基于tmrm的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测方法

基于tmrm的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于TMRM的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测方法，本发明首先对传统的基于TMRM的细胞静息膜电位检测方法进行了改进，以C17.2神经干细胞为模型，用双结合位点的方法较为准确的标定了细胞核区的TMRM非特异性吸附，提高了计算细胞静息膜电位时的精度，并在该方法基础上，通过钠离子荧光染料CoroNa?Green对胞内钠离子浓度进行检测，进一步计算了钠钾离子通透性比值，从而建立了一种具有较高精度的非侵入性的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测方法，该方法法能够对平面细胞和三维生长的细胞进行较为准确的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种细胞膜电位和钠钾离子通透性比值的检测方 法。 基于TMRM的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测 方法

【背景技术】
[0002] 静息状态下，细胞膜内外两侧离子的不均匀分布以及不同离子在细胞膜上的 通透性差异形成了细胞静息膜电位（resting membrane potential, RMP)，它是一切生 物电产生和变化的基础，对许多功能性的膜蛋白如离子通道（ion channels)、转运体 (transporters)、钠钾泵（pumps)、酶类（enzymes)等具有调节作用。RMP的改变对细胞膜 功能蛋白的调节是电刺激信号转成细胞内信号转导的关键，并进而影响细胞的增殖，分化， 凋亡等。因此准确检测RMP具有重要意义。由于细胞膜对氯离子的通透性相对较小，所以 由Goldman - Hodgkin - Katz方程可知钠钾离子的浓度分布和它们在细胞膜上的通透性比 值基本决定了细胞静息膜电位的大小。
[0003] 目前检测细胞静息膜电位主要通过膜片钳和电势荧光染料两种方法。膜片钳 方法由于检测时对细胞有一定程度的损伤，且改变了细胞内的实际离子浓度比例，被钳 制细胞容易死亡，更适用于对细胞通道蛋白的电生理行为进行检测。电势荧光染料方 法是通过按电势分布的带电染料的荧光强度来指示细胞静息膜电位，具有非侵入性， 更容易获取细胞真实的细胞静息膜电位，同时也能用于一些膜片钳方法无法操作的原 位检测，检测通量也更高，但该方法存在检测精度不够高的问题。四甲基罗丹明甲酯 (tetramethylrhodamine, methyl ester, TMRM)是一种带一价正电荷的红色电势突光染料， 可自由通过细胞膜，在膜两侧形成稳定的能斯特平衡分布，对细胞的毒性相对较小，被认为 是一种理想的检测细胞静息膜电位和线粒体膜电位的荧光染料。然而目前利用TMRM进行 细胞静息膜电位检测时，对其荧光粒子在核区的非特异性吸附的标定是建立在吸附系数 不变的前提下，这与文献报道的非特异性吸附存在饱和过程的结论存在差异，从而影响用 TMRM标定细胞静息膜电位时的精度。因此，需要对TMRM的核区非特异性吸附进行标定，进 而建立一种具有较高精度的细胞静息膜电位检测方法。
[0004] 钠钾离子通透性比值PNa/dt为影响细胞静息膜电位的重要因素，常被作为研究细 胞电生理的一个重要指标，尤其是在离子通道功能的研究中。细胞膜上的大部分离子通道 蛋白都是特异性的对某一离子具有较高的通透性，但其对其它离子也会有一定的通透性， 由于钠、钾离子是细胞内外的主要阳离子，因此钠钾离子通透性比值对离子通道蛋白的功 能有决定性意义。大部分钠钾离子通透性比值的研究都聚焦在动作电位中快速响应的通道 蛋白。近年来，静息状态下的一些基础激活的通道（漏通道）的钠钾离子通透性比值也被 进行了研究，例如K2P通道，Kir通道和非选择性阳离子通道（比如Nalcn，被认为是一种 钠离子漏通道）。K2P通道被认为具有小于0. 03的PNa/K,Kir通道的PNa/K被认为小于0. 04。 这些长期开放的通道对钠钾离子的通透性以及钠钾泵对钠钾离子的转运一起决定了静息 状态的膜电位值。然而大部分PNa/K的计算都是基于膜片钳方法，鉴于前述膜片钳方法存在 的局限性，所以需要建立一种具有良好精度的非侵入性的钠钾离子通透性比值检测方法。


【发明内容】

[0005] 有鉴于此，本发明的目的之一在于对TMRM的核区非特异性吸附进行标定，进而建 立一种具有较高精度的细胞静息膜电位检测方法，目的之二在于在所建立的具有较高精度 的细胞静息膜电位检测方法的基础上，进一步计算钠钾离子通透性比值，进而建立一种具 有较高精度的非侵入性的钠钾离子通透性比值检测方法。
[0006] 经研究，本发明提供如下技术方案：
[0007] 1.基于TMRM的细胞静息膜电位检测方法，包括以下步骤：
[0008] B. TMRM荧光强度与浓度的关系标定
[0009] 将TMRM配制成一系列梯度浓度的溶液，对上述溶液分别进行荧光强度检测，将测 得的TMRM荧光强度与对应的TMRM浓度用式（1)进行拟合：
[0010] F = k[TMRM+] (1)
[0011] 其中F为TMRM荧光强度，[TMRM+]为TMRM浓度；求得标定系数k ;
[0012] B.细胞核区TMRM的非特异性吸附标定
[0013] 先用钾、钠离子通透剂处理细胞使细胞完全去极化，则细胞内外游离TMRM浓度相 等，再用一系列梯度浓度的TMRM溶液分别孵育细胞，测定细胞核区TMRM荧光强度，通过式 (1)计算出细胞核区TMRM总浓度，再通过式（2)计算出细胞核区非特异性结合的TMRM浓 度：
[0014]

【权利要求】
1. 基于TMRM的细胞静息膜电位检测方法，其特征在于，包括以下步骤： A. TMRM荧光强度与浓度的关系标定 将TMRM配制成一系列梯度浓度的溶液，对上述溶液分别进行荧光强度检测，将测得的 TMRM荧光强度与对应的TMRM浓度用式（1)进行拟合： F = k[TMRM+] (1) 其中F为TMRM荧光强度，[TMRM+]为TMRM浓度；求得标定系数k ; B. 细胞核区TMRM的非特异性吸附标定 先用钾、钠离子通透剂处理细胞使细胞完全去极化，则细胞内外游离TMRM浓度相等， 再用一系列梯度浓度的TMRM溶液分别孵育细胞，测定细胞核区TMRM荧光强度，通过式（1) 计算出细胞核区TMRM总浓度，再通过式（2)计算出细胞核区非特异性结合的TMRM浓度：
其中[TMR1C]为细胞核区TMRM总浓度，[TMRMB+]为细胞核区非特异性结合的TMRM浓 度；[ΓΜΚΜ/]为细胞核区游离TMRM浓度，其值与胞外游离TMRM浓度相等； 然后，将计算出的细胞核区非特异性结合的TMRM浓度与细胞核区游离TMRM浓度用一 配基两个独立结合位点的模型即式（3)进行拟合：
其中[TMRM+Bmaxl]和[TMRM+Bmax2]分别为两个独立结合位点中最大非特异性结合的TMRM 浓度，KD1和&2分别为TMRM与两个独立结合位点的解离常数；求得[TMRM+ Bmaxl]、[TMRM+Bmax2]、 KD1 和 KD2 ; C. 基于TMRM的细胞静息膜电位检测 用一定浓度的TMRM溶液孵育细胞，测定细胞核区的TMRM荧光强度，通过式（1)计算出 细胞核区TMRM总浓度，将式（3)代入式（2)求解得到，再通过式（4)计算出细胞 静息膜电位：
其中Vm为细胞静息膜电位，[TMR1C]为细胞外TMRM浓度。
2. 如权利要求1所述的基于TMRM的细胞静息膜电位检测方法，其特征在于，步骤A中 是以含有 5mM KCl、130mM NaCl、lmM MgCl2、2mM CaCldPlOmM 葡萄糖的 20mM HEPES 缓冲 液为溶剂，将 TMRM 配制成浓度分别为 5、50、100、250、500、1500、2500、3500、5000、10000、 50000nM的溶液。
3. 如权利要求1所述的基于TMRM的细胞静息膜电位检测方法，其特征在于，步骤B中 所述钾、钠离子通透剂分别为缬氨霉素和莫能菌素，先用含有1 μ Μ缬氨霉素、10 μ Μ莫能菌 素、135mM KCl、lmM MgCl2、2mM CaCljP 10mM葡萄糖的20mM HEPES缓冲液处理细胞使细胞 完全去极化，再以含有135mM KCl、lmM MgCl2、2mM CaCljPlOmM葡萄糖的20mMHEPES缓冲 液为溶剂配制的浓度分别为500、1500、5000、10000、20000nM的TMRM溶液孵育细胞。
4. 如权利要求1所述的基于TMRM的细胞静息膜电位检测方法，其特征在于，步骤C中 所述用一定浓度的TMRM溶液孵育细胞是以含有5mM KCl、130mM NaCl、lmM MgCl2、2mM CaCl2 和lOmM葡萄糖的20mM HEPES缓冲液为溶剂配制的浓度为500nM的TMRM溶液孵育细胞。
5.基于TMRM的钠钾离子通透性比值检测方法，其特征在于，包括以下步骤： A. TMRM荧光强度与浓度的关系标定 将TMRM配制成一系列梯度浓度的溶液，对上述溶液分别进行荧光强度检测，将测得的 TMRM荧光强度与TMRM浓度用式（1)进行拟合： F = k[TMRM+] (1) 其中F为TMRM荧光强度，[TMRM+]为TMRM浓度；求得标定系数k ; B. 细胞核区TMRM的非特异性吸附标定 先用钾、钠离子通透剂处理细胞使细胞完全去极化，则细胞内外游离TMRM浓度相等， 再用一系列梯度浓度的TMRM溶液分别孵育细胞，测定细胞核区TMRM荧光强度，通过式（1) 计算出细胞核区TMRM总浓度，再通过式（2)计算出细胞核区非特异性结合的TMRM浓度：
其中[TMR1C]为细胞核区TMRM总浓度，[TMRMB+]为细胞核区非特异性结合的TMRM浓 度；[ΓΜΜ#/]为细胞核区游离TMRM浓度，其值与胞外游离TMRM浓度相等； 然后，将计算出的细胞核区非特异性结合的TMRM浓度与细胞核区游离TMRM浓度用一 配基两个独立结合位点的模型即式（3)进行拟合：
其中[TMRM+Bmaxl]和[TMRM+Bmax2]分别为两个独立结合位点中最大非特异性结合的TMRM 浓度，KD1和&2分别为TMRM与两个独立结合位点的解离常数；求得[TMRM+ Bmaxl]、[TMRM+Bmax2]、 KD1 和 KD2 ; C. 基于TMRM的细胞静息膜电位检测 用一定的浓度TMRM溶液孵育细胞，测定细胞核区的TMRM荧光强度，通过式（1)计算出 细胞核区TMRM总浓度，将式（3)代入式（2)求解得到[ΓΜΛΜ/],再通过式（4)计算出细胞 静息膜电位：
其中Vm为细胞静息膜电位，[TMR1C]为细胞外TMRM浓度； D. 梯度去极化时胞内钠离子浓度检测 先用钾、钠离子通透剂处理细胞使细胞内外的钠离子平衡，同时对细胞加载钠离子荧 光染料CoroNa Green，再用一系列梯度浓度的钠离子溶液分别孵育细胞，测定细胞荧光强 度，将荧光强度与胞内钠离子浓度用式（5)进行拟合：
其中[NaJ为对应荧光强度下的胞内钠离子浓度，F为对应钠离子浓度下的荧光强度 值；Fmin为不含钠离子的荧光强度值，通过用不含钠离子的溶液孵育细胞获取；Fmax为含饱 和钠离子的荧光强度值，通过用lOOOmM钠离子溶液孵育细胞使细胞中CoroNa Green完全 饱和的情况下获取；求得钠离子与CoroNa Green的解离常数Kd ; 然后，按上述方法检测未使用钾、钠离子通透剂处理的细胞在添加 CoroNa Green的梯 度浓度钾离子溶液中的荧光强度，将测得的荧光强度代入式（5)计算出胞内钠离子浓度， 再将胞外钾离子浓度与胞内钠离子浓度用式（6)进行拟合：
(6) 其中DC]为胞外钾离子浓度；求得φ ; E.钠钾离子通透性比值检测 细胞静息膜电位可用简化的Goldman方程计算：
其中DC]为胞内钾离子浓度，[NaJ为胞外钠离子浓度；对应不同DC]的[Ν<]可 由式（6)获得；在细胞内外钠钾离子浓度总和相等的情况下，Vm可由DC]来表示：
其中，PNa/K为钠钾离子通透性比值； 用含有一定浓度TMRM的梯度浓度钾离子溶液孵育细胞，测定细胞核区的TMRM荧光强 度，通过式（4)计算出对应的细胞静息膜电位，然后将细胞静息膜电位与胞外钾离子浓度 用式⑶进行拟合，即可求出PNa/K。
6. 如权利要求5所述的基于TMRM的钠钾离子通透性比值检测方法，其特征在于，步骤 A 中是以含有 5mM KCl、130mM NaCl、lmM MgCl2、2mM CaCljPlOmM 葡萄糖的 20mMHEPES 缓 冲液为溶剂，将 TMRM 配制成浓度分别为 5、50、100、250、500、1500、2500、3500、5000、10000、 50000nM的溶液。
7. 如权利要求5所述的基于TMRM的钠钾离子通透性比值检测方法，其特征在于，步骤 B中所述钾、钠离子通透剂分别为缬氨霉素和莫能菌素，先用含有1 μ Μ缬氨霉素、10 μ Μ莫 能菌素、135mM KCl、lmM MgCl2、2mM CaCldPlOmM葡萄糖的20mM HEPES缓冲液处理细胞使 细胞完全去极化，再以含有135mM KCl、lmM MgCl2、2mM CaCldP 10mM葡萄糖的20mM HEPES 缓冲液为溶剂配制的浓度分别为500、1500、5000、10000、20000nM的TMRM溶液孵育细胞。
8. 如权利要求5所述的基于TMRM的钠钾离子通透性比值检测方法，其特征在于，步骤 C中所述用一定浓度的TMRM溶液孵育细胞是以含有5mM KCl、130mM NaCl、lmM MgCl2、2mM CaCl2和lOmM葡萄糖的20mM HEPES缓冲液为溶剂配制的浓度为500nM的TMRM溶液孵育细 胞。
9. 如权利要求5所述的基于TMRM的钠钾离子通透性比值检测方法，其特征在于，步骤 D中所述钾、钠离子通透剂分别为缬氨霉素和莫能菌素，先用含有1 μ Μ缬氨霉素、10 μ Μ莫 能菌素、5以]?(：〇1'〇恥6代611、511111((：1、13〇1111恥(：1、111111%(：12、21111〇3(：1 2和1〇1111葡萄糖的 20mM HEPES缓冲液处理细胞使细胞内外的钠离子平衡，再以浓度分别为10mM、25mM、55mM、 80mM、100mM、120mM、130mM的钠离子溶液孵育细胞，所述钠离子溶液中还含有不同浓度的 KCl、lmM MgCl2、2mM CaCl2、10mM葡萄糖和20mM HEPES，其中钾钠离子浓度总和为135mM。
10.如权利要求5所述的基于TMRM的钠钾离子通透性比值检测方法，其特征在于，步 骤D中所述添加 CoroNa Green的梯度浓度钾离子溶液是含有5 μ M CoroNa Green且钾离 子浓度分别为5、7. 5、15、35、55、80、130mM的溶液，所述溶液中还含有不同浓度的NaCl、lmM MgCl2、2mM CaCl2、10mM葡萄糖和20mM HEPES，其中钾钠离子浓度总和为135mM。
【文档编号】G01N21/64GK104101589SQ201410366655
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】吴泽志, 张利光, 林雨, 钟冬火 申请人:重庆大学