一种Th17免疫相关因子与IgG4抗体组合物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了Th17免疫相关因子及IgG4抗体组合物及其应用。本发明因子及抗体组合物，含有前炎症因子TNF家族、IL-1β等以及Th17免疫相关因子中一种或多种的组合，与血浆IgG4抗体，用于IgG4综合征类疾病的检测试剂盒的研制，临床诊断以及预测。联合应用的生物标志物是蛋白水平TNF家族因子，IL-1β，Th17免疫相关因子，并联合血清学IgG4抗体含量。试剂盒检测的实现为免疫学检测，比如酶联免疫吸附测定方法（ELISA）、Western?Blot、基于微珠或孔板的多因子检测等。本发明提供的组合检测试剂盒，在IgG4综合征类疾病的检测、诊断及预测中具有广阔的应用前景。
【专利说明】—种Th17免疫相关因子与lgG4抗体组合物及其应用
【技术领域】:
[0001]本发明属于分子医学领域。本发明涉及一种IgG4综合征类疾病检测的组合物，具体涉及一种Thl7免疫相关因子联合IgG4抗体含量组合的的组合物及其应用。
【背景技术】
[0002]自从自身免疫胰腺炎(AIP)的提出，已经有越来越多的AIP病例在西方国家和日本被报道出来。在AIP众多患者免疫组织化学和组织形态学检测的基础上，随着研究的不断深入，Kamisawa等于2003年首次引入IgG4系统性病概念，即IgG4相关性疾病(IgG4Related Disease, IgG4RD)，又称为lgG4多器官淋巴细胞增生综合征，即IgG4综合征。IgG4RD是一种全身性多发疾病，以多器官内IgG4阳性浆细胞及T细胞浸润为特征表现。临床上已经发现IgG4综合征在胰腺、胆管、胆囊、唾液腺、腹膜后腔、肾、肺、前列腺中表现，其中组织纤维化与闭塞的静脉炎为主要的特征。目前为止IgG4相关性疾病尚没有统一的治疗标准，但在治疗过程中发现该类疾病普遍对糖皮质激素治疗反应敏感。但长期激素治疗的不良反应会增多，且停药后多有复发。临床研究中发现，有大量患者虽然血清IgG4抗体含量并未升高，但临床表现仍为全身或部分器官、脏器的纤维化、炎症浸润，我们将这类IgG4血清抗体含量升高或者抗体含量不升高，但临床表现为IgG4综合征的疾病称为IgG4综合征类疾病。这类疾病属于自身免疫性疾病，与某些机体免疫反应或免疫平衡的打乱有关。
[0003]Thl7细胞被定义为一种⑶4阳性的T细胞的亚型，并且与传统的Thl，Th2，Treg等不同。Thl7免疫代表了前炎症反应，并且可以导致各种严重的自身免疫性疾病。前炎症因子如TNF-a，IL-6，IL-1 β等都与Thl7免疫的激活和形成有关。Thl7免疫功能的实现主要与其相关的细胞因子的释放有关，比如IL-17，IL-21，IL-23等。最近，有研究表明Thl7某些相关因子对IgG4抗体的升高有促进作用，所以，IgG4综合征很有可能是一种Thl7导致的自身免疫疾病，但目前为止尚未有明确的定论。
[0004]许多病例报道指出，特发性眼眶炎性假瘤(IOIP)病人血清中IgG4滴度有明显提高，这暗示了 IOIP很有可能是一种IgG4相关眼部疾病表现。而有关IgG4相关疾病如何致使炎症浸润和硬化的机理和病因并没有明确结论。本发明人对21例IOIP患者血浆及组织蛋白样品进行IgG4抗体和前炎性因子、Thl7相关因子组合物蛋白水平测定，利用基于微珠的多因子测定技术，对比对照组样品，IgG4综合征类疾病的检出率可达100%。
[0005]综上所述，寻找免疫上游因子与其可能诱导激活的Thl7免疫反应，以及最终产生的IgG4综合征有很重要的意义。这条通路的验证与生物靶点的确定能够对今后IOIP以及其他IgG4相关疾病的诊断和治疗均有指导性作用。我们针对这一设计思路进行了试验研究。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种TNF家族，IL-1 β和Thl7激活相关因子等生物分子标志物与血清学IgG4抗体含量检测联合应用的组合物，用于IgG4相关疾病诊断试剂盒的研制。本发明的另一目的是提供该因子及抗体组合物的应用。本发明的又一目的是提供制备含有该抗体组合物的试剂盒的方法。
[0007]Thl7免疫相关因子及IgG4抗体组合物，其特征在于包括前炎症因子、Thl7免疫相关因子结合血清学IgG4抗体。
[0008]进一步，分别含有前炎症因子一种或多种、以及Thl7免疫相关因子一种或多种。
[0009]进一步,其特征在于所述血清学IgG4抗体含量是血楽;或血清中IgG4抗体浓度、IgG4浓度占总IgG浓度比例或组织学中免疫组化IgG4阳性浆细胞占总淋巴细胞比例的一种或多种的组合。
[0010]进一步，其特征在于:所述前炎症因子是TNF-a、s⑶40L或IL-1 β。
[0011]进一步，其特征在于:所述Thl7免疫相关因子是IL-17A、IL-31或IL-4。
[0012]还包括所述Thl7免疫相关因子及IgG4抗体组合物在IgG4综合征类疾病检测试剂中的应用。
[0013]还包括所述Thl7免疫相关因子及IgG4抗体组合物组合物的试剂盒。
[0014]其特征在于所述的试剂盒是采用ELISA、放射免疫分析、自动化免疫分析、免疫沉淀、流式微珠测定或液态芯片技术平台制备或测定的。
[0015]本发明的技术方案是:通过蛋白水平上TNF家族因子、IL-1 β、IL_6、IL-4等前炎症因子及下游Thl7激活相关因子中一种或多种的组合与血清学和/或组织学IgG4抗体的组合，作为检测IgG4综合征类疾病的试剂盒的检测试剂，并采用ELISA、放射免疫分析、自动化免疫分析、免疫沉淀、流式微珠测定或液态芯片技(LMMINEX)平台制备和测定
[0016]所述血清学检测方法包括但不限于:ELISA方法、免疫印迹方法、多因子检测方法等免疫学手段。
[0017]所述ELISA及其他免疫学方法中可以为直接检测或间接检测，抗体是特异抗体。所述特异抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
[0018]所述特异抗体可带有标记物，标记物可以是辣根过氧化物酶、荧光素酶、荧光标记、生物素等。
[0019]所述多因子检测方法载体可以是基于蛋白亲和的膜、流式微珠测定或液态芯片技术等。
[0020]所述IgG4抗体检测包含血清学检测和组织学检测。其中，血清学检测又可包括血清或血浆中实际IgG4抗体浓度检测，以及IgG4抗体占总IgG抗体的百分比。依据判断标准，IgG4浓度>135mg/dL或者IgG4/总IgG比值>8%即为IgG4阳性。IgG4组织学检测是指免疫组化方法检测组织切片中IgG4阳性细胞占浆细胞的百分比，组织学检测作为血清学检测的辅助手段，比值高于50%可视为IgG4相关疾病。
[0021]所述IL-1 β，TNF家族因子检测为血清学/局部组织中细胞因子蛋白水平浓度检测及其蛋白或受体基因水平的表达检测。TFN家族因子包括但不限于TNF-a，TNF-β,s⑶40L。所检测的血清学或组织中因子为TNF-a，IL-1 β，s⑶40L等。各因子的选择可以是包含但不限于以上任意基因或因子在内的一种或多种的组合。
[0022]所述Thl7相关因子是指蛋白水平血清学或局部组织中IL-21，IL_6，IL-17，IL-31, IL-33 等。[0023]所述特异抗体是针对前炎性因子及Thl7相关因子的抗体。
[0024]所述前炎性因子特异抗体为TNF- a，s⑶40L，IL-1 β。
[0025]所述Thl7 相关因子特异抗体为 IL-21，IL-17，IL-31，IL-33，IL-4。
[0026]所述含有针对前炎性因子及Thl7相关因子抗体和IgG4抗体的组合物在IOIP诊断试剂中的应用。
[0027]检测各蛋白水平包括血清学和组织学因子的阳性判断标准规定为:病理样品数值/对照组平均数值>1.5，推荐比值为大于2判断为阳性，但由于具体实验中各样品差异较大，可适当放宽检测标准。成组检验中，T检验P值在P〈0.05范围内视为结果可信。IgG4综合征类疾病阳性的判断标准为:IgG4抗体检测为阳性，并且中至少各有一种来自前炎性因子、Thl7相关因子的指标为阳性。
[0028]本发明的有益效果:
[0029]本发明联合IgG4抗体，前炎性因子(TNF-α，SCD40L，IL-1i3 )，Thl7免疫相关因子(IL-17A，IL-31，IL-4)，对21例由北京同仁医院已确诊的IOIP病人(Ι0ΙΡ患者被临床上认定属于IgG4综合征患者)血浆及蛋白样品和9例对照组海绵状血管瘤样品进行蛋白水平测定分析，可用于实验室判断IgG4综合征类疾病，其准确性可达100%。大样本量及准确性结果说明本发明的技术方案达到了临床诊断的要求，可进一步用于制备IgG4综合征诊断试剂。
[0030]本发明还提供了制备试剂盒的方法，可以采用ELISA(酶联免疫吸附测定)、放射免疫分析、自动化免疫分析、免疫沉淀、流式微珠测定或液态芯片技术(Bio-rad)平台制备和测定。优选液态芯片技术平台制备。多因子检测液态芯片技术(Bio-plex)是一种新型生物分子高通量检测技术，也是目前唯一得到权威机构和FDA共同认可用于临床诊断应用的生物芯片平台，具有比传统ELISA更高的灵敏度和高通量的优势，本发明的抗体组合物运用液态芯片技术平台制备成试剂盒可进一步提高其敏感度和特异度。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]附图1:免疫组化检测IOIP患者(上排)与对照组(下排)IgG4阳性淋巴细胞(物镜为40倍放大)
[0032]附图2 =IOIP与对照组局部病灶组织蛋白样品多因子检测
[0033]附图3 =IOIP与对照组血浆样品多因子检测
【具体实施方式】:
[0034]附表I试剂盒检测组织蛋白和血浆各因子及IgG4抗体
[0035]
【权利要求】
1.Thl7免疫相关因子及IgG4抗体组合物，其特征在于包括前炎症因子、Thl7免疫相关因子结合血清学IgG4抗体。
2.根据权利要求1所述Thl7免疫相关因子及IgG4抗体组合物，其特征在于分别含有前炎症因子一种或多种、以及Thl7免疫相关因子一种或多种。
3.根据权利要求1所述Thl7免疫相关因子及IgG4抗体组合物，其特征在于所述血清学IgG4抗体含量是血浆或血清中IgG4抗体浓度、IgG4浓度占总IgG浓度比例或组织学中免疫组化IgG4阳性浆细胞占总淋巴细胞比例的一种或多种的组合。
4.根据权利要求1所述Thl7免疫相关因子及IgG4抗体组合物，其特征在于:所述前炎症因子是TNF- a、SCD40L或IL-1 β。
5.根据权利要求1所述Thl7免疫相关因子及IgG4抗体组合物，其特征在于:所述Thl7免疫相关因子是IL-17A、IL-31或IL-4。
6.根据权利要求1-5任意一项所述Thl7免疫相关因子及IgG4抗体组合物在IgG4综合征类疾病检测试剂中的应用。
7.一种含有权利要求1-5所述任意一项所述Thl7免疫相关因子及IgG4抗体组合物组合物的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒是采用ELISA、放射免疫分析、自动化免疫分析、免疫沉淀、流式微珠测定或液态芯片技术平台制备或测定的。
【文档编号】G01N33/543GK103808924SQ201410062762
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月24日 优先权日:2014年2月24日
【发明者】马雪梅, 赵鹏翔, 吴亚楠, 王晓月, 谢飞, 刘蕴琦, 王明连 申请人:北京工业大学