一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法【专利摘要】一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法，涉及抗氧化剂。利用Caco-2细胞模型，通过优化细胞的接种浓度和培养时间，荧光探针（2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐，简称DCFH-DA）、自由基引发剂（2,2’-偶氮二异丁基脒，简称AAPH）和抗氧化剂纯品与Caco-2细胞的孵育条件，建立一种基于Caco-2单层细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性细胞学定量评价方法，具有生物相关性高、简单、快速的优点，为生物抗氧化剂的研究提供一个有效的分析评价工具。【专利说明】—种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及抗氧化剂,尤其是涉及一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法。【
背景技术：
】[0002]流行病学和临床实验研究已证明，人体自由基过剩是引发心血管病、癌症和衰老等慢性退行性疾病的重要因素，而饮食摄入和补充抗氧化剂是预防这些疾病的有效途径。因此，对抗氧化剂的抗氧化活性进行评价一直是营养保健食品研究的热门领域。迄今抗氧化剂活性评价方法主要包括体外化学分析法、动物实验法和人体试食试验法三大类。体外化学方法操作简单、快速、分析成本低，但测定结果不能真实反映抗氧化剂在体内的抗氧化能力，因为体外化学法是在试管化学分析的基础上建立的，没有考虑到抗氧化剂在体内的消化、吸收和代谢特性。动物实验法或人体试食法可真实反映抗氧化剂在体内的实际抗氧化能力，但是这些方法评价时间长，耗药量大，评价成本高，不适用于抗氧化剂筛选研究的初始阶段。因此，建立一种简单、快速和高生物相关性的抗氧化活性体外定量评价方法是抗氧化研究领域亟待突破的关键科学问题。[0003]2007年康奈尔大学WolfeandLiuCffolfe,K.L.;Liu,R.H.Cellularantioxidantactivity(CAA)assayforassessingantioxidants,foods,anddietarysupplements.J.Agric.FoodChem.2007,55(22)，8896-8907)建立了一种基于人肝癌细胞IfepG2模型的细胞学抗氧化活性(CAA)定量分析方法，用来检测抗氧化剂的抗氧化活性。该方法的问题在于所选用细胞模型不能反映抗氧化剂在肠道的吸收特性，且迄今未见该方法的生物相关性研究报道。因此，测定结果是否能预测抗氧化剂在体内的实际功效仍然存在很大的疑问。2008年加拿大NIS实验室Jensen(Jensen,G.S.Cell-basedantioxidantprotectionassay.U.S.Provisionalpatentapplication.60/985,166)建立了基于人血液红细胞模型的抗氧化活性评价方法，由于每次测定前都要收集和制备人血红细胞，操作过程复杂，限制了其实用价值。2009年魁北克大学Girard-Lalancette等(KarlGirard-Lalancette;AndrePichette;JeanLegault.Sensitivecell-basedassayusingDCFHoxidationforthedeterminationofpro—andantioxidantpropertiesofcompoundsandmixtures:Analysisoffruitandvegetablejuices.FoodChem.2009，115，720-726)建立了基于小鼠成纤维母细胞瘤(L929)细胞模型的抗氧化分析方法，将测定点设置在自由基作用于细胞90分钟这一时间点，因而方法重复性差，误差较大。[0004]大量研究证明，来源于人结肠腺癌Caco-2细胞株，其细胞形态学、标志酶、体外培养条件下形成的微绒毛结构以及紧密连接和渗透特征等均与小肠上皮细胞类似，利用该细胞的单层模型进行药物体外吸收特性研究与药物口服在小肠中的吸收过程有良好的相关性，因此Caco-2细胞模型被认为是一种预测药物吸收的有效体外工具。目前已被广泛用于药物和营养物质体外吸收、代谢特性研究。目前国内外还未见有关利用该细胞模型建立一种抗氧化活性体外定量分析方法的研究报道。【
发明内容】[0005]本发明的目的在于提供一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法。[0006]本发明包括以下具体步骤:[0007]I)将100?200L的Caco-2单细胞悬浮液按IXIO4?IXIO5个细胞/孔的浓度接种至透明平底黑色96微孔细胞培养板中培养；[0008]2)将步骤I)的96微孔板中生长培养基移出，用100?200L1XPBS清洗贴壁细胞；[0009]3)用含有20?100MDCFH-DA的抗氧化剂处理培养基配制6个不同浓度的抗氧化剂溶液；[0010]4)将步骤3)得到的抗氧化剂溶液100?200L加入步骤I)的96微孔板中，记为样品孔，孵育，对照孔和空白孔为只含有20?100MDCFH-DA的抗氧化剂处理培养基处理的细胞孔，每个样品、对照和空白各3个重复孔；[0011]5)将步骤4)的96微孔板中溶液移出，用100?200L1XPBS清洗贴壁细胞；[0012]6)向步骤5)的样品孔和对照孔中加入100?200L含有200?800MAAPH的氧化剂处理培养基，空白孔加入100?200L氧化剂处理培养基；[0013]7)用荧光酶标仪测定步骤6)中96微孔板中各孔的荧光强度；[0014]8)根据步骤7)做出各样品孔和对照孔荧光强度一时间曲线，计算各种抗氧化剂的细胞学抗氧化活性，用槲皮素作标准品，各抗氧化剂样品的细胞学抗氧化活性值用mol槲皮素当量/IOOg(或mol)样品表示。[0015]在步骤I)中,所述Caco-2单细胞悬浮液悬浮在生长培养基中；所述Caco_2单细胞在10?40代之间；所述生长培养基的配方可为:高糖DMEM中含有10%胎牛血清(FBS)、IOmMHepes缓冲液、1%非必需氨基酸、100U/mL青霉素和100g/mL链霉素；所述培养的条件可在37°C，5%C02培养12?48h。[0016]在步骤2)中，所述用100?200L1XPBS清洗贴壁细胞可清洗I?2次。[0017]在步骤3)中，所述抗氧化剂处理培养基的配方可为含IOmMHepes的DMEM培养基，所使用的DCFH-DA为溶解于甲醇中配制成的20mMDCFH-DA贮液，分装并贮存于_20°C;抗氧化剂样品使用前需用抗氧化剂处理培养基进一步进行稀释成不同的浓度梯度，若抗氧化剂样品需用DMSO或甲醇等有机溶剂溶解，则其终溶液中DMSO或甲醇等有机溶剂含量<0.5%，若抗氧化剂样品需用去离子水溶解，则其终溶液中去离子水用量<5%。[0018]在步骤4)中，所述孵育的条件可为37°C，5%C02孵育10?60min；[0019]所述样品、空白和对照在96微孔板中的分布可如表I所示:[0020]表I【权利要求】1.一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法，其特征在于包括以下具体步骤:1)将100~200L的Caco-2单细胞悬浮液按1X1O4~1X1O5个细胞/孔的浓度接种至透明平底黑色96微孔细胞培养板中培养；2)将步骤I)的96微孔板中生长培养基移出，用100~200L1XPBS清洗贴壁细胞；3)用含有20~100MDCFH-DA的抗氧化剂处理培养基配制6个不同浓度的抗氧化剂溶液；4)将步骤3)得到的抗氧化剂溶液100~200L加入步骤I)的96微孔板中，记为样品孔，孵育，对照孔和空白孔为只含有20~100MDCFH-DA的抗氧化剂处理培养基处理的细胞孔，每个样品、对照和空白各3个重复孔；5)将步骤4)的96微孔板中溶液移出，用100~200L1XPBS清洗贴壁细胞；6)向步骤5)的样品孔和对照孔中加入100~200L含有200~800MAAPH的氧化剂处理培养基，空白孔加入100~200L氧化剂处理培养基；7)用荧光酶标仪测定步骤6)中96微孔板中各孔的荧光强度；8)根据步骤7)做出各样品孔和对照孔荧光强度一时间曲线，计算各种抗氧化剂的细胞学抗氧化活性，用槲皮素作标准品，各抗氧化剂样品的细胞学抗氧化活性值用mol槲皮素当量/100g(或mol)样品表示。2.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法，其特征在于在步骤I)中，所述Caco-2单细胞悬浮液悬浮在生长培养基中；所述Caco-2单细胞在10~40代之间；所述生长培养基的配方可为:高糖DMEM中含有10%胎牛血清、IOmMHepes缓冲液、1%非必需氨基酸、100U/mL青霉素和100g/mL链霉素；所述培养的条件可在37°C，5%C02培养12~48h。3.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法，其特征在于在步骤2)中，所述用100~200L1XPBS清洗贴壁细胞是清洗I~2次。4.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法，其特征在于在步骤3)中，所述抗氧化剂处理培养基的配方为含IOmMHepes的DMEM培养基，所使用的DCFH-DA为溶解于甲醇中配制成的20mMDCFH-DA贮液，分装并贮存于_20°C;抗氧化剂样品使用前需用抗氧化剂处理培养基进一步进行稀释成不同的浓度梯度，若抗氧化剂样品需用DMSO或甲醇溶解，则其终溶液中DMSO或甲醇含量≤0.5%，若抗氧化剂样品需用去离子水溶解，则其终溶液中去离子水用量≤5%。5.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法，其特征在于在步骤4)中，所述孵育的条件为37°C，5%C02孵育10~60min。6.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法，其特征在于在步骤4)中，所述样品、空白和对照在96微孔板中的分布如表1所示:表17.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法，其特征在于在步骤5)中，所述用100~200L1XPBS清洗贴壁细胞是清洗I~2次。8.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法，其特征在于在步骤6)中，所述氧化剂处理培养基的组成为含IOmMHepes的HBSS缓冲液；所使用的AAPH为溶解于水中配制成200mMAAPH贮液，分装并贮存于_40°C。9.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法，其特征在于在步骤7)中，所述用荧光酶标仪测定步骤6)中96微孔板中各孔的荧光强度持续测定60~120min，每5min读数I次，测定条件:37°C，激发波长485nm，发射波长538nm。10.如权利要求1所述一种基于Caco-2细胞模型的抗氧化剂抗氧化活性定量评价方法，其特征在于在步骤8)中，所述细胞学抗氧化活性值的计算方法如下:根据步骤7)样品孔和对照孔的各测定时间点荧光值减去空白孔荧光值后，做出各样品孔和对照孔荧光强度一时间曲线，积分荧光曲线下面积，作出AUC—样品浓度曲线，用AUC计算抗氧化剂的EC5tl值，EC50是抗氧化剂样品在Caco-2细胞内对自由基抑制活性达到50%效果时的有效浓度；【文档编号】G01N21/64GK103760144SQ201410022545【公开日】2014年4月30日申请日期:2014年1月17日优先权日:2014年1月17日【发明者】刘冬,孙海燕,万红霞,李艳,从彦丽,唐旭蔚申请人:深圳职业技术学院