一种电致化学发光成像装置及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种电致化学发光成像装置，包括物镜、光传输通道、单光子检测电子倍增CCD和电致化学发光发生器，所述电致化学发光发生器包括ITO电极、银电极和电压发生器，其中，所述物镜、光传输通道和单光子检测电子倍增CCD依次连接；所述ITO电极与电压发生器相连的正极连接，所述银电极与电压发生器的负极连接。本发明还提出了一种上述电致化学发光成像装置在可视化检测双氧水中的应用以及该装置在可视化检测单细胞表面外泄双氧水和可视化检测细胞表面分子上的应用。本发明的电致化学发光成像装置组成简单，可进行平行快速检测，检测通量大，操作简便，发光效率高。
【专利说明】一种电致化学发光成像装置及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化工【技术领域】，具体地涉及一种电致化学发光成像装置及其应用。
【背景技术】
[0002]应用电化学技术对单细胞进行成像研究可以得到细胞表面化学组分和局部活性等重要生物信息，目前最通用的显微仪器为电化学扫描显微镜。这个显微镜是利用一根微电极扫描单一活细胞的表面来检测具有电活性的化学物种。通过降低电极尺寸至纳米级别可使得电化学扫描显微镜的空间分辨率达到纳米级别。该技术的缺陷在于:每一个细胞表面必须单一独立检测，因此检测的通量被严重限制。作为除了电化学扫描显微镜的另一种选择，近期发展的基于表面等离子共振的电化学成像技术利用了局部的电化学信号和表面等离子共振信号之间的关系来进行单细胞成像。虽然这种新技术通过对多细胞的平行检测提高了检测通量，但是表面等离子共振技术由于自身检测灵敏度差，因此很难对单细胞中外泄的生物分子或者细胞表面低丰度分子进行检测。
[0003]电致化学发光是一种高灵敏的电化学方法。它利用电化学反应激发的物质从激发态回到基态的同时，发射光来实现对分子的检测。鉴于整个电极表面生物分子产生的光都会被单光子检测电子倍增电子耦合元件(CCD)接收，因此基于电致化学发光的成像技术具有高通量和高灵敏度的优势，具备目前两种单细胞用电化学成像技术的优点。现有电致化学发光成像已经用于对电极表面的模糊指纹和蛋白质层的成像。最新技术可对微球表面的抗原成像。该技术通过引入浓度高达毫摩尔级别的共反应物，就可以在0.4微米的区域中产生能够检测到的光信号，进而将空间分辨率推到亚微米级别。
[0004]虽然电致化学发光成像技术显示具有对细胞表面抗原成像的潜力，我们在将此项技术用于对单细胞分子外泄过程进行成像时受到了挑战。因为释放出的分子浓度非常低，通常是在微摩级别。虽然在鲁米诺存在的情况下，这些释放出的分子通过其氧化酶而转变成可电致化学发光的双氧水，但要实现在亚微米的区域中，且加上秒级别的采样时间(时间分辨率)范围内，对如此低浓度的生物分子获取可检测的光信号，还是不太可能的。
【发明内容】
[0005]发明目的:为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提出一种构造简单，收光效率高，可实现对单细胞中外泄的生物分子或者细胞表面低丰度分子进行检测的电致化学发光成像装置及其应用。
[0006]技术内容:为实现上述技术目的，本发明提出一种电致化学发光成像装置，包括物镜、光传输通道、单光子检测电子倍增CCD和电致化学发光发生器，所述电致化学发光发生器包括ITO电极银电极和电压发生器，其中，所述物镜、光传输通道和单光子检测电子倍增CCD依次连接；所述ITO电极与电压发生器的正极相连，所述银电极和电压发生器的负极相连。[0007]其中，所述物镜为5倍镜、10倍镜、20倍镜、40倍镜和100倍镜中的任意一种，物镜的N.A.越大越好。优选地，所述物镜为N.A.为0.50的20倍镜。根据对空间分辨率的要求选择合适的物镜及其N.A值。
[0008]本发明还提出了上述的电致化学发光成像装置在可视化检测双氧水中的应用。
[0009]具体地，所述应用包括如下步骤:在ITO玻璃片的表面粘贴O型圈作为溶液室，以ITO玻璃片为工作电极，银电极为对电极，将发光试剂和双氧水加入到O型圈内，在单光子检测电子倍增CCD曝光的同时向ITO电极施加周期性的发光电压-恢复电压，检测成像效
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[0010]其中，所述的发光试剂为所述的发光试剂为L012、鲁米诺、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺、异硫氰酸异鲁米诺中的任意一种，用量为浓度为100 μ M?500 μ Μ，优选地发光试剂为LO12，发光试剂的用量为100 μ M?500 μ Μ，优选地为200 μ M0
[0011]其中，所述双氧水的检测范围为10?200 μ Μ。
[0012]优选地，单光子检测电子倍增CCD曝光的时间为两个发光电压-恢复电压周期，其中，一个发光电压-恢复电压周期为:发光电压:1.0±0.1V的正电压下2±ls ;恢复电压:-1.0±0.1V的负电压下0.5±0.25s。更为优选地，所述周期性的发光电压-恢复电压的一个周期为:发光电压:1.0V的正电压下2s ;恢复电压:-1.0V的负电压下0.5s。
[0013]本发明还提出了上述装置在可视化检测单细胞表面外泄双氧水中的应用。
[0014]具体地，所述可视化检测单细胞表面外泄双氧水的步骤包括:在ITO玻璃片的表面粘贴O型圈作为溶液室，以ITO玻璃片为工作电极，银电极为对电极，将细胞在溶液室中培养，向溶液室中加入发光试剂，然后加入PMA刺激细胞内的NADPA氧化酶使细胞表面产生双氧水，在单光子检测电子倍增CCD曝光的同时向ITO电极施加周期性的发光电压-恢复电压，检测成像效果。
[0015]其中，所述的发光试剂为L012、鲁米诺、N-(4_氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺和异硫氰酸异鲁米诺中的任意一种，用量为100 μ M?500 μ Mo优选地发光试剂为L012，发光试剂的用量为ΙΟΟμΜ?500μΜ，优选地为200 μ Μ。
[0016]优选地，单光子检测电子倍增CCD曝光的时间为两个发光电压-恢复电压周期，其中，一个发光电压-恢复电压周期为:发光电压:1.0±0.1V的正电压下2±ls ;恢复电压:-1.0±0.1V的负电压下0.5±0.25s。更为优选地，所述周期性的发光电压-恢复电压的一个周期为:发光电压:1.0V的正电压下2s ;恢复电压:-1.0V的负电压下0.5s。
[0017]本发明还提出了上述装置在可视化检测细胞表面分子上的应用。
[0018]具体地，包括如下步骤:在ITO玻璃片的表面粘贴O型圈作为溶液室，以ITO玻璃片为工作电极，银电极为对电极，将细胞在溶液室中培养，向溶液室中加入发光试剂，利用细胞表面的待测分子对应的氧化酶将所述待测分子转化为双氧水，在单光子检测电子倍增CCD曝光的同时向ITO电极施加周期性的发光电压-恢复电压，检测成像效果。
[0019]其中，所述的发光试剂为L012、鲁米诺、N-(4_氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺和异硫氰酸异鲁米诺中的任意一种，用量为100 μ M?500 μ Mo优选地发光试剂为L012，发光试剂的用量为ΙΟΟμΜ?500μΜ，优选地为200μΜ。
[0020]优选地，单光子检测电子倍增CCD曝光的时间为两个发光电压-恢复电压周期，其中，一个发光电压-恢复电压周期为:发光电压:1.0±0.1V的正电压下2±ls ;恢复电压:-1.0±0.1V的负电压下0.5±0.25s。更为优选地，所述周期性的发光电压-恢复电压的一个周期为:发光电压:1.0V的正电压下2s ;恢复电压:-1.0V的负电压下0.5s。
[0021]有益效果:与现有技术相比，本发明有如下优点:
[0022](I)本发明的电致化学发光成像装置组成简单，收光率高，可进行平行快速检测，且检测的空间分辨率可以通过物镜倍率和单光子检测电子倍增CCD进行调节，并通过电位调节来促进发光效率，获取可检测的信号，同时，可以直接将培养细胞的ITO电极放置于显微镜平台上检测，不用进一步修饰电极，因此可以方便的将本电致化学发光发光分析技术用于生物研究，且可以同时获得ITO表面所有细胞的发光信息从而加大了检测的通量，对于单细胞检测具有重要意义。
[0023](2)通过在电致化学发光检测的过程中加载周期性的发光电压和恢复电压，可以避免在电极上持续施加高压会导致电极失活，提高发光效率。
[0024](3)本发明的电致化学发光成像方法可以有效地检测低浓度的双氧水，且具有高的电致化学方法精确度，并可以检测单细胞表面双氧水的外泄，从而可以为不同状态下的细胞释放的双氧水提供其存在的亚微米分布的证据。
[0025](4)本发明的电致化学发光成像方法可以为药物分析提供活化膜胆固醇的分布信息，通过对细胞活化胆固醇的成像为细胞胆固醇运输研究提供了更多的生物学信息。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明的电致化学发光成像装置的示意图；
[0027]图2为组合电压膜式和恒电压膜式对双氧水发光检测的影响；
[0028]图3为不同的电压频率和不同的曝光时间对成像信噪比的影响；
[0029]图4为溶液中双氧水的可视化检测，其中，A为ITO电极的胶带覆盖区域和裸露区域的边界的明场照片；B为加入200 μ M L012后的发光图；C为加入200 μ M 1^012和1(^皿双氧水的发光图；D为C和B图的差分伪彩色图；E为不同浓度双氧水和发光强度之间的关系图；
[0030]图5为细胞表面双氧水外泄的可视化检测，其中，A为ITO电极上的Hela细胞图的明场照片为加入200 μ M L012的发光图；C为细胞经过PMA刺激的发光图；D为图B和C之间的发光差分图；E为明场照片和差分照片的叠加图丨为细胞外泄双氧水的伪彩色图；
[0031]图6为ITO电极上的Hela细胞加入PBS缓冲液的检测示意图，其中，A为明场照片；B为加入200 μ M L012的发光成像图；C为200 μ M L012中加入PBS (IOmM)的发光成像图；D为图B和图C的发光成像差分图；其中，亮度调节到了最佳可视程度；
[0032]图7为ITO电极上ACAT被抑制的Hela细胞在200 μ M L012存在下的检测图像，其中A为明场照片；Β为加入胆固醇氧化酶前后的发光差分图；C为图A和B的叠加图;?为选中的两个细胞的活化膜胆固醇的分布的伪彩色图；Ε为ACAT和HMGCoA共同被抑制的细胞在加入胆固醇氧化酶前后的发光差分图；F为ACAT被抑制的细胞和ACAT、HMGCoA共同被抑制的细胞发光强度柱状图；其中，图中的偏差为图B和图E中细胞区域的发光强度的标准偏差;
[0033] 图8为ITO电极上ACAT、HMGCoA同时被抑制的Hela细胞加入200 μ M L012的检测图像，其中，A为明场照片；B为加入IU / ml胆固醇氧化酶前后发光差分图《为明场图和差分图的叠加图。
【具体实施方式】
[0034]本发明的电致化学发光成像装置的示意图如图1所示，包括物镜、光传输通道、单光子检测电子倍增CCD和电致化学发光发生器，所述电致化学发光发生器包括ITO电极、银电极和电压发生器，其中，物镜、光传输通道和单光子检测电子倍增CXD依次连接，所述ITO电极与电压发生器的正极相连，银电极和电压发生器的负极相连。在下述各实施例中，除非另外说明，各个ITO电极上粘贴的作为溶液室的O型圈的直径均为1cm，检测的溶液量为600 μ L。
[0035]实施例1溶液中双氧水的可视化检测。
[0036](I)检测条件的确定。
[0037]在实验中，在氧化铟锡(ITO)玻璃片上粘贴直径为Icm的O型圈作为溶液室，并以该ITO玻璃片为工作电极，选择L012作为正电压下的发光物质。L012是一种鲁米诺类似物，在双氧水存在下具有比鲁米诺更高的发光效果，所以被选作正电压下的发光物质。向O型圈内滴加200 μ M的L012和100 μ M的双氧水，共计600 μ L。鉴于L012和双氧水在ITO玻璃电极上的发光峰值电压为1.0V(其中，1.0V为双氧水在ITO电极表面上电分解的峰值电压，然后产生的氧自由基使得L012发光，所以对不同的发光试剂，发光峰值电压都差不多，因此，对于其他的发光试剂，如鲁米诺、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺、异硫氰酸异鲁米诺等的发光电压均在0.9V?1.1V之间)，因此在CCD曝光的同时在电极上施加1.0V恒电压使得L012和双氧水得到最大的发光强度。然而，在电极上持续施加这样的高压会导致电极失活，不利于发光。为了避免电极失活，我们在电极上施加一个负电压-1.0V，使得电极更新恢复。因此电极电压采用1.0V和-1.0V转换模式来获得更多的发光信号。每一个电压转换周期包括2s的1.0V电压,再转换施加0.5s的-1.0V电压。和恒电压模式相比，这种组合电压模式可以使得L012-双氧水获得更强的发光效果(如图2所示)。这种组合电压模式对发光效果的放大表明了它对于ECL成像的重要性。发光效果会因为曝光时间的延长进一步得到增强。但是对于单细胞成像来说，最短的曝光时间可以获得更好的时间分辨率。为了平衡这两个参数比较了不同的电压频率和不同的曝光时间对成像信噪比的影响，如图3所示。最终我们选择了 5s的曝光时间，也就是两个电压周期作为成像实验的参数。
[0038](2)电致化学发光成像装置可视化检测双氧水。
[0039]用一张胶带贴在ITO玻璃片表面，利用加电压条件下裸露的ITO会发光，而被胶带覆盖的地方不会发光这样的现象，来验证用本发明的电致化学发光成像装置来可视化检测双氧水是可行的。图4A显示了明场下玻璃裸露区域和胶带区域的边界。在玻璃裸露区域和胶带区域的边界处粘贴Icm的O型圈作为溶液室，使玻璃裸露区域和胶带区域各占一半。在无双氧水的情况下，L012会在电压作用下自发光，向ITO表面的O型溶液室内加入200 μ M的L012，记录在黑暗环境下L012的背景光。结果如图4Β所示。和预期的一样，在ITO裸露区域拍到了微弱的发光，而胶带区域则是全黑。当加入了 10 μ M的双氧水之后，继续在黑暗环境下拍照(图4C)。为了测定双氧水产生的发光强度，利用软件Image J来计算图4B与图4C之间的差别，差分图用伪彩色染色之后，如图4D所示。由L012和双氧水产生的反应导致在ITO裸露区域得到更高的光强，证明我们的系统能够有效的观测到低浓度的双氧水。明场照片和发光差分图的胶带边缘形状的一致性说明电致化学发光成像的精确度。在ITO区域随机选取直径为50 μ m的区域计算发光强度，得到的光强相对偏差为2.63%。得到的光强的均一性保证了检测在ITO不同区域培养细胞，并进行成像分析的精确性。
[0040]本发明电致化学发光成像装置的空间分辨率由物镜和CXD控制。尽管拥有较大数值孔径(N.A.)的高倍率物镜可以增加收光效率，越高放大倍率会导致每个像素呈现的实际尺寸越小，从而使得每个像素得到的光强降低至检测限以下。在本检测体系中，物镜是N.A为0.50的20倍镜作为最佳选择。同时，为了收集弱发光，采用了低分辨率(512X512)的单光子检测电子倍增CXD (EM (XD)。由于CXD每个像素16 μ m,物镜为20倍放大，所以计算得到检测体系的空间分辨率为0.8 μ m。本成像装置可以通过增大物镜倍率实现0.4 μ m的成像质量，但是需要通过延长曝光时间或者增加双氧水浓度来获得。考虑到我们需要低检测限和短曝光时间，物镜的倍率仍然被固定在20倍，所获取的0.8 μ m的空间分辨率也适合于单细胞分析。
[0041](3)双氧水的浓度和组合电压对ECL成像的影响。
[0042]为了检测双氧水浓度和发光强度之间的关系，固定L012的浓度为200 μ Μ，在检测体系中不断升高双氧水浓度并完成成像过程。在扣除了没有双氧水存在的背景光之后，发光强度根据双氧水的浓度不同而不同，如图4Ε所示。发光强度和双氧水浓度之间的正相关关系表明图像的光强度可以反映出局部的双氧水浓度，最低可见的双氧水浓度为10 μ Μ。作为对比，在电极上施加1.0v的恒电压的条件下，最低可见双氧水浓度为50 μ M0这一可视检测限的改进确定了使用组合电压用于ECL成像的重要性。
[0043]实施例2单细胞表面外泄双氧水的可视化检测。
[0044]单细胞外泄双氧水成像是将100-5000个Hela细胞培养在ITO玻璃片上的溶液室中，然后用IOyUOng / ml的巴豆醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA，Phorbol 12-myristate-13_acetate,简称佛波酯,购买自 sigma-aldrich,货号为 P8139)刺激产生双氧水。据报导，PMA会刺激细胞内的NADPA氧化酶而使得双氧水量积累,从而导致双氧水外泄。根据相同的成像步骤，得到了在L012存在条件下的明场图和背景图(图5A和5B)。在发光图中，由于细胞贴附在电极表面阻碍了 L012扩散到电极表面，从而呈现为较暗的强度。细胞在PMA刺激以后释放出双氧水后，立刻拍照，得到一张发光图(图5C)。通过将图5C扣除背景图5B，得到图中细胞变亮(图OT)。细胞发光应该不是由扩散到细胞上的氧自由基与L012接触产生的，因为从叠加图上看在细胞周围并没有发光现象(图5E)。在排除了自由基扩散导致发光的可能性之后，细胞底部存在L012就是对此现象的唯一解释。对于贴壁细胞，细胞膜的褶皱被认为会在细胞底部和支撑物表面形成微小的空间，从而造成了 L012在细胞和电极之间的存在。经过刺激之后，细胞底部表面释放的双氧水在电压作用下产生自由基，并与细胞底部的L012发生反应，产生发光。采用软件ImageJ，通过对每个像素光强的计算，参考图4E中的光强信号，细胞表面拍到的光强通过标记不同颜色来转换成双氧水的浓度在10?30 μ M(图5F)。该结果显示出双氧水外泄的不均匀性。
[0045]在对照组实验中用ρΗ7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)替代ΡΜΑ，使得细胞不会受到刺激。其成像图片如图6所示。减去了背景之后的发光图显示没有任何光增强情况出现在细胞区域。对照组细胞没有任何双氧水释放，所以正如预期的，这些细胞没有发光。发光强度和双氧水外泄的相关性表明我们的实验方法是可以为不同状态下的细胞释放的双氧水提供其存在亚微米分布的依据。
[0046]和电化学扫描显微镜对细胞双氧水成像相比，使用电致化学发光成像方法有着装置简单和可以平行快速检测的优势。对于电致化学发光成像，将培养细胞的ITO电极放置于显微镜平台上检测，电极不需要进一步修饰。这种简单的方法可以促进电致化学发光分析技术用于生物研究。同时，可以同时获得ITO表面所有细胞的发光信息加大了检测的通量，这对于单细胞检测是十分有意义的。6个细胞的发光信号显示的对于平均光强的标准偏差为10.0%，这反映出不同细胞外泄的双氧水量的波动较小。
[0047]实施例3单细胞表面分子的电致化学发光成像。
[0048]除了可以对细胞释放的双氧水进行成像，本发明的电致化学发光成像方法还可以利用细胞表面的分子对应的氧化酶将它们转化为双氧水，从而实现对细胞表面分子的成像。为了证明可对细胞表面分子成像，我们选择了胆固醇作为模板分子，检测细胞膜活化胆固醇分子的分布。活化胆固醇具有较高的化学势(逃离趋势)，它对细胞膜胆固醇运输具有重要作用。虽然细胞膜胆固醇已经可以利用荧光胆固醇类似物或者flipin来成像，但是因为这些荧光探针无法区分活化胆固醇和非活化胆固醇，因此细胞表面活化胆固醇从未被成功成像。而本发明的电致化学发光方法可以利用活化胆固醇与胆固醇氧化酶反应生成双氧水这一特性，通过ECL成像的方法来对活化胆固醇进行成像。实验中，细胞首先在含有sandoz58035 (购买于sigma-aldrich,货号为S9318)的培养液中处理过夜,通过抑制酰基辅酶 a_ 胆固醇酸基转移酶(acyl-coA / cholesterol acyltransferase) (ACAT)蛋白，实现更多的胆固醇在细胞膜中积累，从而增加胆固醇的活性。当细胞暴露在胆固醇氧化酶和L012环境中，这两个物质都会扩散至细胞底部的微小空隙中。当胆固醇氧化酶和活化胆固醇反应产生双氧水后，施加电压就会实现电致化学发光成像。明场和加入胆固醇氧化酶之后的发光差异图分别如图7A，7B所示。从图7B来看，细胞表面出现比周围更亮的光强度，展示我们可以看到细胞表面的活化细胞膜胆固醇。从加入了伪彩色的图7C和局部放大图(图7D)上可以看到细胞表面的活化胆固醇分布存在一定的不均匀度。
[0049]阴性对照组的实验使用他汀类药物来对ACAT被抑制的细胞中的3-hydroxy-3_methylglutaryl-CoA(3-轻基-3-甲基戍二酰辅酶A还原酶,HMGCoA)的活性进行抑制,导致减少细胞内的胆固醇合成从而减低细胞膜上的活化胆固醇。发光强度的差分图如图7E以及图8中的明场照片和叠加照片所示。从HMGCoA和ACAT同时被抑制得到细胞发光图可以知道，虽然这类细胞中的细胞内胆固醇和膜胆固醇总量大大降低，但是活化胆固醇依然存在。和ACAT被抑制的细胞发光相比，HMGCoA, ACAT同时被抑制的细胞产生的弱发光证明了 ECL成像方法可以为药物分析提供活化膜胆固醇的分布信息。本次对细胞活化胆固醇的成像为细胞胆固醇运输研究提供了更多的生物学信息。
[0050]综上所述，本发明采用了一套空间分辨率为0.8 μ m的ECL成像系统对细胞外泄的双氧水和细胞膜活化胆固醇进行了成像。电极表面细胞发光可以使得多个细胞同时成像，因此这一套简单的系统拥有高检测通量。后续研究将着眼于更高效的ECL发光探针来增加发光强度来达到更高的信噪比以获得更高分辨率的单细胞成像图。
【权利要求】
1.一种电致化学发光成像装置，其特征在于，包括物镜、光传输通道、单光子检测电子倍增CCD和电致化学发光发生器，所述电致化学发光发生器包括ITO电极、银电极和电压发生器，其中，所述物镜、光传输通道和单光子检测电子倍增CXD依次连接；所述ITO电极与电压发生器的正极相连，银电极和电压发生器的负极相连。
2.权利要求1所述的电致化学发光成像装置在可视化检测双氧水中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤:将发光试剂和双氧水加入到O型圈内，在单光子检测电子倍增CCD曝光的同时向ITO电极施加周期性的发光电压-恢复电压，检测成像效果。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发光试剂为L012、鲁米诺、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺和异硫氰酸异鲁米诺中的任意一种，用量为ΙΟΟμΜ?500μΜ。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述双氧水的检测范围为10?200μ Μ。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，单光子检测电子倍增CCD曝光的时间为两个发光电压-恢复电压周期，其中，一个发光电压-恢复电压周期为:发光电压:1.0±0.1V的正电压下2± Is ;恢复电压:-1.0±0.1V的负电压下0.5±0.25s。
7.权利要求1所述的装置在可视化检测单细胞表面外泄双氧水中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤:在ITO玻璃片的表面粘贴O型圈作为溶液室，以ITO玻璃片为工作电极，银电极为对电极，将细胞在溶液室中培养，向溶液室中加入发光试剂，然后加入PMA刺激细胞内的NADPA氧化酶使细胞表面产生双氧水，在单光子检测电子倍增CCD曝光的同时向ITO电极施加周期性的发光电压-恢复电压，检测成像效果。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的发光试剂为L012、鲁米诺、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺和异硫氰酸异鲁米诺中的任意一种，用量为ΙΟΟμΜ?500μΜ。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，单光子检测电子倍增CCD曝光的时间为两个发光电压-恢复电压周期，其中，一个发光电压-恢复电压周期为:发光电压:`1.0±0.1V的正电压下2± Is ;恢复电压:-1.0±0.1V的负电压下0.5±0.25s。
11.权利要求1所述的装置在可视化检测细胞表面分子上的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，包括如下步骤:在ITO玻璃片的表面粘贴O型圈作为溶液室，以ITO玻璃片为工作电极，银电极为对电极，将细胞在溶液室中培养，向溶液室中加入发光试剂，利用细胞表面的待测分子对应的氧化酶将所述待测分子转化为双氧水，在单光子检测电子倍增CCD曝光的同时向ITO电极施加周期性的发光电压-恢复电压，检测成像效果。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的发光试剂为L012、鲁米诺、N- (4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，N- (6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺和异硫氰酸异鲁米诺中的任意一种，用量为ΙΟΟμΜ?500μΜ。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，单光子检测电子倍增CCD曝光的时间为两个发光电压-恢复电压周期，其中，一个发光电压-恢复电压周期为:发光电压:`1.0±0.1V的正电压下2 ± Is ;恢复电压:-1.0±0.1V的负电压下0.5±0.25s。
【文档编号】G01N21/76GK103913447SQ201410126893
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月31日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】方丹君, 江德臣, 周俊宇 申请人:南京医科大学