一种适用于双向电泳的大鼠海马全蛋白提取与分离的方法
【专利摘要】本发明公开了一种适用于双向电泳的大鼠海马全蛋白提取与分离的方法，步骤：（1）置于冰冻人工脑脊液中；（2）研磨前在研钵中倒入液氮预冷；（3）将悬浊液在室温下静置；（4）将上清液分装；（5）在蛋白质团块中加RB；（6）取5、10、15、20、25、30、35μg的BSA制作标准曲线；（7）分析胶的上样量为银染；（8）取出干胶条室温下复温；（9）在等电聚焦盘中加入覆盖油；(10)将等电聚焦处理；11）取处理的胶条进行复温；（12）用上槽液配置低熔点琼脂糖；（13）取凝胶进行考马斯亮蓝染色，制图。方法易行，操作简便，适合大鼠海马组织蛋白样品的提取，获得蛋白点较多且清晰水平条纹，重复性较好的双向电泳图谱。
【专利说明】一种适用于双向电泳的大鼠海马全蛋白提取与分离的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质分离鉴定【技术领域】，更具体涉及一种大鼠海马组织样品全蛋白提取与分离的方法，可以有效地分离海马组织蛋白，显示蛋白质差异以及随后鉴定这些蛋白质，适用于大鼠神经系统功能相关的毒理学研究和药物筛选。
【背景技术】
[0002]蛋白质是生物体生命活动的主要执行者。随着人和动物等大量生物全基因组序列的破译和功能基因组研究的展开，生命科学家越来越关注生物体内蛋白质的组成及其活动规律。目前，国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。由于蛋白质组学研究比基因组学研究更接近实用，有着巨大的市场前景，已成为西方各主要发达国家、各跨国制药集团竞相投入的“热点”。然而，整体上蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是技术限制的。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于蛋白质分离纯化技术方法水平的高低。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究及相关领域的主要任务。
[0003]双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究中的一种核心关键技术之一。其基本原理是第一向基于蛋白质的等电点用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，最终把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面分开。同时结合质谱技术对分离的蛋白质逐一进行鉴定。因其在蛋白质组与医学研究中所处的重要位置，被广泛用于蛋白质转录及转录后修饰研究，蛋白质组的比较和蛋白质间的相互作用，毒理蛋白组学、细胞分化凋亡研究，致病机制及耐药机制的研究，疗效监测，新药开发，癌症研究，蛋白纯度检查，小量蛋白纯化，生殖发育生物学等许多方面。然而，双向凝胶电泳技术本身存在的步骤繁琐、不稳定和低灵敏度等一系列缺点大大限制了其应用。更为重要的是，双向电泳技术的有效性、可靠性以及可重复性都依赖于所分析蛋白样品的制备。对于大多数动物组织而言，双向电泳蛋白样品的制备及整个技术体系吗，没有统一的方法和程序。绝大多数的样品都需要通过多次试验摸索最适宜的条件，费时费力，实验成本较高。
[0004]实验大鼠最常采用模式动物，大鼠海马组织是神经毒理研究中涉及蛋白组学研究必不可少的材料。因此，如何针对大鼠海马组织，建立一套有效的、可重复的样品制备方法及双向电泳技术体系，对整个双向电泳技术的大规模推广应用具有重要意义。本发明在多次分别尝试了国内外目前普遍采用的匀浆液提取法、裂解液提取法、裂解液提取/丙酮沉淀法等大鼠白提取基础上，提出了改良的裂解液提取-超声磨碎-丙酮沉淀蛋白质方法，并优化了整个双向电泳技术体系，建立了适合大鼠海马组织双向电泳样品制备和分离的方法，得到了分辨率较高和重复性较好的电泳图谱。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是在于提供了一种大鼠海马组织样品全蛋白的分离方法，方法易行，操作简便，本实验采用的改良的裂解液提取-超声磨碎-丙酮沉淀蛋白质方法能有效避免蛋白质损失及蛋白质的体外化学修饰，更适合大鼠海马组织蛋白样品的提取，从而获得蛋白点较多且清晰水平条纹，重复性较好的双向电泳图谱。
[0006]一种适用于双向电泳的大鼠海马全蛋白提取与分离的方法，其步骤是:
(I)、将实验用SPF级大鼠(已死亡)后，置于冰冻人工脑脊液(ACSF)中约lmin，取脑组织，置于冰冻ACSF中约30 S，冰上分离出海马组织，同组内的海马称重。
[0007](2)、大鼠海马组织的研磨前先在研钵中倒入液氮预冷，然后将(I)处理的海马组织约I g剪碎后置于研钵中，迅速加入液氮。当研钵中液氮不再沸腾后迅速研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可。
[0008](3)、将步骤(2)处理后的悬浊液在室温(20 - 25°C，以下相同)下静置lh，使蛋白充分溶解，在研钵中加入800 μ L裂解液(LB)，充分溶解(收集)粉末后转移至1.5mL EP管中，再加400yL LB涮一次研钵，转移到相同的EP管中。超声处理(80W，0.8秒开，0.8秒关，超声10下后放于冰上冷却，再重复6次)，破碎核酸，40C，12000r/min,离心20min，收集
上清液。
[0009](4)、将步骤(3)处理后的上清液分装成4管,每管约250 μ L,每管再加入ImL丙酮_20°C沉淀过夜。沉淀完的蛋白质于4°C，12000r/min,离心20min，倒去上清液，打开管盖平放于干净的纸巾上自然干燥， 即可得到处理后的蛋白质团块，_80°C保存备用。
[0010](5)、在步骤(4)处理后的每管蛋白质团块中加入200uL RB，用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打(5 - 20次)直至蛋白质充分分散。超声助溶，80W，0.8秒开，0.8秒关，超声4次后放于冰上冷却((TC)，再重复I次，超声后4°C，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中。
[0011](6)、取5、10、15、20、25、30、35μ g的BSA制作标准曲线，标准曲线的制作方法如下:
【权利要求】
1.一种适用于双向电泳的大鼠海马全蛋白提取与分离的方法，其步骤是: (1)、将实验用SPF级大鼠后，置于冰冻人工脑脊液中lmin，取脑组织，置于冰冻ACSF中.30 S，冰上分离出海马组织，同组内的海马称重； (2)、大鼠海马组织的研磨前先在研钵中倒入液氮预冷，将步骤(1)处理的海马组织Ig剪碎后置于研钵中，加入液氮，研钵中液氮不再沸腾后研磨，直至组织变成粉末，均匀颗粒; (3)、将步骤(2)处理后的悬浊液在室温下静置lh，使蛋白溶解，在研钵中加入SOOyL裂解液，溶解粉末后转移至1.5mL EP管中，再加400yL LB涮一次研钵，转移到相同的EP管中，超声处理，破碎核酸，4°C，12000r/min，离心20min，收集上清液； (4)、将步骤(3)处理后的上清液分装成4管，每管250μ L，每管再加入ImL丙酮_20°C沉淀过夜，沉淀完的蛋白质于4°C, 12000r/min,离心20min,倒去上清液,打开管盖平放于干净的纸巾上自然干燥，到处理后的蛋白质团块，_80°C保存备用； (5)、在步骤(4)处理后的每管蛋白质团块中加入200uLRB，用枪头将蛋白质团块戳小后吹打直至蛋白质分散，超声助溶，超声后放于冰上冷却，再重复I次，超声后4°C，12000r/min,离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中； (6)、取5、10、15、20、25、30、35μg的BSA制作标准曲线，取步骤(4)处理后的EP管中上清液2~3 μ L，每支管加入ImL Bradford进行染色，涡旋振荡20s，混匀后测定吸光值，测定两个样品之间的操作间隔 是20s，定量分两次进行，第一次为初步定量，计算得到各样品的浓度，再进行第二次定量，为了定量的准确性，每次定量都制作标准曲线； (7)、分析胶的上样量为银染100μ g，质谱胶的上样量为1200 μ g，上样液的成分为:相应量的蛋白质、1%w/vDTT、l%v/vIPG Buffer、I X BPB、RB至460 μ L，根据步骤(6)中定量所得的浓度数据吸取相应量的蛋白质； (8)、从冰箱取出干胶条室温下复温lOmin，水浴，23°C，步骤(7)中吸取的样本溶液均匀地加入槽底，加样长22cm，取出胶条，从酸性端开始，撕下覆盖膜，胶面朝下，酸性端朝顶端将胶条放入水化盘的槽中，放好胶条后再加入1.2mL覆盖油于支持膜上保湿，调节室内温度为20°C，让胶条泡胀过夜，记录下胶条的号码； (9)、在等电聚焦盘中加入覆盖油，每条泳道加入6mL，取出步骤(8)处理后的胶条并吸干胶条上的覆盖油，胶面朝上将胶条放入等电聚焦盘中，剪好纸垫片，每个垫片加入75μ LMilli Q水进行润湿，将纸垫片放胶面的两端，边缘与胶面边缘对齐，装上电极板，选择胶条数量后开始运行程序，一向等电聚焦程序为:SI stp 300V 0:30Hr ；S2 stp 700V 0:30Hr ；S3stp 1500V l:30Hr ；S4 grd 9000V 3: OOHr ；S5 stp 9000V 4: OOHr，整个聚焦过程所用总电压:52KVh ； (10)、将步骤(9)等电聚焦处理完以后，取出胶条，吸干表面的覆盖油，胶面朝上将胶条放入平衡管中，_20°C保存； (11)、取出步骤(10)处理的胶条进行复温，水浴，23°C，加入IOmL去离子水洗掉胶条表面的覆盖油，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡，先加IOOmM DTT平衡15min，倒干净平衡液后加入250mM IAA平衡15min，IAA平衡时要避光； (12)、用上槽液配置0.8%w/v的低熔点琼脂糖40mL，1.5%w/v的普通琼脂糖80mL，烧熔后放于泡沫盒中保温备用，倒掉玻璃板胶面上的液体，残留的液体用滤纸片吸干，吸取低熔琼脂糖封住整个胶面，取出步骤(11)中平衡后的胶条，接上电极后开始SDS-PAGE电泳电泳，BPB跑出二向胶以后停止电泳，二向电泳的程序为:S1 2ff/gel 45min ；S2 17ff/gel,直到溴酚蓝跑到底，4:30h ； (13)、取出步骤(12)处理后的凝胶进行考马斯亮蓝G-250染色，染色好凝胶放入透射扫描仪中扫描，制图，并用专用分析软件进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种适用于双向电泳的大鼠海马全蛋白提取与分离的方法，其特征在于:所述的超声破碎处理程序如下:80W，0.8秒开，0.8秒关，超声10下后放于冰上冷却，再重复6次，破碎核酸，40C，12000r/min,离心20min，收集上清液。
3.根据权利要求1所述的一种适用于双向电泳的大鼠海马全蛋白提取与分离的方法，其特征在于:所述的步骤(9)中一向等电聚焦程序为:SI stp 300V 0:30Hr
S2stp 700V 0:30Hr
S3stp 1500V 1:30Hr
S4grd 9000V 3:OOHr
S5stp 9000V 4:OOHr 整个聚焦过程所用总电压:52KVh。
4.根据权利要求1所述的一种适用于双向电泳的大鼠海马全蛋白提取与分离的方法，其特征在于:所述的二向SDS-PAGE电泳的程序为:S1 2ff/gel 45min ； S2 17ff/gel直到溴酚蓝跑到底，4:30h ； 所述的步骤(12)中二向SDS-PAGE电泳灌胶液成分和含量如下:
【文档编号】G01N1/34GK103884576SQ201410134638
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】王江华, 李广宇, 袁勇超, 党垚, 李静 申请人:华中农业大学