生物传感器及使用生物传感器的测定方法
【专利摘要】生物传感器（100）是一种用于测量样品中第一和第二底物的浓度的生物传感器，该生物传感器包括传感单元（101），该传感单元（101）包括绝缘基板（111）、在所述绝缘基板（111）上的电极（116）以及在所述电极（116）上的反应层（114）；用于测量时间的计时单元（103）；以及计算单元（105），其中，所述反应层（114）含有用于将所述第一底物转化为第二底物的第一酶，以及作用于所述第二底物或通过进一步转化第二底物而获得的转化的底物的第二酶，并且所述计算单元（105）根据所述传感单元（101）在第一时间测得的第一电流值和所述传感单元（101）在第二时间测得的第二电流值计算所述样品中的第一底物和第二底物的浓度。
【专利说明】生物传感器及使用生物传感器的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物传感器和使用该生物传感器的测定方法。
【背景技术】
[0002]与生物传感器相关的技术在公布号2010-54379的日本公开专利申请中有描述。公布号2010-54379的日本公开专利申请中描述了能够通过电化学的方法检测样品中的底物与氧化还原酶的反应从而测定底物浓度的生物传感器，并且还描述了通过上述成果可以设计出标准范围，该范围是通过准确地测定在理想范围内的底物浓度而得到的根据包含在样品中的底物浓度的理想范围。
[0003]另夕卜，关于蔗糖传感器的技术在公布号2001-174432、H06-88805 (1994)和H09-229895 (1997)的日本公开专利申请中有描述。在这些文献中，公布号H09-229895(1997)的日本公开专利描述了一种测定葡萄糖、果糖和蔗糖的总含量的技术。
[0004]关于胆固醇传感器的技术包括在日本重公开的WOO1/038862、国内公布号2009-520974的日本专利、国内公布号2009-537020的日本专利、公布号H10-232219 (1998)的H本公开专利、公布号Hl 1-51896 (1999)的日本公开专利、公布号Hl 1-2618 (1999)的日本公开专利、公布号2005-83965的日本公开专利中有描述。其中，国内公布号2009-520974的日本专利描述了通过提供第一至第三的电化学电池来测定样品中总胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇的含量。而且，国内公布号2009-537020的日本专利描述了用于进行HDL胆固醇测试的第一电池和用于进行总胆固醇测试的第二电池的应用。
[0005]公布号H08-338826 (1996)的日本公开专利和H08-336399 (1996)的日本公开专利中描述了具有精氨酸传感器和尿素传感器的传感器测定含有精氨酸和尿素的样品中的精氨酸的含量的应用。
[0006]而且，公布号H11-271258 (1999)的日本公开专利中描述了涉及包括配置单个的传感器于其中的复合传感器(multiple-sensors)的技术，该个别的传感器可以分别用于测定Na+、葡萄糖和尿素。
【发明内容】
[0007]然而，上述文献描述的传统的技术仍然需要改进，以便获得简便和稳定的能够测定样品中含有的多种底物的浓度的测量方法。以公布号2001-174432的日本公开专利、公布号H06-88805(1994)的日本公开专利和公布号H09-229895 (1997)的日本公开专利中描述的蔗糖传感器为例，采用这些蔗糖传感器难以简便地测定含有葡萄糖和蔗糖的样品中的葡萄糖和蔗糖的各自的浓度。
[0008]根据本发明的一个方面，提供了一种用于测定样品中第一底物和第二底物的浓度的生物传感器，该生物传感器包括:传感单元，该传感单元包括基板、提供在所述基板上的电极以及提供在所述电极上的反应层；用于测量时间的计时单元；以及计算单元；其中，所述反应层包括用于将所述第一底物转化为所述第二底物的第一酶，以及作用于所述第二底物或作用于通过进一步转化所述第二底物而获得的转化的底物的第二酶；并且其中，所述计算单元根据所述传感单元在第一时间测得的第一电流值和所述传感单元在第二时间测得的第二电流值，分别计算出所述样品中的所述第一底物和所述第二底物的浓度。
[0009]根据本发明的另一个方面，提供了一种采用前文提及的根据本发明的生物传感器测定样品中的第一底物和第二底物的浓度的方法，该方法包括:在所述传感单元中在第一时间测定(detected)获得(acquiring)第一电流值；在所述传感单元中在第二时间测定获得第二电流值；并且根据所述第一电流值和所述第二电流值，分别计算出所述样品中的第一底物的浓度和第二底物的浓度。
[0010]除上述情况外，每种本发明的组成或分类的变换的任何组合，例如处理过程、单元、单元的使用方法以及诸如此类，都在本发明的范围之内。
[0011]例如，提供了通过前文提及的根据本发明的生物传感器测定样品中的第一和第二底物浓度的应用。
[0012]根据本发明，可以简便且稳定地测定样品中含有的多种底物的浓度。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]本发明的以上的和其他的目的、优点和特征将在以下确定的优选实施方式和其结合的附图的描述中变得更加清楚，其中:
[0014]图1:示意性地示出了一种【具体实施方式】中的生物传感器的结构的方框图；
[0015]图2:示出了一种【具体实施方式】中的生物传感器中的传感单元的结构的截面图；
[0016]图3:示出了一种【具体实施方式】中的生物传感器中的传感单元的结构的平面图；
[0017]图4:示出了一种【具体实施方式】中的生物传感器中的传感单元的结构的截面图；
[0018]图5:示出了一种【具体实施方式】中的生物传感器中的传感单元的结构的透视图；
[0019]图6:包括实施例中应用生物传感器的电流值的测定结果的图；以及
[0020]图7:包括实施例中应用生物传感器的电流值的测定结果的图；
[0021]图8:蔗糖的反应路线图；
[0022]图9:麦芽糖的反应路线图；
[0023]图10:乳糖的反应路线图；
[0024]图11:代表当第一底物为海藻糖且第二底物为葡萄糖时示出的反应路线图；
[0025]图12:蜜三糖的反应路线图；
[0026]图13:末端为谷氨酸的肽的反应路线图；
[0027]图14:胆固醇酷的反应路线图；
[0028]图15:尿素的反应路线图；
[0029]图16:肌酸酐的反应路线图；
[0030]图17:胱硫醚的反应路线图。
【具体实施方式】
[0031]以下通过对【具体实施方式】的说明来描述本发明。本领域技术人员应该知道，根据本发明的教导还有多种替代的实施方式可以实现本发明，并且本发明并不限于以下以说明为目的的【具体实施方式】。[0032]根据本发明的典型的实施方式将结合附图在下文中进行详细的描述。在附图中，相同的数字指定为相同的结构部件，因而不再出现重复的描述。
[0033](第一种实施方式)
[0034]图1示意性地示出了一种【具体实施方式】中的生物传感器的结构的方框图。图1中示出的生物传感器100是能够测定样品中的第一底物和第二底物的浓度的生物传感器。该生物传感器100包括传感单元101、计时单元103和计算单元105。
[0035]图2和图3示出了传感单元101的结构。图3示出了传感单元101的结构的平面图，以及图2是沿着图3中的线A-A’的截面图。该传感单元101包括基板(绝缘基板111)、在该绝缘基板111上的电极116和在该电极116上的反应层114。
[0036]陶瓷、塑料、硅、氧化铝玻璃板或者大分子材料可以用于制备该绝缘基板111。优选地，可以采用合成树脂例如聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氯乙烯和聚碳酸酯等的板。
[0037]该电极116可以采用例如双极电极或由工作电极112和对电极113组成的二电极系统。工作电极112和对电极113由导电材料形成。该导电材料为典型的碳素或金属材料例如钯、银、钼、金、铜、镍以及它们的合金等。
[0038]或者，该电极116可以采用三极电极或如图2和图3所示的由工作电极112、对电极113和参比电极115组成的三电极系统。采用三电极系统可以稳定地获得响应电流从而使得测量精确度稳定化。参比电极115也是由与工作电极112和对电极113相似的导电材料形成。
[0039]上述所有的电极可以采用相同的材料制得，也可以采用不同的材料制得各自的电极。上述电极可以由单一种类的导电材料制得，也可以由两种或多种种类的导电材料制得。只要能够获得稳定的响应电流，从而使得精确度更稳定。
[0040]工作电极112、对电极113和参比电极115可以通过例如采用丝网印刷术(screenprinting)、派射法或气相沉积法制备以便涂布到所述绝缘基板111上。
[0041]此外，电极116设置有表面覆盖有绝缘膜130的绝缘区域，覆盖有反应层114的测量区域，以及用于外加电压的外加区域(applying region)。在该外加区域中，电极116的
表面是暴露的。
[0042]同样地，电极116具有唯一的工作电极112，以及提供在该工作电极112上的反应层 114。
[0043]反应层114具有用于将所述第一底物转化为第二底物的第一酶，以及作用于所述第二底物或通过进一步转化所述第二底物而获得的转化的底物的第二酶。在图2和图3中，设置反应层114从而使得与电极116相互接触。
[0044]所述第一酶例如可以是水解酶。同样地,所述第二酶例如可以是氧化还原酶。关于第一和第二酶以及第一和第二底物的具体例子和组合将在之后进行讨论。
[0045]或者，所述反应层114还可以含有除第一和第二酶以外的酶。例如，所述反应层114还可以含有第三酶，该第三酶可以用于将第二底物转化为其转化的物质，从而第二酶可以作用于上述由第二底物转化的物质。
[0046]所述反应层114中的第一酶和第二酶的含量并没有特别的限定，可以根据需要选择合适的含量。
[0047]例如，当采用蔗糖酶作为第一酶时，优选其含量为0.001-10单元/μ L。其中，“I单元(unit) ”是指在I分钟内将I μ mo I的底物成功水解所需要的水解酶的量。
[0048]同样地，当采用氧化还原酶葡萄糖氧化酶(GOx)作为第二酶时，优选其含量为
0.1-50单元/ μ L。其中，“I单元”是指在I分钟内将I μ mo I的底物成功氧化所需要的氧化还原酶的量。
[0049]同时，所述反应层114的厚度也并没有限定，从减少用于测量的样品的量的角度来说，该厚度优选为0.01-10 μ m，例如在样品为血液等情况下，该厚度更优选为
0.025-10 μ m,并进一步优选为 0.05-5 μ m。
[0050]设置计时单元103以测量时间。
[0051]计算单元105需要计时单元103测量的时间。该计算单元105还需要传感单元101测量的电流值。反过来，该计算单元105根据计时单元103和传感单元101获得的数据进行计算。
[0052]具体地，计算单元105根据由传感单元101在第一时间(Tl)测定的第一电流值
(Il)和由传感单元101在第二时间(T2)测定的第二电流值(12)分别计算样品中的第一底物的浓度和第二底物的浓度。
[0053]更具体地，计算单元105根据Il计算样品中第二底物的浓度，还根据12和Il之间的差值(12-11)计算样品中第一底物的浓度。
[0054]典型的测量用样品包括:生物体液如血液、尿液、唾液、汗液、泪水等；
[0055]食物如果汁、汤等；
[0056]细胞培养基；
[0057]发酵样品(食物或非食物)；以及
[0058]工业产品和食物添加剂如聚氨基酸、二糖至多糖等。固体食物也可以用作为测量对象，只要该用于测量的对象可以通过从水溶液等中便于提取即可。
[0059]接着，将对应用生物传感器100的测量方法的具体实例进行描述。
[0060]本发明的具体实例的测量方法包括，例如，采用如下步骤:
[0061]在传感单元101中在时间Tl测定获得电流值Il ；
[0062]在传感单元101中在时间T2测定获得电流值12 ;以及
[0063]根据Il和12分别计算样品中的第一底物的浓度和第二底物的浓度。
[0064]以下将结合实施例中的生物传感器进行说明，该生物传感器能够用于测量含有葡萄糖和蔗糖的样品中的葡糖糖和蔗糖的浓度。在该实施例中，第一底物为蔗糖，第二底物为葡萄糖。
[0065]图8代表当第一底物为蔗糖且第二底物为葡萄糖时示出的反应实施例的公式。另夕卜，以下图8中的“FAD”是黄素腺嘌呤二核苷酸的缩写。
[0066]在图8中，作为第一底物的蔗糖通过与作为第一酶的蔗糖酶呋喃果糖苷酶)反应被分解为葡萄糖(a -D-葡萄糖)和果糖。
[0067]此外，a-D-葡萄糖通过与作为第三酶的变旋酶(mutarotase)反应转化为β-D-葡萄糖。作为第二酶的葡萄糖氧化酶(即图8中的“GOx”)与由a-D-葡萄糖转化的物质β-D-葡萄糖反应引发了接下来的反应。
[0068]更具体地，通过DC电源(未显示)给工作电极112应用DC电压，使在葡萄糖氧化酶的作用下将葡萄糖氧化，从而转变为葡萄糖酸酯并同时产生过氧化氢，正如下述反应式(I )所示。
[0069]葡萄糖(C6H12O6)+O2—葡萄糖酸酯(C6HltlO6)+H2O2 ( I )
[0070]如反应式(I )所示，GOx通过GOx的催化反应以使得测量的样品中的葡萄糖被氧化为葡萄糖酸而被还原。给传感单元101中的工作电极112接通电压以使得GOx (还原型)氧化为G0x(氧化型)。通过测定由反应式(I )中所示的反应引起的电流的变化以测定样品中的葡萄糖的含量。
[0071]此外，由溶解在样品中的氧气产生的过氧化氢将在电极上被氧化，同时也测定氧化的电流值以获得葡萄糖的浓度。此时，由反应式(I )产生的过氧化氢在工作电极112上通过电极反应被氧化以产生电子，如下述反应式(II )所示。
[0072]H2O2 — 2H++02+2e ( II )
[0073]在反应式(II )中，通过过氧化氢反应产生的电子使得电流由工作电极112流向对电极113。然后，该电流将在用于检测电流的回路(未显示)中被测定，计算单元105处理测得的电流以确定样品中葡萄糖的浓度。此次，为了连续地维持工作电极112和参比电极115之间的电势，需适当地控制对电极113的电势。
[0074]同时，当采用传统的传感器例如测量具体的底物如蔗糖的生物传感器来测量多种底物的浓度时，可以采用间接测量底物的方法，即先将底物用酶进行一次分解，再测量分解后的产物(葡萄糖或果糖)。然而，当样品中原本就含有分解后的产物时，在这种情况下测得的电流值是合算值(added value)，也因此该方法不能实现单独的对底物的检测。例如，就葡萄糖而言，所得的葡萄糖或果糖的合算值就是样品中原本含有的葡萄糖或果糖以及由酶反应产生的。因此，样品中原本含有的物质，如上述例子中的葡萄糖和果糖，需要分别地测量。然而，使用传统的生物传感器难以简便地同时测定两种物质，因此需要采用分开的生物传感器用于分别测量底物的浓度。
[0075]相反地，在本【具体实施方式】中的测定方法通过使用生物传感器100中的同一传感单元101，基于在时间Tl和T2获得的电流测量值的信息，可以在两个不同的时间Tl和T2获得两种或两种以上底物的浓度，从而使得对底物的浓度的大量的测量可以通过简便且容易的方式稳定地进行。
[0076]例如，当采用生物传感器100测定含有葡萄糖的样品时，与葡萄糖的浓度有关的电流值在开始测量(TO)之后的时间Tl获得。另外，当测定含有蔗糖的样品时，与蔗糖浓度有关的电流值从Tl起一段时间后的T2时获得。更进一步地，由蔗糖产生的葡萄糖成分的电流值是样品中含有的葡萄糖和蔗糖的合算值，不同于葡萄糖的响应电流值的情况。
[0077]如上所述，计算单元105通过Tl测得的电流值Il (来自样品中原本含有的葡萄糖)计算葡萄糖的浓度。进一步地，例如，假定时间T2测得的电流值是来自蔗糖产生的葡萄糖的电流值和来自样品中原本含有的葡萄糖的电流值的合算值，那么就可以通过与来自样品中的原本含有的葡萄糖的电流值之间的差值计算出样品的蔗糖的浓度。
[0078]例如，在含有蔗糖的标准样品的测定值中，计算单元105维持的蔗糖浓度和响应电流值之间的对应关系作为第一校准曲线数据。进一步地，例如，在含有葡萄糖的标准样品的测量值中，计算单元105维持的葡萄糖浓度和响应电流值之间的对应关系将作为第二校准曲线数据。在这种情况下，计算单元105可以根据第二校准曲线数据对照在Tl时的电流值Il计算得到葡萄糖的浓度，并且也可以根据第一校准曲线数据参考电流的差值(12-11)计算得到蔗糖的浓度。
[0079]随后，将对生物传感器100的制造方法进行说明。
[0080]首先，制备基板，再采用公知的方法如丝网印刷术、溅射法或气相沉积法等将工作电极112配置于基板上。随后，采用丝网印刷将绝缘糊实施于基板上以形成绝缘膜130，从而获得绝缘基板111。形成绝缘膜130以覆盖工作电极112的外周。设置对电极113和参比电极115以与工作电极112并列。
[0081]其后，含有第一和第二酶的反应层114形成于绝缘基板111上。更具体地，第一和第二酶通过在水性溶剂(aqueous solvent)中混合制备，随后将所得混合物涂布在绝缘基板111的表面上，并干燥所得涂布后的膜。所述干燥优选在不会使得氧化还原酶失活的温度下进行，可以为等于或低于酶的最适温度。生物传感器100就是通过上述步骤制备而得。
[0082]随后，将对采用上述生物传感器100测定样品溶液中含有的多种底物的浓度的方法进行说明。
[0083]首先，将测量样品加入到反应层114。该反应层114被外加的测量样品所溶解以促使样品中的底物和氧化还原酶之间的反应。为了促进反应的进行，待生物传感器100放置预定的时间后，给对立于对电极113的工作电极112的阳极方向加脉冲电压(O到+0.3V)。如此将产生响应电流，从而测定得到在时间点Tl和时间点T2的响应电流值。计算单元105将获取由传感单元在时间点Tl和时间点T2测定获得的电流值Il和12以计算第一底物和第二底物的浓度。计算单元105将分别参照与第一底物相关和与第二底物相关的校准曲线数据(通过使用含有已知浓度的底物的标准样品提前制备的)以根据响应电流值分别计算样品中的底物的浓度。该校准曲线数据可以是，例如与第一底物浓度或第二底物浓度有关的响应电流值和时间的数据。
[0084]采用生物传感器100可以通过仅采用一个传感器简便地获得样品中含有的多种底物的浓度。
[0085]当样品中含有第一底物和第二底物且第一底物是一种可以转化为第二底物的物质时，传统的传感器由于第二底物的存在所测得的响应电流值是叠加的，因此采用一个传感器难以分别测得样品中原本含有的第二底物的浓度和由第一底物新产生的第二底物的浓度。然而采用本【具体实施方式】中的生物传感器100就可以克服上述难题，第一底物的浓度和第二底物的浓度可以通过一次测量而获得。
[0086]进一步地，所述生物传感器100还可以用于定量测定随时间变化的组分的类型，例如可以在生产过程或储存过程中变化的。因此，在生物传感器100应用于食物样品、临床测试样品或工业样品的测量时，也可以用于在生产过程或储存中的对食物的、医疗用品的、工业产品等的质量控制中。
[0087]除此以外，当所述生物传感器100配置上葡萄糖传感器时，可以采用葡萄糖脱氢酶作为氧化还原酶，以替代葡萄糖氧化酶。
[0088]进一步地，在图8中，第二底物可以为果糖。在这种情况下，可以采用果糖的氧化还原酶作为第二酶来代替葡萄糖的氧化还原酶，从而测定在时间点Tl和时间点T2的果糖的量，从而分别计算样品中含有的果糖和蔗糖的量。当测量果糖的量时，可以采用的作为第二酶的氧化还原酶的典型例子包括，例如果糖氧化酶或果糖脱氢酶。
[0089]另外，通过使用所述生物传感器100测定的第一底物并不限定为蔗糖。所述第一底物通常包括，例如糖类，更具体地包括:二糖，如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖等 '三糖，如蜜三糖等；多糖，如淀粉等。
[0090]用于测量淀粉的酶的组合的典型例子可以包括:作为第一酶的酶为能够将结合了两个或两个以上单糖的糖分解为单糖单元的酶，作为第二酶的酶为能够氧化单糖的酶(葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶等)。
[0091]第一底物为麦芽糖、乳糖、海藻糖和蜜三糖的情况时的具体实施例如图9-12所示。[0092]此外，所述第一底物通常还包括:由氨基酸组成的材料，如肽、蛋白质、氨基酸聚合物等。用于测定肽类的材料的酶的组合的典型例子可以包括:作为第一酶的酶为能够打断肽键以分解为氨基酸单元的酶；作为第二酶的酶为能够氧化氨基酸的酶(谷氨酸氧化酶等）。[0093]肽类材料的典型例子是末端为谷氨酸的肽的反应路线，如图13所示。
[0094]图13可以获得样品中含有的肽中的谷氨酸的浓度和样品中游离的谷氨酸的浓度，该样品中含有末端为谷氨酸残基的肽。
[0095]在图13中，肽末端的谷氨酸残基的水解由于作为第一酶的谷氨酰氨基肽酶为产生L-谷氨酸而产生。作为第二酶的谷氨酸氧化酶作用于产生的L-谷氨酸以产生电流，该电流取决于L-谷氨酸的浓度。
[0096]所述传感单元101在时间点Tl和时间点T2分别测定了电流值Il和电流值12，并且在计算单元105中计算肽中的谷氨酸的浓度和游离的谷氨酸的浓度。然后，该计算单元105根据值Il计算游离的谷氨酸的浓度，并且随后根据值12和值Il进行预定的计算(如12-11)以计算出肽中的谷氨酸的浓度。优选采用能够获得量化的谷氨酸浓度的传感器用于芳香物质或鲜味物质的传感器。同样地，能够获得量化的谷氨酸浓度的传感器也可以用于随时间变化的鲜味材料的测定。
[0097]另外，第一底物通常包括固醇酯如胆固醇酯等。在这种情况下，用于将固醇酯分解为固醇和脂肪酸的酶如固醇酯酶等被指定为第一酶，固醇的还原酶如胆固醇氧化酶等被指定为第二酶。
[0098]胆固醇酯的反应路线如图14中所示。此外，第一底物的其他实例可以包括:尿素、肌酸酐、胱硫醚等。上述材料的具体实例的反应路线如图15-17所示。
[0099]用于生物传感器100的各自的酶和各自的底物的典型组合可以包括，例如，以下的组合:
[0100]例如，第一底物可以选自由蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖组成的组中的一种，第二底物可以为葡萄糖，并且第二酶可以为葡萄糖氧化酶或葡萄糖还原酶。
[0101]或者，第二底物可以为谷氨酸，并且第二酶为谷氨酸氧化酶。
[0102]或者，第一底物选自由胆固醇酯、尿素、肌酸酐、胱硫醚和蜜三糖组成的组中的一种。
[0103]在以下的【具体实施方式】的描述中，重点将放在对区别于第一种【具体实施方式】的特征的描述上。另外，各个【具体实施方式】中的各方面的适当的组合也是可以实施的。
[0104](第二种【具体实施方式】)
[0105]第一种【具体实施方式】的结构也可以配置为传感单元中的反应层114具有含第一酶的第一反应层以及含第二酶的第二反应层。
[0106]图4示出了本【具体实施方式】中的传感单元的结构的截面图。在图4中，传感单元121中的反应层124是由第一反应层123 (与电极116接触)和第二反应层125 (与第一反应层123接触)堆叠的而成的。反应层124也可以由例如存在于第二反应层125中的第一酶和存在于第一反应层123中的第二酶配置而成。
[0107]采用本【具体实施方式】中的传感单元121可以根据第一和第二酶的性质来改变固定酶的方法。
[0108](第三种【具体实施方式】)
[0109]在上述的【具体实施方式】中，所述传感单元也可以进行如下配置。图5示出了本【具体实施方式】中的传感单元的结构的透视图。
[0110]在如图5所示的传感单元131中，工作电极132 (钼电极)、对电极133 (钼电极)和参比电极135(银/氯化银电极)置于玻璃基板137上。对电极133和参比电极135置于沿着工作电极132的外周上的不同的位置，从而围绕着工作电极132。
[0111]此外，用于覆盖电极的粘结层138、选择性渗透层139、酶层134和限制的渗透层140从基板的侧边依次地置于玻璃基板137上。
[0112]所述粘结层138是用于在设置于该层的层与玻璃基板137和在该层以下的各个电极之间提供改进的粘结性。另外，该粘结层还能改进玻璃基板137表面的可润湿性，从而该层对用于提供形成的酶层134的改进的均匀性也显示有利的影响。更进一步地，该层对于干扰在电极上的过氧化氢反应的抗坏血酸、尿酸和醋氨酚有选择的渗透性。
[0113]形成所述粘结层138的材料的典型例子可以包括，例如，硅烷偶联剂。所述硅烷偶联剂的典型的类型可以包括氨基硅烷、乙烯基硅烷、环氧硅烷等，其中，从粘结性和选择的渗透性考虑，优选作为一种氨基硅烷的Y-氨丙基三乙氧基硅烷。
[0114]所述选择的渗透层139用于阻止除在传感单元131的电极表面上发生电化学反应的最终测量对象的材料以外的其他材料的渗透，这样的作用是通过具有缝隙结构的膜结构能够阻止大分子量的分子的渗透，以及具有静电排斥力而能够阻止离子的渗透而体现的。所述选择的渗透层139由选自如纤维素乙酸酯和离子交换树脂中的材料而组成。
[0115]所述限制的渗透层140是用于限制待测量的组分的扩散速率和减小干扰物质或妨碍物质的影响的，从而有助于改善测量的精确度和扩大测量的有效范围。例如，聚二甲基硅氧烷或聚羧酸的氟醇酯可以优选地用于该限制的渗透层140。此处，聚羧酸的氟醇酯是聚羧酸中的部分或全部的羧基被氟醇酯化的产物。另外，氟醇是醇中的全部或至少一个羟基被氟所取代的产物。如此便可以有效地阻止如蛋白质、酰脲等污染物的粘附，从而使得测量设备可以获得在更长的时间内显示稳定的操作输出特性。此外，由于氟醇酯基团并不溶于大多数的非氟系溶剂或者清洁剂(detergent)如表面活性剂等，从而获得具有改善的耐化学性的酶传感器。
[0116]当所述限制的渗透层140由具有特定结构的聚合物组成时，其也可以由两种或两种以上的具有不同结构或分子量的混合物组成。
[0117]作为生物传感器100如葡萄糖传感器等的测量对象的测量样品溶液通常包括血液或尿液或排泄物(一般含有多种除作为测量对象的材料以外的外来杂物)。对于这样的测量样品，所述选择的渗透层139或限制的渗透层140就可用于阻止由于这些外来杂物引起的影响、妨害和干扰作用，从而即使在这种恶劣的环境下也能维持更稳定的特性以显示
高定量特性。
[0118](第四种【具体实施方式】)
[0119]在上述【具体实施方式】中，所述计算单元105可以选择性地包括矫正单元，用于矫正通过采用Il和12而分别获取的底物的浓度时的电流值。
[0120]所述矫正单元，例如，矫正电流值12以确保在时间点Tl时第一底物的浓度为零。
[0121]或者，所述矫正单元可以通过减去基电流值进行矫正，该基电流值为时间点T3的电流值，而不是来自于在时间点Tl和时间点T2分别测得的值。
[0122]或者，所述矫正单元可以根据预定的计算公式如关于米氏动力学(Michaelis-Menten kinetics)等的公式对第一底物的浓度或第二底物的浓度的测量值进行矫正。
[0123]此外，所述矫正单元可以随着时间的递进，通过预定的方法如快速傅里叶变换、小波变换等对由传感单元101测定的电流值进行噪声消除处理。这样便可以增强信号/噪声的比值，从而获得更确定的样品中各个组分的浓度。例如，可以采用ISA0、SHITANDA等发表的题为“安培生物传感器响应的小波变换”(BUNSEKIKAGAKU，Vol.57，N0.3，pp.183-190(2008))中描述的方法。
[0124]本发明的优选实施方式已参照附图进行了说明，应当理解的是以上公开的内容是为了说明本发明，除了以上的说明外的其他的修改也是可行的。
[0125]例如，上述的【具体实施方式】可以选择性地配置为反应层114中含有电子受体。所述电极受体加入到反应层114中以减少溶解的氧气和干扰物质的影响，从而可以改善能够通过采用简便的结构测定的底物的量的精确度。
[0126]对所述反应层114中含有的电子受体的种类没有特别的限定，只要该电子受体能够与酶进行电子的交换即可。例如，典型的电子受体可以选自:金属配合物及其衍生物如铁氰化钾(亚铁氰化钾)、二茂铁及其衍生物、锇络合物及其衍生物(单体、聚合物)、钌络合物等；醌类；吩嗪硫酸甲酯及其衍生物；氧化还原着色剂如二氯酚靛酚、亚甲基兰等；四硫富瓦烯(TTF)及其衍生物；以及四氰基对醌二甲烧(tetracyanoquinodimethane)等。
[0127]此外，所述反应层114中可以含有稳定剂。典型的稳定剂包括:糖类如海藻糖、蔗糖、蜜三糖等；氨基酸如精氨酸、谷氨酰胺等；聚合物等。
[0128]进一步地，所述反应层114可以含有表面活性剂。所述电子受体具有较低的水溶性。因此，该电子受体由于测量样品中的含有的水的存在而可以在反应层上沉淀。因而反应层中含有的表面活性剂可以改善水溶性。
[0129]本【具体实施方式】中可用的典型的表面活性剂包括，例如:卵磷脂、辛基硫代葡萄糖苷、胆酸钠、十二烷基-β-麦芽糖苷、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、Triton-XlOO (注册商标)、Lubrol PX (注册商标)、DK_ester (注册商标)、BIG CHAP (注册商标)、Deox CHAP (注册商标)、月桂醇硫酸酯钠盐(十二烷基硫酸钠，SDS)、十二烷基苯磺酸钠、羧甲基纤维素、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚乙烯磺酸、聚己二烯二甲基铵盐、聚丙烯酸和TWeen20(注册商标，聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯)。特别优选地采用Triton-XlOO (注册商标)、SDS和Tween2O (注册商标)。
[0130]上述【具体实施方式】中采用的作为第一酶的酶的实例将如以下所示。[0131](1.1)作用于酯键上的水解酶
[0132]通常包括:EC:3.1.1羧酸酯水解酶；EC:3.1.2三价醇酯水解酶(硫酯水解酶)；EC:3.1.3磷酸单酯水解酶；EC:3.1.4磷酸二酯水解酶；EC:3.1.5三磷酸单酯水解酶；EC:3.1.6硫酸酯水解酶；EC:3.1.7 二磷酸单酯水解酶；EC:3.1.8磷酸三酯水解酶；EC:3.1.11产生5’-磷酸单酯的外切脱氧核糖核酸酶；EC:3.1.13产生5’-磷酸单酯的外切核糖核酸酶；EC:3.1.14产生3’ -磷酸单酯的外切核糖核酸酶；EC:3.1.15对核糖核酸或脱氧核糖核酸有活性并产生5’ -磷酸单酯的外切核酸酶；EC:3.1.21产生5’ -磷酸单酯的内切脱氧核糖核酸酶；EC:3.1.22产生3’ -磷酸单酯的内切脱氧核糖核酸酶；EC:3.1.25对突变的碱基有特异性的特定位点内切脱氧核糖核酸酶；EC:3.1.26产生5’ -磷酸单酯的内切核糖核酸酶；EC:3.1.27产生3’ -磷酸单酯的内切核糖核酸酶；EC:3.1.30对核糖核酸或脱氧核糖核酸有活性并产生5’-磷酸单酯的内切核酸酶以及EC:3.1.31对核糖核酸或脱氧核糖核酸有活性并产生3’ -磷酸单酯的内切核酸酶等，并优选以下列举的产品。
[0133]EC:3.1.1.13:固醇酯酶。胆固醇酯的水解将生成脂肪酸和胆固醇。通过胆固醇氧化酶便可测定(见图14)。测定对象实例为:血清。
[0134]EC:3.1.1.21:棕榈酸视黄酯酶。视黄醇酯的水解将生成视黄醇和脂肪酸。通过视黄醇脱氢酶便可测定。测定对象实例为:血浆。
[0135]EC:3.1.1.28:酰基肉毒碱水解酶。酰基肉毒碱的水解将生成L-肉碱和脂肪酸。通过脂肪酸脱氢酶便可测定。测定对象实例为:血浆、尿液。
[0136]EC:3.1.3.25:磷酸肌醇磷酸酶。ILiyo-肌醇_1_磷酸酯(lL-myo-1nositolΙ-phosphate)的水解将生成myo_肌醇(myo-1nositol)和磷酸。通过肌醇脱氢酶便可测定。测定对象实例为:血清。
[0137]EC:3.1.6.4:N-乙酰半乳糖胺_6_硫酸酯酶。N-乙酰基-半乳糖胺_6_硫酸酯单元(硫酸软骨素)的水解将生成N-乙酰基-半乳糖胺单元(硫酸软骨素)和硫酸酯。通过EC:3.2.1.49和酰基己糖胺氧化酶的组合便可测定。对象:关节液。
[0138](1.2)糖苷水解酶(糖基酶)
[0139]通常包括:EC:3.2.1糖苷键水解酶(糖苷酶)或糖苷水解酶(糖基酶)和水解的N-糖基化合物的EC:3.2.2等，并优选以下列举的产品。
[0140]EC:3.2.1.1:α-淀粉酶。淀粉(或糖原)的α -1, 4_糖苷键(麦芽糖的键合状态)的水解可以产生低分子量化合物。可生成低聚糖、麦芽糖和葡萄糖。通过葡萄糖氧化酶或麦芽糖酶和葡萄糖氧化酶的组合便可测定。
[0141]EC:3.2.1.2:β-淀粉酶。麦芽糖由可溶的淀粉(直链淀粉)产生。通过麦芽糖酶和葡萄糖氧化酶的组合便可测定。
[0142]EC:3.2.1.4:纤维素酶。β -1, 4_糖苷键(麦芽糖的键合状态(非半乳糖而是葡萄糖))如纤维素、地衣淀粉、小麦葡聚糖等的水解将生成葡萄糖。
[0143]EC:3.2.1.14:甲壳素酶。在甲壳素或甲壳低聚糖中的β -1, 4_糖苷键将分解以产生N-乙酰葡萄糖胺或葡萄糖胺。通过N-酰基己糖胺氧化酶便可测定。
[0144]EC:3.2.1.20:α-葡萄糖苷酶。俗名:麦芽糖酶(见图9)。
[0145]EC:3.2.1.21:β-葡萄糖苷酶。俗名:龙胆二糖酶、纤维素二糖酶。β _D_葡萄糖苷(龙胆二糖(β-1，6-键)和纤维二糖都是由两个葡萄糖键合的二糖)的水解将得到D-葡萄糖。
[0146]EC:3.2.1.22:α-半乳糖苷酶。俗名:蜜二糖酶。a -D-半乳糖苷(蜜三糖)(见图12，三糖)和水苏糖(由半乳糖-半乳糖-蔗糖组成的四糖)中的α-1，6_半乳糖苷键将水解为D-半乳糖。通过半乳糖氧化酶便可测定。外加与蔗糖的分解的结合也可测定。
[0147]EC:3.2.1.23:β-半乳糖苷酶。俗名:乳糖酶(见图10)。
[0148]EC:3.2.1.24:α-甘露糖苷酶。a-D-甘露糖苷将水解产生D-甘露糖。通过己醛糖脱氢酶便可测定。
[0149]EC:3.2.1.25:β-甘露糖苷酶。β _D_甘露糖苷将水解产生D-甘露糖。通过己醛糖脱氢酶便可测定。
[0150]EC:3.2.1.26:β-呋喃果糖苷酶。俗名:蔗糖酶(见图8)。
[0151]EC:3.2.1.28: α.α -海藻糖酶(见图 11)。
[0152]EC:3.2.1.91:纤维素1，4_β -纤维二糖苷酶。纤维素或纤维四糖将水解产生纤维二糖。通过EC:3.2.1.21的组合便可测定。
[0153]EC:3.2.1.108:乳糖酶。乳糖将水解产生D-半乳糖和D-葡萄糖(见图10)。
[0154](1.3)乙醚硫醚水解酶(Ether Thioether Hydrolases)
[0155]通常包括:EC:3.3.1硫醚和三烷基硫鎗水解酶；以及EC:3.3.2乙醚水解酶。
[0156](1.4)作用于肽键的水解酶
[0157]通常包括:EC:3.4.11氨基肽酶；EC:3.4.13 二肽酶；EC:3.4.14 二肽基-肽酶和三肽基-肽酶；EC:3.4.15肽基-二肽酶；EC:3.4.16丝氨酸类羧肽酶；EC:3.4.17金属羧肽酶(metallocarboxypeptidases) ；EC:3.4.18 半胱氨酸类羧肽酶；EC:3.4.19 欧米伽肽酶；EC:3.4.21丝氨酸内切肽酶；EC:3.4.22半胱氨酸内切肽酶；EC:3.4.23天冬氨酸内切肽酶；EC:3.4.24其他肽酶(金属内切肽酶(metalloendopeptidases)) ；EC:3.4.25苏氨酸内切肽酶等，并优选以下列举的产品。
[0158]EC:3.4.11.7:谷氨酰氨基肽酶。与EC:3.4.11.1相似。谷氨酸和天冬氨酸(见图 13)。
[0159]EC:3.4.13.7 =Glu-Glu 二肽酶。与 EC:3.4.13.3 相似。谷氨酸。
[0160]EC:3.4.17.11:谷氨酸羧肽酶。与EC:3.4.17.1相似。谷氨酸。
[0161]EC:3.4.17.21:谷氨酸羧肽酶II。与EC:3.4.17.1相似。谷氨酸。
[0162]EC:3.4.19.9: Y-谷氨酰水解酶。与 EC:3.4.19.1 相似。
[0163]EC:3.4.19.11: Y-D-谷酰基-内消旋-二氨基庚二酸肽酶。与EC:3.4.19.1相似。
[0164]EC:3.4.21.82:谷酰基内切肽酶 II。与 EC:3.4.21.1 相似。
[0165](1.5)作用于CN键而不是肽键的水解酶。
[0166]通常包括:作用于线性酰胺的水解酶EC:3.5.1 ;作用于环酰胺的水解酶EC:3.5.2 ;作用于线性脒的水解酶EC:3.5.3 ;作用于环脒的水解酶EC:3.5.4 ;作用于腈类的水解酶EC:3.5.5以及作用于其他化合物的水解酶EC:3.5.99，并优选以下列举的产品。
[0167]EC:3.5.1.2:谷氨酰胺酶。L-谷氨酰胺将水解为L-谷氨酸。通过谷氨酸氧化酶等便可测定。
[0168]EC:3.5.1.5:尿素酶。尿素将水解为二氧化碳和氨气。通过氨单加氧酶等便可测定(见图15)。
[0169]EC:3.5.1.35:D_谷氨酰胺酶。D-谷氨酰胺将水解为L-谷氨酸和氨气。通过谷氨酸氧化酶或氨3-单加氧酶便可测定。
[0170]EC:3.5.1.38:谷氨酰胺酶(天冬酰胺酶)。L-谷氨酰胺(或L-天冬酰胺)将水解为L-谷氨酸(或L-天冬氨酸)。通过谷氨酸氧化酶(或氨基酸氧化酶)便可测定。
[0171]EC:3.5.1.55:长链脂肪酰基谷氨酸脱酰酶。N-长链脂肪酰基谷氨酸将水解为长链脂肪酸和L-谷氨酸。通过谷氨酸氧化酶便可测定。
[0172]EC:3.5.1.63:4_乙酰氨基丁酸脱乙酰酶。4_乙酰氨基丁酸酯将水解为4_氨基丁酸酯和乙酸。通过EC:2.6.1.19:4_氨基丁酸转氨酶和谷氨酸氧化酶的组合便可测定。
[0173]EC:3.5.1.68:N-甲酰基谷氨酸脱甲酰基酶。N-甲酰基_L_谷氨酸将水解为L-谷氨酸和甲酸。通过谷氨酸氧化酶或者甲酸脱氢酶便可测定。
[0174]EC:3.5.1.c:β-柠檬酰基-谷氨酸水解酶。β -柠檬酰基-谷氨酸将水解为柠檬酸和L-谷氨酸。通过谷氨酸氧化酶便可测定。
[0175]EC:3.5.2.9:5_氧代脯氨酸酶。5_氧代-L-脯氨酸将水解为L-谷氨酸和腺苷二磷酸(ADP)。通过谷氨酸氧化酶等(核酸酶+核苷酸酶+核苷酶等的组合)便可测定。
[0176]EC:3.5.2.10:肌酸酐酶。肌酸酐将水解为肌酸。通过EC:1.5.3.1肌氨酸氧化酶便可测定。对象实例:尿液。
[0177]EC:3.5.3.3:肌酸酶。肌酸将水解为肌氨酸和尿素。通过肌氨酸氧化酶或EC:
3.5.1.5便可测定(见图16)。对象实例:尿液。
[0178]EC:3.5.4.21:肌酸酐脱氨酶。肌酸酐将水解为N-甲基乙内酰脲和氨气。通过结合EC:3.5.2.14或氨3-单加氧酶(ammonia3-monooxygenase)便可测定。对象实例:尿液。
[0179](1.6)作用于酸酐的水解酶
[0180]通常包括:作用于含有磷的酸酐的水解酶EC:3.6.1 ;作用于含有磺酰基的酸酐的水解酶EC:3.6.2、作用于酸酐以催化物质的跨膜运动的水解酶EC:3.6.3、作用于酸酐以促进细胞和亚细胞的运动的水解酶EC:3.6.4以及作用于GTP以促进细胞和亚细胞的运动的水解酶EC:3.6.5。
[0181](1.7)作用于碳-碳键的水解酶。
[0182]通常包括:作用于酮类物质的水解酶EC:3.7.1。
[0183](1.8)作用于卤键的水解酶。
[0184]通常包括:作用于C-卤化物的水解酶EC:3.8.1。
[0185](1.9)作用于磷-氮键的水解酶。
[0186]通常包括:EC:3.9.1酶等。
[0187](1.10)作用于硫-氮键的水解酶。
[0188]通常包括:EC:3.10.1酶等。
[0189](1.11)作用于碳-磷键的水解酶。
[0190]通常包括:EC:3.11.1酶等。
[0191](1.12)作用于硫-硫键的水解酶。
[0192](1.13)作用于碳-硫键的水解酶。
[0193]通常包括:EC:3.13.1酶等。[0194](2.1)裂解酶
[0195]通常包括:作用于羧基的裂解酶EC:4.1.1 ;作用于醛基的裂解酶EC:4.1.2 ;含氧酸-裂解酶EC:4.1.3以及其他的碳-碳裂解酶EC:4.1.99等。
[0196](2.2)碳-氧裂解酶
[0197]通常包括:脱氢-裂解酶EC:4.2.1 ;作用于多糖的裂解酶EC:4.2.2 ;作用于磷酸基团的裂解酶EC:4.2.3以及其他碳-氧裂解酶EC:4.2.99等。
[0198](2.3) C-N 裂解酶
[0199]通常包括:脱氨-裂解酶EC:4.3.1 ;脒-裂解酶EC:4.3.2 ;胺裂解酶EC:4.3.3
坐寸ο
[0200](2.4) C-S 裂解酶
[0201]通常包括:EC:4.4.1碳-硫裂解酶，以及优选以下列举的产品。
[0202]EC:4.4.1.8:胱硫醚β -裂解酶。胱硫醚将转化为L-高半胱氨酸和丙酮酸以及氨气。通过多种酶便可测定，如丙酮酸氧化酶和氨单加氧酶(见图17)。对象实例:血液。
[0203](2.5) C-卤化物裂解酶
[0204]通常包括:EC:4.5.1碳-卤化物裂解酶。
[0205](2.6) P-O 裂解酶
[0206]通常包括:EC:4.6.1磷-氧裂解酶。
[0207](2.7)其他裂解酶
[0208]通常包括:EC:4.99.1其他裂解酶。
[0209]实施例
[0210]在本实施例中，将制备一种用于测定蔗糖和葡萄糖的传感器。
[0211](制备生物传感器的方法)
[0212]在本实施例中，制备具有图1所示的结构的生物传感器。制备具有与图5所示结构相似的结构的传感器，其中，图1中所示的传感单元101是通过简化图5中所示的传感单元131以至于不包括粘结层138和选择的渗透层139。
[0213]制备配置有工作电极132 (钼电极)、对电极133 (钼电极)和参比电极135(银/氯化银电极)的玻璃基板137。
[0214]此外，将GOx、蔗糖酶、变旋酶和牛血清蛋白(BSA)溶于水中，充分混合然后冷却。将戊二醛加入上述酶溶液中，并在混合后将该溶液快速地通过旋转涂布的方法涂布到电极上以形成酶层134。进一步地，为了防止吸附物质吸附在酶层134上，在酶层134上涂上氟树脂以形成限制的渗透层140，并覆盖酶层134。
[0215](电化学测量)
[0216]标准样品:制备葡萄糖溶液的含有150mM NaCl的0.1M的TES缓冲溶液(pH7.5)、蔗糖溶液的含有150mM NaCl的0.1M的TES缓冲溶液(pH7.5)以及葡萄糖-蔗糖混合溶液的含有150mM NaCl的0.1M的TES缓冲溶液(ρΗ7.5)。分别加入5 μ L样品到反应层114中，并且在加入样品IOs后，给对立于对电极113的工作电极112的阳极方向加电压(+0.3V/vs)以开启响应电流的测量。开启测量后测量10s-240s之间的电流值。
[0217]通过应用标准样品而获得的测量结果见表I和图6所示。图6所示的响应曲线表明了根据仅含有葡萄糖的标准样品、仅含有蔗糖的标准样品和含有葡萄糖和蔗糖的标准样品中的蔗糖或葡萄糖的浓度的变化而随之产生的响应电流的变化。表1示出了开启测量后的各个时间点的响应电流值，并且概述了图6中的开始测量后的第10秒、第20秒、第30秒和第60秒的电流值。另外,在给出葡萄糖浓度各自为OmM、10mM、20mM、30mM和40mM的情况下，表1也示出了蔗糖浓度为0mM、10mM、20mM、30mM和40mM的电流值。
[0218]此外，图7是从表1中的值获取的表明时间-响应电流值关系的图。
[0219]表1
[0220]
【权利要求】
1.一种用于测定样品中第一底物和第二底物的浓度的生物传感器，该生物传感器包括: 传感单元，该传感单元包括基板、提供在所述基板上的电极以及提供在所述电极上的反应层； 用于测量时间的计时单元；以及 计算单元； 其中，所述反应层包括用于将所述第一底物转化为所述第二底物的第一酶，以及作用于所述第二底物或通过进一步转化所述第二底物而获得的转化的底物的第二酶，并且 其中，所述计算单元根据所述传感单元在第一时间测得的第一电流值和所述传感单元在第二时间测得的第二电流值，分别计算出所述样品中的所述第一底物和所述第二底物的浓度。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其中，所述电极具有工作电极，并且所述反应层提供在所述工作电极的上方。
3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述计算单元根据所述第一电流值计算出所述样品中的所述第二底物的浓度，并且根据所述第二电流值和所述第一电流值间的差值计算出所述样品中的所述第一底物的浓度。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的生物传感器，其中，所述第二酶为氧化还原酶。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的生物传感器，其中，所述第一酶为所述第一底物的水解酶。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的生物传感器，其中，所述第一底物为选自由蔗糖、麦芽糖、乳糖和海藻糖组成的组中的一种， 其中所述第二底物为葡萄糖，以及 其中所述第二酶为葡萄糖氧化酶或葡萄糖还原酶。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的生物传感器，其中，所述第二底物为谷氨酸，并且所述第二酶为谷氨酸氧化酶。
8.根据权利要求1-5中任意一项所述的生物传感器，其中，所述第一底物选自由胆固醇酯、尿素、肌酸酐、胱硫醚和蜜三糖组成的组中的一种。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的生物传感器，其中，所述反应层包括含有所述第一酶的第一反应层和含有所述第二酶的第二反应层。
10.使用权利要求1-9中任意一项所述的生物传感器测定样品中的所述第一底物和所述第二底物的浓度的方法，该方法包括: 在所述传感单元中在所述第一时间测定获得所述第一电流值； 在所述传感单元中在所述第二时间测定获得所述第二电流值；并且 根据所述第一电流值和所述第二电流值，分别计算出所述样品中的所述第一底物的浓度和所述第二底物的浓度。
【文档编号】G01N27/26GK103983668SQ201410031071
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2013年2月12日
【发明者】小出哲 申请人:株式会社百利达