一种便于形态学观察的粘孢子虫染色封存方法
【专利摘要】本发明公开了一种便于形态学观察的粘孢子虫染色封存方法，包括制作粘孢子虫悬浮液、制作蛋白甘油粘性玻片、烘片、染色、脱色洗片以及脱水封片步骤。本发明的方法整个流程制作一般不超过2小时，如果使用染色架和染缸进行，还可以实现批量制作。染色效果好，在40倍物镜下，粘孢子虫孢质被染成深蓝色、极囊被染成浅紫红色、壳片不着色，这样极囊、孢质和壳片界线分明，孢子的形态结构一目了然；100倍油镜下，极囊极丝着色较深，极囊其它部分着色较浅，极丝清晰可见，制好的玻片可以重复观察使用，且能常年保存。
【专利说明】一种便于形态学观察的粘孢子虫染色封存方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物学领域，具体而言，涉及一种便于形态学观察的粘孢子虫染色封存方法。
【背景技术】
[0002]粘孢子虫(Myxosporea)是一类种类繁多的寄生虫。目前，发现的粘孢子虫种类已超过2200种，并且每年都有新种被发现。除少数种类寄生在两栖动物、水禽及哺乳动物外，绝大多数寄生于鱼类不同组织器官上，严重影响寄主的健康生长。粘孢子虫作为最为常见的鱼类等水生动物寄生虫之一，经常在科研或教学中被研究观察。
[0003]目前最常用的粘孢子虫的观察方法:事先把患粘孢子虫的病鱼保存在福尔马林溶液中，需要观察时，从溶液中取出粘孢子虫的孢囊，制作水浸片，然后在显微镜下观察。这种方法明显有如下缺点:其一、粘孢子虫基本透明，在显微镜下折光率低，不容易看清楚其形态结构(图2、图4、图6);其二、水浸片中的粘孢子虫位置不固定，会随液体而流动，不利于显微镜下虫体结构观察和拍照；其三、每次观察都要制作水浸片，耗时耗力，浪费粘孢子虫样品和玻片；其四、用于长期保存粘孢子虫的福尔马林溶液有效成分为甲醛，有刺激气味，有毒，制作水浸片过程影响使用者身体健康。
【发明内容】
[0004]为了弥补上述缺陷，本发明自创出一种简单易行，便于携带，观察效果好，一次做好可常年保存并且可反复使用的粘孢子虫玻片标本的制作方法，以期给寄生虫实验科研和教学带来便利。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:
[0005]本发明涉及一种便于形态学观察的粘孢子虫染色封存方法，其特征在于包括如下步骤:
[0006](I)粘孢子虫悬浮液制作:从保存于福尔马林中的患粘孢子虫病病鱼上取出孢囊放入适量蒸馏水中，弄破孢囊使得粘孢子虫分散悬浮于蒸馏水中，粘孢子虫悬浮液中的孢子虫尽可能有较高浓度，一般以0.01?IXio6Ail为最宜；
[0007](2)甘油蛋白粘性玻片制作:用大头针取芝麻大小的甘油蛋白均匀涂在载玻片上，用滴管滴2?3滴粘孢子虫悬浮液于甘油蛋白粘性玻片上，摇晃玻片使粘孢子虫悬浮液均勻地分布于玻片上；
[0008](3)烘片:把带有粘孢子虫的玻片在38?42°C干燥箱里烘干，以玻片上液体刚蒸发了为止；或者可以自然条件下晾干；
[0009](4)染色:用滴管吸取瑞氏-姬姆萨A液(常规血细胞染色用瑞氏染液和姬姆萨1:1混合液)0.5?0.8ml覆盖于带有粘孢子虫的烘干玻片上，染色5?8min ;再将瑞氏-姬姆萨B液(pH=6.4?6.8的磷酸盐缓冲液)滴加于A液上，滴加量是A液的3倍，以嘴或洗耳球吹出微风使得液面产生涟漪状而充分混合，染色8?IOmin ;用蒸馏水缓慢细流冲掉玻片上多余的染料，直到流下的蒸馏水变为无色为止；[0010](5)脱色洗片:把染好的玻片浸入甲醇溶液中I?3min进行脱色洗片；
[0011](6 )脱水及封片:脱色的洗片依次经过70%、80%、95%、100%梯度酒精分别脱水2min，然后分别经二甲苯纯酒精1:1混合液和二甲苯2min后用中性树胶封片。
[0012]在本发明的一个优选实施方式中，所述的甘油蛋白为甘油(丙三醇)与鸡蛋蛋清1:1体积比的混匀液。
[0013]本发明中，粘孢子虫(Myxosporea)是一类种类繁多的寄生虫。目前，发现的粘孢子虫种类已超过2200种，并且每年都有新种被发现。除少数种类寄生在两栖动物、水禽及哺乳动物外，绝大多数寄生于鱼类不同组织器官上。为了在取材上更具代表性，本发明的技术方案选用标本是单极囊的武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis)和双极囊的咽碘泡虫(Myxobolus pharynae),两种虫体均属于碘泡虫属(Myxobolus Biitschli, 1882),碘泡虫属是粘孢子虫种类最多的一个属，目前已经超过820种，超过粘孢子虫全部种类的1/3。所以，虽然本发明优选了单极囊的武汉单极虫和双极囊的咽碘泡虫，但本发明的方法具有普遍意义，其它粘孢子虫的染色封存也可以采用该方法进行。
[0014]本发明所述的方法具有如下优点:
[0015]( I)用玻片标本成品观察粘孢子虫形态效果好:在40倍物镜下，粘孢子虫孢质被染成深蓝色、极囊被染成浅紫红色、壳片不着色，这样极囊、孢质和壳片界线分明，整个孢子的形态结构显得一目了然(图3、7);在100倍油镜下，极囊极丝着色较深，极囊其它部分着色较浅，极丝的结构显得清晰可见(图5)。这样就克服了传统粘孢子虫显微镜下观察，折光率低，虫体形态结构不清晰的弊端。
[0016](2)标本制作最后采用梯度酒精脱水后中性树胶封片，做好的玻片标本可常年保存样品，多次重复使用，节约玻片等耗材，而且携带方便，可作为实验教学上粘孢子虫形态结构观察玻片标本实验材料。
[0017](3)该制作过程，设备和工艺要求相对简单，整个操作流程一般不超过2小时，而且可以批量制作。
[0018](4)粘孢子虫是水生动物最常见的寄生虫之一，制作好的玻片标本可作为水生动物病害寄生虫学教学用的观察材料，在开设水产养殖等相关专业的高等院校中有一定市场，所以制作好的粘孢子虫标本可成为商品，具有较好的经济价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1:本发明所述粘孢子虫玻片染色封存方法的流程示意图；
[0020]图2:40倍物镜下水浸片咽碘泡虫，bar=15 μ m ；
[0021]咽碘泡虫折光率低，极囊、孢质和壳片结构不清晰，界限不分明
[0022]图3:40倍物镜下染色封存的咽碘泡虫，bar=15 μ m ；
[0023]虫体孢质被染成深蓝色、极囊被染成浅紫红色、壳片不着色，极囊、孢质和壳片界线分明
[0024]图4:100倍油镜下水浸片咽碘泡虫，bar=10 μ m ；
[0025]透明度高，折光率低，不易观察极丝
[0026]图5:100倍油镜下染色封存咽碘泡虫，bar=10 μ m ；
[0027]极囊极丝着色较深，极囊其它部分着色较浅，极丝的结构清晰可见[0028]图6:40倍物镜下水浸片武汉单极虫，bar=15 μ m ；
[0029]虫体折光率低，极囊、孢质和壳片结构不清晰，界限不分明
[0030]图7:40倍物镜下染色封存武汉单极虫，bar=15 μ m。
[0031]虫体孢质被染成深蓝色、极囊被染成浅紫红色、壳片不着色，极囊、孢质和壳片界线分明，可见极丝
【具体实施方式】:
[0032]下面结合图1所示的流程图对本发明的技术方案做进一步说明。
[0033]实施例1:
[0034]粘孢子虫悬浮液制作:从保存于福尔马林中的患粘孢子虫病病鱼上取出孢囊放入适量蒸馏水中，弄破孢囊使得粘孢子虫分散悬浮于蒸馏水中，防止孢子成团，影响制片效果和观察，粘孢子虫悬浮液中的孢子虫尽可能达到较高的浓度，一般以0.01?IXio6Ail为最宜。
[0035]甘油蛋白粘性玻片制作:用大头针取芝麻大小的甘油蛋白均匀涂在载玻片上。甘油蛋白有两个作用:其一、让粘孢子虫粘附在玻片上，使其在染色和封片过程中不易脱落；其二、能够降低粘孢子虫悬浮液在玻片上的表面张力，使粘孢子虫能均匀地分布在玻片表面。甘油蛋白为甘油(丙三醇)与鸡蛋蛋清1:1体积比的混匀液。因甘油蛋白易着色，不能涂的过多，避免干扰粘孢子虫的观察。
[0036]用滴管滴2?3滴粘孢子虫悬浮液于甘油蛋白粘性玻片上，摇晃玻片使粘孢子虫悬浮液均匀地分布于玻片上。
[0037]烘片:把带有粘孢子虫的玻片在38?42°C干燥箱里烘干，约需5?8min，以玻片上液体刚蒸发完为至。烘片不能时间过长，否则粘孢子虫容易萎缩变形。如果没有干燥箱，也可以自然条件下晾干。
[0038]染色:用滴管吸取瑞氏-姬姆萨A液0.5?0.8ml覆盖于带有粘孢子虫的烘干玻片上，染色5?8min ;再将瑞氏-姬姆萨B液滴加于A液上，滴加量是A液的3倍，以嘴或洗耳球吹出微风使得液面产生涟漪状而充分混合，染色8?IOmin ;用蒸馏水缓慢细流冲掉玻片上多余的染料，直到流下的蒸馏水变为无色为止。瑞氏-姬姆萨A液为常规血细胞染色用瑞氏染液和姬姆萨1:1混合液，瑞氏-姬姆萨B液为磷酸盐缓冲液，PH=6.4?6.8。
[0039]脱色洗片:把染好的玻片浸入甲醇溶液中I?3min。该过程有两个作用:其一、洗去玻片上多余的瑞氏-姬姆萨的颜色，这样显微镜下粘孢子的观察就不会受到背景色的影响；其二、达到更好的染色效果，粘孢子虫孢质呈深蓝色，极囊浅紫红色，壳片无色透明，整个粘孢子虫形态结构更清晰。
[0040]瑞氏-姬姆萨染料能溶解于甲醇，所以选择甲醇为脱色洗片剂。玻片在甲醇溶液中需要的脱色洗片时间会因玻片上粘孢子虫的种类不同而稍有差异，该步骤对染色的效果起到了决定性作用，所以需在脱色洗片60S、90S、120S等时分别在显微镜下观察脱色洗片效果，从而确定最佳的脱色洗片时间。
[0041]脱水及封片:染好的玻片，分别经过70%、80%、95%、100%梯度酒精脱水2min，然后分别经二甲苯和纯酒精1:1混合液和二甲苯2min后用中性树胶封片。
[0042]粘孢子虫玻片制作方法操作过程简单，整个流程制作一般不超过2小时，如果使用染色架和染缸进行，还可以实现批量制作。染色效果好，在40倍物镜下，粘孢子虫孢质被染成深蓝色、极囊被染成浅紫红色、壳片不着色，这样极囊、孢质和壳片界线分明，孢子的形态结构一目了然；在100倍油镜下，极囊极丝着色较深，极囊其它部分着色较浅，极丝清晰可见，制作好的玻片可以重复观察使用，且能常年保存。
[0043]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
【权利要求】
1.一种便于形态学观察的粘孢子虫染色封存方法，其特征在于包括如下步骤: (1)粘孢子虫悬浮液制作:从保存于福尔马林中的患粘孢子虫病病鱼上取出孢囊放入适量蒸馏水中，弄破孢囊使得粘孢子虫分散悬浮于蒸馏水中，粘孢子虫悬浮液中的孢子虫尽可能有较高浓度，一般以0.01?IXio6Ail为最宜； (2)甘油蛋白粘性玻片制作:用大头针取芝麻大小的甘油蛋白均匀涂在载玻片上，用滴管滴2?3滴粘孢子虫悬浮液于甘油蛋白粘性玻片上，摇晃玻片使粘孢子虫悬浮液均匀地分布于玻片上； (3)烘片:把带有粘孢子虫的玻片在38?42°C干燥箱里烘干，以玻片上液体刚蒸发完为止；或者可以自然条件下晾干； (4)染色:用滴管吸取瑞氏-姬姆萨A液(常规血细胞染色用瑞氏染液和姬姆萨1:1混合液)0.5?0.8ml覆盖于带有粘孢子虫的烘干玻片上,染色5?8min ;再将瑞氏-姬姆萨B液(pH=6.4?6.8的磷酸盐缓冲液)滴加于A液上，滴加量是A液的3倍，以嘴或洗耳球吹出微风使得液面产生涟漪状而充分混合，染色8?IOmin ;用蒸馏水缓慢细流冲掉玻片上多余的染料，直到流下的蒸馏水变为无色为止； (5)脱色洗片:把染好的玻片浸入甲醇溶液中脱色洗片I?3min； (6)脱水及封片:脱色的洗片依次经过70%、80%、95%、100%梯度酒精分别脱水2min，然后分别经二甲苯纯酒精1:1混合液和二甲苯2min后用中性树胶封片。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的甘油蛋白为甘油(丙三醇)与鸡蛋蛋清1:1体积比的混匀液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述的粘孢子虫优选为单极囊的武汉单极虫(Thelohanellus wuhanensis)和双极囊的咽碘泡虫(Myxobolus pharynae)。
【文档编号】G01N1/30GK103808550SQ201410055606
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】陆宏达, 毛毛, 竹攸汀, 李振伟, 卢俊, 余伟楠, 柴下 申请人:上海海洋大学