专利名称：一种应用静息细胞制备光学纯D-型β-羟基酸的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种制备光学纯D-型p-羟基酸的方法，更 具体地说，涉及一种应用静息细胞制备光学纯D-型P-羟基酸的方法。
背景技术：
不对称合成是在化学催化剂或酶的作用下合成得到过量的单一对映体化合物，故又分 为化学不对称合成和生物不对称合成。
光学活性p-羟基酸，是具有不对称碳原子的双功能性物质，作为有机合成的基础材料， 广泛用于合成多种生理活性物质。P-羟基酸作为一类已经得到广泛应用的化合物，其合成 方法一直是人们研究的热点，而单一构型的D型P-羟基酸可以作为有机合成的手性砌块 参与其它重要手性分子的合成，也可以形成稳定不易降解的聚合物而用作新型材料。目前， D型P-羟基酸的制备一般采用化学拆分的方法进行制备的，这种常规的方法存在副产物如 L型p-羟基酸多，后续分离困难的缺陷，不能满足有关领域的需要。因此，开发一种简单、 方便的制备D型卩-羟基酸的方法，日益显得重要起来。
由于氧化葡萄糖酸杆菌(G/wco朋^"w oxjY/am)对于多种底物的快速不完全氧化使 其得以应用于许多生物手性拆分过程之中，相比较一般的氧化过程，氧化葡萄糖酸杆菌的 催化过程具有更高的区域选择性和立体选择性。这一特征已被用于糖类衍生物的合成，合 成过程不再需要复杂的基团保护，产物广泛用于医药、食品和化妆行业。
人们利用氧化葡萄糖酸杆菌的区域选择性和立体选择性氧化手性或潜手性的醇或醛， 获得手性的酸，但尚未见到关于氧化葡萄糖酸杆菌用于催化D型|3-羟基酸的报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种采用静息细胞转化2-甲基-l， 3-丙二醇的方法，使得2-甲基-1, 3-丙二醇的生物转化更为高效简便。
本发明还有一个目的在于，提供氧化葡萄糖酸杆菌(G/wco"o6fl"w ox少&ra)用于制 备光学纯D-型(3-羟基酸的应用。
本发明提供的应用静息细胞制备光学纯D-型P-羟基酸的方法，包括以下步骤A) 制备氧化葡萄糖酸杆菌株(G/"co"o6flc軟ox;^(my)的静息细胞；
B) 应用静息细胞转化2-甲基-l,3-丙二醇，制备光学纯D-型(3-羟基酸。 使用本发明提供的方法，可以单独对细胞进行培养，然后得到大量的转化活力高的微
生物细胞，来制备用于生物转化的静息细胞，并且可以解除底物和产物对细胞生长的抑制； 同时，由于采用的是静息细胞转化，所以转化液里的成分比较简单，有利于产品的分离纯 化；另外，由于氧化葡萄糖酸杆菌的特性，菌体的培养密度比较低，难于实现高细胞密度 下的转化，而利用静息细胞转化由于细胞可以在转化前培养收集，所以可以人为地控制和 调节细胞浓度，实现高细胞浓度下的生物转化从而在工业规模可以达到在较小的转化体积 下，获得较高的转化能力，能够大大地节约能源和其他生产成本。
图l是底物2-甲基-l,3-丙二醇的初始浓度为5g/L的气相色谱图，其中，在6.009min 处是内标l，4-丁二醇，而2-甲基-l，3-丙二醇己经基本反应完，检测不到剩余底物了。
图2是底物初始浓度为5g/L时产物p-羟基异丁酸甲酯的气相色谱图，其中，在 20.374min处是D-型(3-羟基异丁酸甲酯，在20.823min处是S-型P-羟基异丁酸甲酯。
图3是底物2-甲基-l,3-丙二醇的初始浓度为10g/L的气相色谱图，其中，在5.256min 处是2-甲基-l， 3-丙二醇，在6細min处是内标1， 4-丁二醇。
图4是底物初始浓度为10g/L时产物p-羟基异丁酸甲酯的气相色谱图，其中，在 20.144min处是D-型P-羟基异丁酸甲酯，在20.512min处是S-型|3-羟基异丁酸甲酯。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验 室手册》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件进行。
在本发明的下述实施例中，使用的固体培养基按如下方法配置80.0g山梨醇，20.0g 酵母提取物，5.0g硫酸铵，0.5g五水硫酸镁，20.0g琼脂，溶于1L蒸馏水中，并于121'C 灭菌15分钟。
在本发明的下述实施例中，使用的液体培养基按如下方法配置80.0g山梨醇，20.0g 酵母提取物，5.0g硫酸铵，2g磷酸二氢钾，0.5g五水硫酸镁，溶于1L蒸馏水中，并于115°C 灭菌20分钟。本发明的下述实施例中，气相色谱(GC)检测2-甲基-1, 3-丙二醇的转化率的检测条 件如下色谱柱为Agilent的DB-WAX，进样口温度为250'C，检测器温度为28(TC，流 速为1.0ml/min，分流比为10:1，升温程序为IOO'C保持lmin，然后以20°C/min的速度 升温至18(TC，保持lmin，再以30°C/min的速度升温至220°C ，保持2min。
气相色谱(GC)检测P-轻基异丁酸的对映体过量值检测方法如下取lml反应液加 入2ml甲醇(含3Q/。H2S04)，于8(TC下反应3h，生成甲酯；再用2ml氯仿萃取，然后使 用气相色谱进行检测，具体检测条件如下
色谱柱为Agilent的HP-Chiral 20B，进样口温度为U0°C，检测器温度为180°C，流 速为0.7ml/min，分流比为100:1，升温程序为8(TC保持0.2min，然后以2.5tVmin的速 度升温至85'C，保持0.5min，再以1.5°C/min的速度升温至95°C，保持0.5min，最后以 rC/min升温至105°C，保持10min。
实施例1、静息细胞制备
将氧化葡萄糖酸杆菌(G/wawo6a"wox;^"ra) (CGMCC 3827)涂布于固体培养基上， 倒置于生化培养箱内，3(TC培养24小时。
然后将固体培养基上的单个菌体克隆，接种到液体培养基中，于3(TC， 250rpm，培 养24小时，获得发酵液。
将发酵液于1(TC, 8000rpm离心IO分钟，收获菌体沉淀，用生理盐水洗涤菌体2次， 离心除去上清，按湿菌体重量20g/L的菌体悬浮在0.1M的磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，制 备获得静息细胞。
实施例2、 D型卩-羟基酸转化及检测
向实施例1中获得的静息细胞溶液中，添加底物2-甲基-l， 3-丙二醇，使其终浓度分 别达到5g/L和10g/L，同时加入一定量的碳酸钙，于3(TC， 250rpm，进行立体选择性转 化反应。
反应4h后终止反应，并将反应液于12000rpm离心10分钟，并用0.45pm的滤膜过滤， 收集滤液，分别用气相色谱(GC)检测2-甲基-l,3-丙二醇的转化率和卩-羟基异丁酸的对 映体过量值，检测结果分别如图1、图2 (2-甲基-1, 3-丙二醇的终浓度为5g/L)和图3、 图4所示(2-甲基-l，3-丙二醇的终浓度为10g/L)。
根据图1的检测结果，在4h后底物的转化率几乎达到100%。 根据图2的检测结果，反应液中D-P-羟基异丁酸的对映体过量值为98%以上。根据图3的检测结果，在4h后底物的转化率达到90%以上。
根据图4的检测结果，反应液中D-p-羟基异丁酸的对映体过量值也达到98%左右。
根据上述结果，采用静息细胞转化，可以单独对细胞进行培养，然后得到大量的转化 活力高的微生物细胞，来制备用于生物转化的静息细胞，并且可以解除底物和产物对细胞 生长的抑制；同时，由于采用的是静息细胞转化，所以转化液里的成分比较简单，有利于 产品的分离纯化；另外，由于氧化葡萄糖酸杆菌的特性，菌体的培养密度比较低，难于实 现高细胞密度下的转化，而利用静息细胞转化由于细胞可以在转化前培养收集，所以可以 人为地控制和调节细胞浓度，实现高细胞浓度下的生物转化从而在工业规模可以达到在较 小的转化体积下，获得较高的转化能力，能够大大地节约能源和其他生产成本。
权利要求
1. 一种应用静息细胞制备光学纯D-型β-羟基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤A)制备氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的静息细胞；B)应用静息细胞转化底物2-甲基-1，3-丙二醇，制备光学纯D-型β-羟基酸。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述步骤A包括以下步骤 Al)培养获得氧化葡萄糖酸杆菌(G/j/co"o6ac欣ox;^ara)的细胞发酵液；A2)将发酵液离心，收获菌体沉淀，用生理盐水洗涤菌体，离心除去上清，用悬浮液 悬浮菌体沉淀，制备获得静息细胞。
3、 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述悬浮液为磷酸盐缓冲液
4、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述歩骤B包括以下步骤 向静息细胞溶液中，添加底物2-甲基-l，3-丙二醇，同时加入碳酸钙，进行立体选择性转化反应，制备光学纯D-型卩-羟基酸。
5、 氧化葡萄糖酸杆菌(G/i/co"o6a"er ox;;t/fl附)用于制备光学纯D-型p-羟基酸的应用。
6、 如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制备光学纯D-型卩-羟基酸，通过制 备静息细胞，转化底物2-甲基-l,3-丙二醇进行。
全文摘要
本发明提供了一种应用静息细胞制备光学纯D-型β-羟基酸的方法和氧化葡萄糖酸杆菌用于制备光学纯D-型β-羟基酸的应用。本发明提供的制备光学纯D-型β-羟基酸的方法包括制备氧化葡萄糖酸杆菌的静息细胞的步骤和应用静息细胞转化底物2-甲基-1，3-丙二醇，制备光学纯D-型β-羟基酸的步骤。使用本发明提供的方法，利用活力高的静息细胞，解除底物和产物对细胞生长的抑制；同时，获得的转化液的成分比较简单，有利于产品的分离纯化；且克服了氧化葡萄糖酸杆菌菌体的培养密度比较低，难于实现高细胞密度下的转化的缺陷，实现高细胞浓度下的生物转化，能够大大地节约能源和其他生产成本。
文档编号C12R1/01GK101280325SQ200810037960
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月23日 优先权日2008年5月23日
发明者英 周, 杨雪鹏, 林金萍, 波 殷, 韦柳静, 魏东芝, 魏国栋 申请人:华东理工大学