产生概率而计算出的。
24. 根据权利要求21?23中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 在上述第二产生概率大于上述第一产生概率的解析窗的时间内判定为在上述光检测 区域内存在上述单个粒子。
25. 根据权利要求21所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 上述单个粒子具有规定的特性值，分别检测来自上述光检测区域的光的至少两个互不 相同的成分，生成各个上述成分的按时间序列的光强度数据，并且，计算各个上述成分的上 述第一产生概率和上述第二产生概率，各个上述成分的上述第二产生概率是上述规定的特 性值的函数，根据每个上述成分的上述第一产生概率和上述第二产生概率的产生概率，在 上述按时间序列的光强度数据上检测表示具有上述规定的特性值的上述单个粒子的存在 的信号。
26. 根据权利要求25所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 上述单个粒子包含具有互不相同的规定的特性值的多个种类的单个粒子，按上述单个 粒子的每个种类计算作为上述互不相同的规定的特性值的函数的各个上述成分的上述第 二产生概率，根据各个上述成分的上述第一产生概率和上述多个种类的各个单个粒子的各 个上述成分的上述第二产生概率，在上述按时间序列的光强度数据上，按上述单个粒子的 每个种类检测表示该单个粒子的存在的信号。
27. 根据权利要求21?26中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 上述单个粒子是发光粒子，表示各个上述单个粒子的存在的信号为光强度的暂时性的 增大。
28. 根据引用权利要求25或26的权利要求27所述的光分析用计算机程序，其特征在 于， 上述规定的特性值是上述单个粒子的偏振各向异性。
29. 根据引用权利要求25或26的权利要求27所述的光分析用计算机程序，其特征在 于， 上述规定的特性值是上述单个粒子的互不相同的发光波长频带的发光强度之比。
30. 根据权利要求21?24中的任一项所述的光分析用计算机程序，其特征在于， 上述单个粒子是在检测波长频带不发光的粒子，来自上述光检测区域的光包含背景 光，表示各个上述单个粒子的存在的信号为来自上述背景光的光强度的暂时性的下降。
【文档编号】G01N15/14GK104115001SQ201380009765
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年2月4日 优先权日:2012年2月17日
【发明者】田边哲也 申请人:奥林巴斯株式会社