一种用于检测水体中痕量汞的电化学传感器及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】一种用于检测水体中痕量汞的电化学传感器，所述传感器包括一可在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，玻碳电极的反应端表面沉积有石墨烯层，所述石墨烯层的表面沉积有纳米金层，所述纳米金层的表面上自组装有巯基修饰的可利用T-Hg2+-T错配形成双链DNA结构的汞特异性寡核苷酸探针；本发明采用汞特异性核苷酸探针在反应端表面进行自组装，构建可特异性捕获汞离子的立体反应域，用于高效检测水体中痕量汞，具有结构简单、实用、制作和使用方便、抗环境冲击力强、选择特异性好、超灵敏等优势。
【专利说明】—种用于检测水体中痕量汞的电化学传感器及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及汞离子含量的检测【技术领域】，尤其涉及一种用于检测汞离子的电化学传感器及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]汞及其化合物对环境和人体健康的危害十分巨大，高效灵敏地监测分析食品、水体以及与人类生活息息相关的环境中的汞含量，具有重大的现实意义。
[0003]传统的汞分析方法包括耦合等离子质谱、原子发射光谱、原子荧光光谱法、离子色谱法等，这些分析方法均存在预处理步骤繁琐，设备昂贵，操作复杂等缺陷，限制了传统方法在环境样品痕量汞检测中的应用。近年来，传感器技术作为一种新型的检测手段，正在快速发展。由于传感器在用于汞的检测过程中，容易受到其他金属元素的影响，抗环境冲击力弱，其选择特异性和检测灵敏度还有待提高。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种结构简单、实用、制作和使用方便的可用于高效检测水体中痕量汞的电化学传感器及其制备方法，还提供一种操作简单、抗环境冲击力强、选择特异性好、超灵敏的检测水体中痕量汞的应用方法。
[0005]为解决上述技术问题，提供了一种用于检测水体中痕量汞的电化学传感器，传感器包括一在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，玻碳电极的反应端表面沉积有石墨烯层，石墨烯层的表面沉积有纳米金层，纳米金层的表面上自组装有巯基修饰的可利用T-Hg2+-T错配形成双链DNA结构的汞特异性寡核苷酸探针。汞特异性寡核苷酸探针可以与任何汞特异性寡核苷酸探针发生T-Hg2+-T错配形成双链DNA的核苷酸链进行反应，构建可特异性捕获汞离子的立体反应域，从而达到检测水体中痕量汞的目的。
[0006]在本发明中，汞特异性寡核苷酸探针作为捕获探针，优选为具有SEQ ID N0.1的核苷酸序列。
[0007]进一步的；电化学传感器还包括目标探针，目标探针为可与所述捕获探针通过T-Hg2+-T错配形成双链DNA结构的核苷酸序列，目标探针优选为具有SEQ ID N0.2的核苷酸序列。
[0008]进一步的，为了扩大反应信号，电化学传感器还包括信号指示探针；信号指示探针为可与目标探针通过互补配对形成双链DNA结构的核苷酸序列，信号指示探针优选为标记有甲基蓝的金载信号指示探针，进一步的优选为具有SEQ ID N0.3的核苷酸序列。
[0009]在本发明的电化学传感器中，玻碳电极、目标探针、信号指示探针是三个单独存在的部分，当电化学传感器应用于痕量汞的检测时，将玻碳电极、目标探针、信号指示探针置于待检测水体中，使三者之间发生杂化作用。其中玻碳电极反应端的捕获探针与目标探针发生T-Hg2+-T错配反应；信号指示探针与目标探针发生互补配对反应。[0010]作为本发明的同一技术构思，本发明还提供了上述的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0011](I):制作一玻碳电极，在玻碳电极反应端表面进行预处理，然后进行电沉积步骤使石墨烯沉积在玻碳电极的反应端表面得到具有石墨烯层的玻碳电极；
[0012](2):采用计时电流法将纳米金颗粒沉积在具有石墨烯层的玻碳电极反应端表面形成空间反应域；
[0013](3):取巯基修饰的可利用T-Hg2+-T错配形成双链DNA结构的汞特异性寡核苷酸探针在反应端表面进行自组装，构建可特异性捕获汞离子的立体反应域；完成电化学传感器的制作。
[0014]进一步的，步骤(I)中电沉积步骤为:在氮气保护下，将玻碳电极浸入氧化石墨烯中，米用循环伏安法反复扫描-1.5?0.5V范围。
[0015]进一步的，步骤(2)中计时电流法为将具有石墨烯层的玻碳电极反应端浸入氯金酸和高氯酸的混合溶液中，在0.2V电位下电沉积30s以上。混合溶液中氯金酸和高氯酸的摩尔浓度比优选为1:1。
[0016]作为本发明的同一技术构思，本发明还提供了一种采用前述的电化学传感器或采用前述制备方法制得的电化学传感器在检测水体中痕量汞中的应用，包括以下步骤:
[0017]反应:将电化学传感器的玻碳电极反应端置于加有目标探针的待测溶液中进行T-Hg2+-T错配反应，T-Hg2+-T错配反应完成后，再加入信号指示探针，使信号指示探针与所述目标探针进行互补配对。前述反应过程中，玻碳电极反应端与目标探针进行T-Hg2+-T错配反应时间优选为30min以上；目标探针与信号指示探针进行互补配对时间优选为30min以上；待检测溶液的PH值优选为6.0?8.0 ;
[0018]电化学检测:将经过反应的电化学传感器接入三电极系统的电解池中并作为工作电极进行电化学检测，用方波伏安法测定响应峰电流的变化，当响应峰电流值在2.975微安以上时，表明待测溶液中含有汞离子。电化学检测过程中电解池内电解质溶液的pH值为7.0?7.5 ;方波伏安法测定响应峰电流的过程中，脉冲振幅为25mV，脉冲频率为10Hz，步阶脉冲为4mV，扫描电位区间为-0.7V?0V。
[0019]进一步的，当待测溶液中存在汞离子时，汞离子含量与响应峰电流的变化满足以下线性关系:
[0020]y = (1.2286±0.0473) XlogC+(3.2367±0.2664)
[0021]其中，y表示响应峰电流变化的测定值，单位μ A ;C表示环境水样中汞离子的浓度值，单位 amol.L—1,检测下限达至Ij 0.1amol.I71, R2 为 0.9872。
[0022]本发明的创新点在于:
[0023]本发明采用巯基修饰的可利用T-Hg2+-T错配形成双链DNA结构的汞特异性寡核苷酸探针在所述反应端表面进行自组装，构建可特异性捕获汞离子的立体反应域。当待测溶液中有Hg2+存在时，汞特异性寡核苷酸可作为捕获探针(即具有SEQ ID NOl的核苷酸序列)，与目标探针(即具有SEQ ID N02的核苷酸序列)上3 ’端序列TGTGTTTCAC发生T-Hg2+-T错配，形成DNA双链结构；而目标探针上5’端序列GTGGAGAGA与信号指示探针(即具有SEQID N03的核苷酸序列)上3’端序列TCTCTCCAC完全互补，可形成DNA双链结构，并且信号探针上富含的鸟嘌呤(G)与甲基蓝(MB)之间具有亲和能力，使用MB标记，可以获得充足的指示信号，提升传感器的响应敏感性。MB作为电活性信号指示剂进行电化学表征，最后利用方波伏安法测定峰电流变化，通过线性回归方程即可定量检测待测环境样品中汞离子的含量。
[0024]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0025](I)本发明提供的电化学传感器，在玻碳电极的表面自组装有汞特异性寡核苷酸，这种富含胸腺嘧啶(T-T)的汞特异性寡核苷酸片段与汞离子发生T-Hg2+-T错配形成双链DNA结构，可以特异性识别汞离子，并具有良好的可操作性和检测精度；同时电化学传感器的结构简单、实用，制作和使用方便。
[0026](2)本发明提供的电化学传感器，在玻碳电极表面依次电沉积有石墨烯层和纳米金层，石墨烯因为其超级电子传递率和低阻抗，可以大大改善传感器敏感元件的电导性；纳米金可以改善电子传导率，同时在这里也为固定DNA探针提供反应位点，大大提升传感器的检测灵敏度。
[0027](3)本发明的信号指示探针采用甲基蓝作为标记信号的金载信号指示探针，其中纳米金作为载体，负载更多的信号指示探针，而更多的信号指示探针又可以负载更多的甲基蓝，得到足够的指示信号，起到放大信号响应的功能，使检测更加灵敏，检测下限达到
0.1amol -L10
[0028](4)本发明提供的电化学感应器在检测水中汞离子的应用，不仅操作简单、抗环境冲击力强，而且灵敏度超高，同时特异性强，即使存在K+、Ba2+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Cr2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Pb2+、Zn2+、Al3+、Fe3+或者它们的混合物进行干扰检测的前提下，本发明的电化学传感器对汞离子的特异性反应仍然保持良好，可以有效地检测出水体中的汞离子，并可对其浓度进行定量分析。
[0029]除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0031]图1为本发明的电化学传感器的结构示意图。
[0032]图2为本发明的电化学传感器在用于检测汞离子时的检测原理示意图。
[0033]图3为本发明的电化学传感器在用于检测汞离子时考察pH值条件的影响分析图。
[0034]图4为本发明实施例中进行电化学检测时汞离子含量与电流变化的线性回归图。
[0035]图例说明:
[0036]在附图中，1、铜棒；2、PVC管；3、玻碳棒，S1、巯基修饰的汞特异性寡核苷酸探针；S2、目标探针的核苷酸序列；S3、信号探针的核苷酸序列。
【具体实施方式】
[0037]以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
[0038]实施例[0039]以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售，其中CHI660B电化学系统购于上海辰华仪器公司。
[0040]实施例1:
[0041]参照图1，本发明提供的一种电化学传感器，包括作为工作电极的玻碳电极。在玻碳电极的反应端表面沉积有石墨烯层和纳米金层，纳米金层上自组装有巯基修饰的可利用T-Hg2+-T错配形成双链DNA结构的汞特异性寡核苷酸探针(即图1中的SI)。上述的电化学传感器中，经过巯基修饰后的汞特异性寡核苷酸探针SI的核苷酸序列为具有SEQ ID N0.1的核苷酸序列，具体为:5’ -SH-(CH2)6-GTG TTT CTC A-3’。
[0042]同时参照图2，电化学传感器还包括目标探针和信号指示探针，当待测溶液中有Hg2+存在时，固定在电化学感应器的玻碳电极反应端表面的萊特异性寡核苷酸SI作为捕获探针(即具有SEQ ID NOl的核苷酸序列)，与目标探针S2(即具有SEQ ID N02的核苷酸序列，具体为 5’ -GTGGAGAGAGGGTGTGTTTCAC-3’)上 3’ 端序列 TGTGTTTCAC 发生 T-Hg2+-T 错配，形成DNA双链结构；而目标探针上5’端序列GTGGAGAGA与信号指示探针S3 (即具有SEQ ID N03的核苷酸序列，具体为:5’ -AAAAAGGGAGGGAGGGAGGGTCTCTCCAC-3’)上 3’ 端序列 TCTCTCCAC完全互补，可形成DNA双链结构。同时信号指示探针采用甲基蓝(MB)进行标记，形成信号扩大机制。
[0043]当待测溶液中不存在Hg2+时，固定在电化学感应器的玻碳电极反应端表面的汞特异性寡核苷酸SI并不能与目标探针S2和信号指示探针S3发生杂化作用，目标探针S2和信号指示探针S3不能被固定到玻碳电极上。
[0044]实施例1的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0045](I)玻碳电极的制备:首先制作一玻碳电极(直径3mm),该玻碳电极主要由空心的PVC管2和填充于PVC管2中的芯棒组成，芯棒的主体采用铜棒1，铜棒I的一端外露，另一端位于PVC管2内并连接玻碳棒3，再由玻碳棒3延伸至玻碳电极反应端的端表面(参见图1);玻碳电极制作完成后，在其反应端的端表面进行预处理。预处理的方法为:首先，分别使用300nm和50nm的氧化招糊抛光玻碳电极反应端的端表面,再使用体积比为1:1:1的HNO3、丙酮和水混合溶液超声处理清洁该端表面；进一步采用电化学蚀刻的方法处理玻碳电极，在0.5M的H2SO4中，循环伏安法反复扫描-0.4?1.5V的范围，直至曲线重合，再用水冲洗电极，晾干待用。
[0046](2)采用循环伏安法将石墨烯沉积在玻碳电极反应端表面:在氮气保护下，将经过预处理的玻碳电极浸入氧化石墨烯分散液中，采用循环伏安法反复扫描-1.5?0.5V范围。利用循环伏安扫描过程中电位不断改变，将氧化石墨烯还原成石墨烯，扫描8圈以上直至循环伏安曲线发生明显变化得到具有石墨烯层的玻碳电极。用氮气将具有石墨烯层的玻碳电极吹干，备用。
[0047](3)采用计时电流法将纳米金颗粒沉积在具有石墨烯层的玻碳电极表面:把具有石墨烯层的玻碳电极反应端浸入摩尔浓度比为1:1的氯金酸和高氯酸的混合溶液中，在
0.2V电位下电沉积30s以上，使具有石墨烯层的玻碳电极表面沉积有纳米金层，得到具有纳米金层的玻碳电极。
[0048](4)在具有纳米金层的玻碳电极表面进行自组装:取具有SEQ ID N0.1的核苷酸序列的捕获探针0.3 μ mol溶于含有0.1mM三(2-羧乙基)膦、ImM EDTA和1.0M KCl的IOmMTris-HCl缓冲液中得到混合溶液，将混合溶液滴加在具有纳米金层的玻碳电极反应端表面，室温下自组装180min。然后用IOmM Tris - HCl缓冲液洗去具有纳米金层的玻碳电极上弱吸附的汞特异性寡核苷酸，再滴加巯基己醇培养30min，构建成可特异性捕获离子汞的立体反应域，完成电化学传感器的制作。
[0049](5)制备目标探针:采用汞特异性寡核苷酸目标探针，具有SEQ ID N0.2的核苷酸序列。
[0050](6)制备金载信号指示探针:在搅拌条件下，将足量的冰硼氢化钠溶液加入氯金酸和柠檬酸钠混合溶液中，进行反应得到反应产物，将反应产物在黑暗处静置3h，水解去除多余的硼氢化钠，制得纳米金。
[0051]再将信号指示探针负载到纳米金表面:将具有SEQ ID N0.3的核苷酸序列的信号指示探针加入纳米金分散液中得到混合液，4°C条件下过夜，在混合液中加入含有0.1MNaCl的IOmM PBS缓冲液中，以1000Orpm的速度离心得到沉淀，在沉淀中加入足量的MB溶液标记20分钟,使MB标记在信号指示探针中；然后高速离心去除多余的MB得到沉淀,将沉淀分散在含0.3M NaCl的IOmM PBS缓冲液中，得到金载信号指示探针。
[0052]实施例1的电化学传感器在检测水中痕量汞中的应用，具体包括以下步骤:
[0053](I)将电化学传感器的反应端置于待检测的水样中，加入足量与捕获探针发生充分的T-Hg2+-T错配反应的目标探针，如果待检测的环境水样中含有汞离子，则上述的目标探针将与玻碳电极上固定的汞特异性寡核苷酸捕获探针利用T-Hg2+-T错配特异性捕获环境水样中的离子萊，并在电极表面形成双链结构，反应时间为30min以上。
[0054](2)然后将金载信号指示探针滴加在电化学传感器的反应端，使金载信号指示探针与电化学传感器上的目标探针进行充分互补配对，互补配对在室温下进行，互补配对反应30min以上。
[0055](3)处理完成后再将电化学传感器接入25mL电解池的三电极系统中并作为工作电极(即基底电极)进行电化学检测，饱和甘汞电极作为参比电极，钼片电极作为对电极，同时采用CHI660B电化学系统与电解池中的三电极系统相连接，用方波伏安法测定响应峰电流的变化以进行信号识别和定量分析，根据所产生的电流信号的强弱对应待检测环境水样中汞离子的浓度及含量。当响应峰电流值在2.975微安以上时，表明待测环境水样中含有汞离子。以上所有的检测操作均在室温(例如25°C )下完成。
[0056]在上述应用方法中，目标探针的浓度为0.δμπιο?.L—1，金载信号指示探针的浓度
在本发明中，目标探针的添加量和金载信号指示探针的浓度并不仅限于此，目标探针的添加量足以与捕获探针发生T-Hg2+-T错配反应就能实现本发明的目的；同时金载信号指示探针的浓度足以与目标探针发生错配反应就能实现本发明的目的。
[0057]在上述三电极系统的控制与监测过程中，本发明以甲基蓝标记的金载信号指示探针作为电活性信号指示剂，在充分考察了含不同浓度离子汞的环境水样及不同的测定反应条件后，发现在脉冲振幅25mV、脉冲频率10Hz、步阶脉冲4mV、扫描电位区间-0.7~OV的电化学参数条件下，在待测溶液pH值范围为5.5~9.0、汞离子浓度为10~1.0X10namOl.l-1时，电流对离子汞的响应比较显著:以含汞离子浓度为
1.0X104amoI.l-1的样品为例，当pH值为5.5时，电流值为4.3270微安；当pH值为6时，电流值为6.5090微安；当pH值为6.5时，电流值6.8080微安；当pH值为7时，电流值为7.8670微安；当pH值为7.5时，电流值为8.0800微安；当pH值为8时，电流值为6.2390微安；当PH值为8.5时，电流值为5.9160微安；当pH值为9时，电流值为2.5590微安。其中，在待测溶液pH值范围6.0~8.0具有较强的电化学信号，最佳的pH值范围为7.0~
7.5(考察pH值的影响及条件优化分析如图3所示)，此条件下具有较强的抗环境冲击能力，为方便起见，本实施例中的相关检测均在PH7.0条件下完成。
[0058]在优化后的前述反应条件下(优化反应条件参见表1)，我们建立了电流变化与离子汞含量之间的线性关系(参见图4)。从图4中可知，电流值与汞离子浓度的线性回归方程为:
[0059]y = (1.2286±0.0473) XlogC+(3.2367±0.2664)
[0060]其中，y表示响应峰电流变化的测定值，单位μ A ;C表示环境水样中汞离子的浓度值，单位amol.L_\上述线性关系曲线的线性范围为IOamol.L—1~1.0X 109amol.L—1,检测下限达到 0.1amol.?Λ R2 为 0.9872。
[0061]表1:最佳检测操作工艺条件
[0062]
【权利要求】
1.一种用于检测水体中痕量汞的电化学传感器，所述传感器包括一在三电极系统中用作工作电极的玻碳电极，其特征在于，所述玻碳电极的反应端表面沉积有石墨烯层，所述石墨烯层的表面沉积有纳米金层，所述纳米金层的表面上自组装有巯基修饰的可利用T-Hg2+-T错配形成双链DNA结构的汞特异性寡核苷酸探针。
2.根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于，所述汞特异性寡核苷酸探针为捕获探针，所述电化学传感器还包括目标探针和信号指示探针；所述目标探针为可与所述捕获探针通过T-Hg2+-T错配形成双链DNA结构的核苷酸序列；所述信号指示探针为可与所述目标探针通过互补配对形成双链DNA结构的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的电化学传感器，其特征在于，所述捕获探针为具有SEQIDN0.1的核苷酸序列；所述目标探针为具有SEQ ID N0.2的核苷酸序列；所述信号指示探针为标记有甲基蓝的金载信号指示探针，所述金载信号指示探针的核苷酸序列为具有SEQ IDN0.3的核苷酸序列。
4.一种如权利要求1至3中任意一项所述的电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制作一玻碳电极，在所述玻碳电极的反应端表面进行预处理，然后进行电沉积步骤使石墨烯沉积在所述玻碳电极的反应端表面得到具有石墨烯层的玻碳电极； (2)采用计时电流法将纳米金颗粒沉积在所述具有石墨烯层的玻碳电极的反应端表面形成空间反应域； (3)取巯基修饰的可利用T-Hg2+-T错配形成双链DNA结构的汞特异性寡核苷酸探针在反应端表面进行自组装，构建可特异性捕获汞离子的立体反应域，完成电化学传感器的制作。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的电沉积步骤为:在氮气保护下，将所述玻碳电极浸入氧化石墨烯中，采用循环伏安法反复扫描-1.5V~0.5V范围8圈以上。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的计时电流法为:将所述具有石墨烯层的玻碳电极反应端浸入氯金酸和高氯酸的混合溶液中，在0.2V电位下电沉积30s以上。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中氯金酸和高氯酸的摩尔浓度比为1:1。
8.一种用权利要求1至3中任意一项所述的电化学传感器或采用权利要求4至7中任意一项所述制备方法制得的电化学传感器在检测水体中痕量汞中的应用，其特征在于，包括以下步骤: 反应:将所述电化学传感器的玻碳电极反应端置于加有目标探针的待测溶液中进行T-Hg2+-T错配反应，T-Hg2+-T错配反应完成后，再加入信号指示探针，使信号指示探针与所述目标探针进行互补配对； 电化学检测:将电化学传感器接入三电极系统的电解池中并作为工作电极进行电化学检测，用方波伏安法测定响应峰电流的变化，当响应峰电流值在2.975微安以上时，表明待测溶液中含有汞离子。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:当所述待测溶液中存在汞离子时，所述汞离子含量与所述响应峰电流的变化满足以下线性关系:y = (1.2286±0.0473) X 1gC+(3.2367±0.2664) 其中，y表示响应峰电流变化的测定值，单位μ A ;C表示环境水样中汞离子的浓度值，单位amol.L S检测下限达到0.1amol.L S R2为0.9872。
10.根据权利要求8或9中所述的应用，其特征在于，所述反应过程中，玻碳电极反应端与目标探针进行T-Hg2+-T错配反应时间为30min以上；所述目标探针与信号指示探针进行互补配对时间为30min以上；所述待测溶液的pH值为6.0~8.0 ;所述电化学检测过程中电解池内电解质溶液的PH值为7.0~7.5 ;所述方波伏安法测定响应峰电流的过程中，脉冲振幅为25mV，脉冲频率为10Hz，步阶脉冲为4mV，扫描电位区间为-0.7V~0V。
【文档编号】G01N27/48GK104007155SQ201410200658
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月13日 优先权日:2014年5月13日
【发明者】章毅, 曾光明, 汤琳, 陈俊, 竺园, 张长, 晏铭, 冯冲凌 申请人:湖南大学