一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法，以利用胶原酶对胶原蛋白的特异性降解作用对胶原酶进行酶谱分析。电泳过程中所采用的凝胶为在10％SDS-PAGE凝胶中添加质量体积比浓度为0.1％的Ⅰ型胶原蛋白。凝胶的处理过程为：电泳结束后先将凝胶用洗脱液振荡洗脱，随后用漂洗液振荡漂洗，最后将凝胶用孵育液在37℃下静置孵育12h；孵育结束后将凝胶先经考马斯亮蓝R-250染色液染色1h，再经脱色液室温振荡脱色直至透明条带清晰。该方法将Ⅰ型胶原蛋白配制到SDS-PAGE凝胶中,凝胶中Ⅰ型胶原蛋白的终浓度为0.1％，在该底物浓度下，胶原酶负染条带以及标准蛋白质标准条带能够同时在凝胶上显色，填补了胶原酶酶谱检测领域的技术空白。
【专利说明】一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物蛋白酶检测【技术领域】，具体涉及一种用于筛选微生物胞外胶原酶 的酶谱方法。
【背景技术】
[0002] 酶谱分析技术是在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE)凝胶电泳的基础上 发展而来的。酶谱分析技术是指使用含有底物蛋白的凝胶进行电泳或在电泳后将不含底物 蛋白的凝胶浸泡在底物溶液中，再通过孵育、染色、脱色的方法显示经酶作用后底物蛋白的 染色情况的变化，进而对酶活性进行定性分析。
[0003] 虽然酶谱分析的方法常被用来检测蛋白酶类的活性，但现有酶谱技术仍然存在以 下几点技术缺陷：
[0004] (1)目前的酶谱技术是在聚丙烯酰胺凝胶上检测到蛋白酶负染条带在聚丙烯酰胺 凝胶上的位置，但经常由于底物背景过深而导致不能直接显示蛋白质Marker条带，因此难 以通过酶谱分析直接确定未知蛋白酶的分子量。
[0005] (2)目前的酶谱分析技术分析蛋白酶的分子量时，一般需要制备两块凝胶，一 块凝胶内配制了高浓度的底物蛋白，另一块胶不包含底物蛋白而用来分析蛋白质量标准 (Protein Marker);电泳结束后，含有底物蛋白的凝胶进行负染，而不含底物蛋白的凝胶直 接进行考马斯亮蓝染色；染色结束后将两块胶进行比对，测定目标蛋白酶的分子量。但是凝 胶中高浓度的底物蛋白会影响蛋白酶在胶中的迁移率，进而可能导致蛋白酶的分子量计算 出现较大偏差。
[0006] (3)若采用将凝胶浸泡在底物溶液中的方法，容易导致蛋白酶的透明条带分辨率 低，条带不够集中而清晰。
[0007] (4)目前的酶谱分析中在凝胶孵育过程中常用NaNjt为防腐剂以避免产酶微生物 对结果的影响，效果虽然很好但NaN 3的毒性很强，存在一定的危险性。
[0008] 胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶（Collagenase)，生理pH和温度条件下胶原 酶能够特异性地降解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而其他蛋白酶类则不具备此功能。胶 原酶可以广泛应用于医学、食品、化妆品等工业生产中。医学研究中，常用胶原酶治疗腰间 盘突出症、瘢痕疙瘩、血栓、溃疡、脓疮等疾病，它有不损伤胞膜及神经细胞且不破坏乳酪蛋 白、血红蛋白、硫酸角质素等蛋白质的优点，治疗效果安全有效。工业应用中，常用胶原酶 降解动物来源的胶原蛋白，其酶解产物易于被人体吸收与利用，添加至食品及化妆品中可 改善人的体质及肤质。
[0009] 胶原酶是一种底物特异性极高的蛋白酶，因为胶原酶与蛋白酶的底物完全不同， 胶原酶具有较强的专一性，对其他类型蛋白水解能力差。目前的酶谱技术无法应用于胶原 酶。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种用于筛选微生物胞 外胶原酶的酶谱方法，利用胶原酶对胶原蛋白的特异性降解作用对胶原酶进行酶谱分析。 [0011] 为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
[0012] 一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法，包括电泳和凝胶的处理步骤，所述 电泳过程中所采用的凝胶为在10% SDS-PAGE凝胶中添加质量体积比浓度为0. 1 %的I型 月父原蛋白。
[0013] 所述凝胶的处理过程为：电泳结束后先将凝胶用洗脱液在室温条件下振荡洗脱 2次，随后用漂洗液在室温条件下振荡漂洗2次，最后将凝胶用孵育液在37°C下静置孵育 12h ;孵育结束后将凝胶先经质量体积比为0. 1%的考马斯亮蓝R-250染色液染色lh，再经 脱色液室温振荡脱色直至透明条带清晰；
[0014] 所述洗脱液的组成为：由pH值为7. 6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液、聚乙二 醇辛基苯基醚和CaCl2组成，所含聚乙二醇辛基苯基醚的体积百分比为2. 5 %，CaCl2的浓度 为 5mmol/L ；
[0015] 所述漂洗液的组成为：由pH值为7. 6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液和CaCl2 组成，CaCl2的浓度为5mmol/L ;
[0016] 所述孵育液的组成为：pH值为7. 6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液、十二烷基 聚乙二醇醚、NaCl和CaCl2，其中，十二烷基聚乙二醇醚的浓度为0.02%，NaCl的浓度为 200mmol/L、CaCl 2 的浓度为 5mmol/L ；
[0017] 所述考马斯亮蓝染色液的组成为：1L考马斯亮蓝染色液中含有1. 0g考马斯亮蓝 R-250、450mL甲醇和100mL冰醋酸；
[0018] 所述脱色液的组成为：1L脱色液中含有100mL无水甲醇和100mL冰乙酸。
[0019] 所述电泳过程中所采用的凝胶由浓缩胶和分离胶组成，所述分离胶的组成为：pH 值为8. 8、浓度为1. 5mol/L的Tris-HCl缓冲液24. 7%，质量体积比浓度为30%的丙烯酰 胺与甲叉双丙烯酰胺凝胶贮液的混合物33. 3 %，质量体积比浓度为10 %的SDS水溶液1 %， 质量体积比浓度为10 %的过硫酸铵的水溶液1 %，Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基乙二胺0. 1 %，质量体 积比浓度为1%的I型胶原蛋白水溶液10%，余量为超纯水；所述浓缩胶的组成为：ρΗ值为 6. 8、浓度为0. 5mol/L的Tris-HCl缓冲液25%，质量体积比浓度为30%的丙烯酰胺与甲 叉双丙烯酰胺凝胶贮液的混合物16 %，质量体积比浓度为10 %的SDS水溶液1 %，质量体 积比浓度为10%的过硫酸铵的水溶液0. 5%，Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基乙二胺0. 1 %，余量为超纯 水。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0021] 1、本发明的方法通过将I型胶原蛋白配制到SDS-PAGE凝胶中，凝胶中I型胶 原蛋白的终浓度为0.1% (w/ν)。在该底物浓度下，胶原酶负染条带以及标准蛋白质标准 (Protein Marker)条带能够同时在凝胶上显色，这样既能保证检测到目标蛋白酶的负染条 带，同时也能在胶上检测到蛋白质量标准（ProteinMarker)的条带，克服了高浓度底物蛋 白对目标胶原酶迁移率的影响，大大减少了胶原酶分子量计算中的误差，使得目标胶原酶 的分子量测定更准确，填补了胶原酶酶谱检测领域的技术空白。
[0022] 2、本发明的酶谱筛选方法中，在凝胶的孵育液中添加了无毒的十二烷基聚乙二醇 醚（Brij-35)代替了 NaN3用于防腐，提高了实验的安全性。
[0023] 3、本发明的酶谱筛选方法中凝胶的配制方法及处理方法简易可行，成本低廉。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1所示为利用本胶原酶谱分析方法检测蜡样芽孢杆菌CGMCC N0. 8614经过培养 不同时间后所产胞外胶原酶的结果。
[0025] 图中1 :M为蛋白标准；1-7分别为培养6、12、18、24、30、36、4211后的蜡样芽孢杆菌 CGMCC N0. 8614 粗酶液。
[0026] 图2所示为用硫酸铵浓缩以后的粗酶液SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝溶液染色后 的结果。
[0027] 图2中：Μ为蛋白标准；1为硫酸按沉淀浓缩后的粗酶液总蛋白。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0029] 实施例1
[0030] 1、蜡样芽孢杆菌R75E的分离纯化
[0031] (1)取lmL采集的人初乳用无菌超纯水稀释100倍后取200 μ L稀释液均匀涂布 于5%脱脂奶粉平板上，于37°C培养12h，获得菌落周围具有明显透明圈的菌落。将涂布获 得的菌落用牙签挑取分离，于5%脱脂奶粉平板上进行多次划线培养，每次培养条件均为 37°C、12h，获得菌株，将其命名为R75E。R75E菌株在5%脱脂奶粉平板上37°C培养12h后 的结果如图1所示，从图1中可以看出，在5%脱脂奶粉平板上菌株R75E的单菌落周围出现 明显透明圈，经测量发现菌落直径大小约为3mm，透明圈直径约8mm。
[0032] (2)从步骤⑴中的5%脱脂奶粉平板上挑取菌株R75E的单菌落，分别接种至两 管5mL LB液体培养基中培养，培养条件为37°C，150r/min，培养12h。培养结束后于1. 5mL 无菌离心管分别加入0. 8mL菌液和0. 2mL灭过菌的浓度为80 %的甘油溶液，混合均匀后可 长期保存于_8〇°C冰箱中。
[0033] 2、蜡样芽孢杆菌R75E的鉴定
[0034] (1)细菌的形态特征
[0035] 菌落形态：将得到的具有最佳蛋白降解效果的菌株R75E于37°C下在LB固体培养 平板上划线培养生长12h后，菌落为灰白色，不透明，边缘不整齐、表面较粗糙，似融蜡状， 菌落较大，约3mm。细菌形态：菌体细胞呈杆状，菌体两端较平整，多数呈链状排列。芽胞呈 椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端。菌体大小：通过光学显微镜利用其目镜测微尺与镜 台测微尺对菌株R75E单个细胞的大小进行测量，通过测量可知单个细胞宽约为1-2 μ m，长 约为3-5 μ m。细菌好氧性观察：挑取实施例1中菌株R75E的单菌落于LB液体培养基中， 试管密封，于37°C，培养15h。如果细菌分布于整个溶液中，则是兼性厌氧菌；如果主要分布 于培养液表面而内部几乎无菌，贝 1J是好氧菌。菌株R75E在LB液体培养基中密封培养后，澄 清透明的LB液体培养基变浑浊，细菌分布于整个溶液，表明R75E菌株为兼性厌氧菌。
[0036] (2)菌株R75E的16S rDNA序列分析
[0037] 根据细菌基因组16S rDNA的保守序列设计用于PCR鉴定的引物对，如 SEQID No: 1 所示的引物 PI (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和 SEQ ID No:2 所示的引物 P2(5-CTACGGCTACCTTGTTACGACT-3)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0038] 用无菌牙签挑取实施例1中所得菌株R75E的单菌落于100 μ 1无菌水充分混匀， 获得菌悬液即为扩增16S rDNA片段的模板。50 μ L菌落PCR反应体系中各成分如下：
[0039]
【权利要求】
1. 一种用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法，包括电泳和凝胶的处理步骤，其特 征在于，所述电泳过程中所采用的凝胶为在10% SDS-PAGE凝胶中添加质量体积比浓度为 0. 1%的I型胶原蛋白。
2. 根据权利要求1所述的用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法，其特征在于，所述 凝胶的处理过程为：电泳结束后先将凝胶用洗脱液在室温条件下振荡洗脱2次，随后用漂 洗液在室温条件下振荡漂洗2次，最后将凝胶用孵育液在37°C下静置孵育12h ;孵育结束后 将凝胶先经质量体积比为〇. 1 %的考马斯亮蓝R-250染色液染色lh，再经脱色液室温振荡 脱色直至透明条带清晰； 所述洗脱液的组成为：由pH值为7. 6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液、聚乙二醇辛 基苯基醚和CaCl2组成，所含聚乙二醇辛基苯基醚的体积百分比为2. 5%，CaCl2的浓度为 5mmol/L ； 所述漂洗液的组成为：由pH值为7. 6、浓度为50mmol/L Tris-HCl缓冲液和CaCl2组成， CaCl2 的浓度为 5mmol/L ; 所述孵育液的组成为巾11值为7.6、浓度为50臟〇1/11^8-!1(：1缓冲液、十二烷基聚 乙二醇醚、NaCl和CaCl2，其中，十二烷基聚乙二醇醚的浓度为0. 02 %，NaCl的浓度为 200mmol/L、CaCl2 的浓度为 5mmol/L ； 所述考马斯亮蓝染色液的组成为：1L考马斯亮蓝染色液中含有l.Og考马斯亮蓝 R-250、450mL甲醇和100mL冰醋酸； 所述脱色液的组成为：1L脱色液中含有100mL无水甲醇和100mL冰乙酸。
3. 根据权利要求1所述的用于筛选微生物胞外胶原酶的酶谱方法，其特征在于，所述 电泳过程中所采用的凝胶由浓缩胶和分离胶组成，所述分离胶的组成为：pH值为8. 8、浓度 为1. 5mol/L的Tris-HCl缓冲液24. 7%，质量体积比浓度为30%的丙烯酰胺与甲叉双丙 烯酰胺凝胶贮液的混合物33. 3 %，质量体积比浓度为10 %的SDS水溶液1 %，质量体积比 浓度为10 %的过硫酸铵的水溶液1 %，Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基乙二胺0. 1 %，质量体积比浓度为 1 %的I型胶原蛋白水溶液10%，余量为超纯水；所述浓缩胶的组成为：ρΗ值为6. 8、浓度为 0. 5mol/L的Tris-HCl缓冲液25%，质量体积比浓度为30 %的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰 胺凝胶贮液的混合物16 %，质量体积比浓度为10 %的SDS水溶液1 %，质量体积比浓度为 10%的过硫酸铵的水溶液0. 5%，Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基乙二胺0. 1 %，余量为超纯水。
【文档编号】G01N27/447GK104049026SQ201410279995
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月23日 优先权日:2014年6月23日
【发明者】阮海华, 张西轩, 王素英, 李晔 申请人:天津商业大学