专利名称：钠泵膜外区多肽及其在制备调节钠泵活性药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，涉及多肽片段的应用，尤其涉及一种能够影响钠泵活性的钠泵膜外区多肽及其该钠泵膜外区多肽在制备调节钠泵活性药物中的应用。
背景技术：
钠泵(Na+，K+-ATPase)是一种细胞跨膜蛋白，在维持细胞内外Na+，K+离子转运，保持细胞内外钠、钾离子的电化学梯度，而这一离子梯度是机体基本功能活动所必需的，比如营养物质由细胞外向细胞内的转运，细胞内外渗透压的平衡及细胞容量的调节，以及可兴奋细胞膜静息电位的维持等。总之，钠泵在维持体内电解质平衡、稳定细胞膜电位、保持细胞容量、信号转导等方面均具有重要作用。
一、钠泵的结构钠泵由α、β、γ三个亚单位组成。钠泵的最小功能单位为二聚体，即αβ，常以四聚体形式存在，即2α2β。近年来的研究表明，α亚单位是其催化亚单位，其构型决定钠泵活性，是钠泵的功能单位。α亚单位对促进已合成的β亚单位离开内质网并对其糖基化起着重要作用。β亚单位是一种糖基蛋白，与α亚单位紧密连接，对维持钠泵活性起着重要作用。它在内质网中装配，能促进α亚单位在膜中的固定，形成稳定而有活性的αβ二聚体，它能影响成熟的α亚单位的转运。近年来新发现的γ亚单位，其功能目前尚不明确。
钠泵α亚单位具有与许多钠泵调节因子(强心甙类物质等多种配基)结合的位点，可与Na+、K+、Ca2+、ATP等结合，与磷酸化及能量传递系统相联系，是钠泵功能的主要调节者，在钠泵活性的调节中具有重要作用。最早，人们只知道洋地黄是Na+，K+-ATPase的唯一拮抗剂，近来，发现哺乳动物体内存在着内源性钠泵抑制物(SPIs、EDLS、EO等)，而且发现它们可能参与钠泵活性的调节和电解质平衡的维持。有证据表明，内源性哇巴因(EO)与Na+，K+-ATPase催化亚单位的强心甙结合部位可逆地结合在一起(Butt AN，Tennant BP，Gillingwater SD，et al.Binding of ouabain and humanouabainlike substance to different Na+，K+-ATPase isoforms.HypertensRes，2000；23S45-S50)。
按照钠泵催化亚单位与Na+、K+、Ca2+及强心甙类物质等多种配基亲和力的不同区分为α1、α2、α3和α4亚型(α4亚型知之甚少)。实际上，所有的细胞均表达α1亚单位，且α1-亚单位与哇巴因的亲和力明显低于α2和α3亚单位，α2和α3在所有脊椎动物中与哇巴因的亲和力较高(IC50＝10-100nM)。同时钠泵亚单位在组织中的分布及其与钠泵抑制因子(如哇巴因)的结合能力也存在一定的种属差异。如，啮齿类动物的α1亚单位与哇巴因的亲和力(ki＝1-5×10-5mol/L)较α2、α3亚单位(ki＝1-5×10-7mol/L)高。且不同亚型的催化亚单位具有不同的动力学特性。用Na+，K+-ATPase抑制活性法分别测得犬的α1亚单位和灵长类的α3亚单位与哇巴因的结合力相似(IC50＝10nM)。1992年Ferrandi用相似的方法分别测得犬肾脏α1亚单位的IC50为14nM，大鼠脑α3亚单位的IC50为21nM，另外，大鼠肾脏α1亚单位的IC50为105nM，提示大鼠较犬肾脏α1亚单位对哇巴因的敏感性低。近年来的研究表明，兔肾脏α1亚单位对哇巴因完全无反应，甚至于当哇巴因的浓度达到500nM时，亦未见明显反应。1998年，Anner等人测得兔肾脏α1亚单位的IC50为600nM。当哇巴因的浓度达到500nM时，仅可观察到5％的抑制反应。与1992年Ferrandi测得的大鼠脑α3亚单位的IC50与2000年Butt测得灵长类大脑皮质α3亚单位的IC50相比，后者明显增高。
尽管如此，钠泵α催化亚单位的不同亚型基本结构仍高度保守，Na+，K+-ATPaseα亚单位由1016个氨基酸组成，有10个穿膜区(钠泵结构示意参见图7所示)。其氨基末端、H2-H3、H4-H5、H6-H7、H8-H9间序列及羧基端均位于细胞膜的胞浆面，称为膜内区，其序列高度保守，包含ATP结合位点和磷酸化作用位点，可与Na+、K+、ATP结合，与磷酸化及能量传递系统相联系，在钠泵活性的发挥中具有重要作用。H1-H2、H3-H4、H5-H6、H7-H8、H9-H10间的序列位于细胞膜外，称为膜外区，为钠泵配体的结合位点，如强心甙结合位点，比如地高辛和哇巴因结合位点均位于细胞膜膜外区。钠泵活化/抑制因子通过对这些膜外区的作用影响钠泵活性。目前研究发现钠泵H1-H2、H3-H4膜外区是钠泵调节因子等配体的主要结合位点，而H5-H6、H7-H8、H9-H10膜外区与钠泵其他亚基之间相互作用有关。
1985年Shull等人认为哇巴因结合位点可能是位于H3-H4之间的膜外区序列。但是也有研究认为羧基端、H3-H4及H7-H8膜外区亦可能存在哇巴因的结合位点，同时证明这些区域并不仅仅是与洋地黄物质相结合(Shull GE，Schwartz A，Lingrel JB.Amino-acid sequence of the catalytic subunit of the(Na+-K+)ATPase deduced from a complementary DNA.Nature 1985；316(22)691-695)。
1986年Shull等发现，哇巴因不仅与H3-H4间的氨基酸相结合，而且H1-H2间的氨基酸亦参与了此结合，也可能与内酯环相结合(Shull GE，GreebJ，Lingrel JB.Molecular cloning of three distingct forms of the Na+，K+-ATPase α-subunit from rat brain.Biochemistry 1986；25(16)8125-8132)。1988年Price和Lingral发现，大鼠钠泵膜外区H1-H2的界点Arg-113和Asp-124是产生哇巴因抵抗的主要原因。因此1990年Price等人用6种不同的氨基酸替换位于M1-M2膜外区边界的氨基酸，研究钠泵结构与功能的关系(Price EM，Rice DA，Linger JB.Structure-function studies ofNa+，K+-ATPase.Site-directed mutagenesis of the border residues from theH1-H2extracellular domain of theαsubunit.J Bio Chem 1990；265(12)6638-6641)。不论替换111位或122位，或者是两者同时被替换，其对哇巴因的亲和力均发生了变化。将111位及122位氨基酸分别替换为Lys-111-Lys-122、Glu-111-Glu-122、Lys-111-Glu-122及Asp-111-Arg-122，不论被转染任何一种突变的羊Na+，K+-ATPaseα亚单位的Hela细胞均可以在对未转染的野生型Hela细胞产生毒性的哇巴因中生长，产生了哇巴因抵抗。经定点突变的钠泵，其哇巴因IC50进一步提高(4×10-3M-1×10-6M)。其中产生哇巴因抵抗最强的是钠泵膜外区的双突变(Asp-111-Arg-122)；最弱的是单侧突变。因此认为哇巴因不仅与钠泵H3-H4间的氨基酸，而且还与M1-M2间的氨基酸相结合，且近来认为后者更为重要。
可见钠泵H1-H2、H3-H4膜外区是钠泵调节因子作用的主要靶点。目前研究证实，钠泵α催化亚基H1-H2、H3-H4膜外区，在钠泵活性调节中发挥重要作用，血液中许多钠泵配体(钠泵调节因子)，正是通过与上述2个膜外区的结合在钠泵活性的调节中起到重大作用。
钠泵调节因子引起的钠泵功能异常所致的病理生理变化，在多种疾病的发生中发挥重要的作用(Hamlyn J，Blaustin M，Bova S，et al.Identificationand characterization of oubain-like compound from human plasma.Proc NatlAcad Sci 1991；88625；Ferrandi M，Minotti E，Salardi S，et al.Characteristicof a ouabain-like factor from the Milan hypertensive rats.J CardiovascPharmacol 1993；22(suppl 2)S75-78)在包括高血压在内的多种疾病患者体内钠泵抑制因子水平异常，且与病患的研究程度密切相关，且正是由于这一调节因子的异常对钠泵活性抑制在相关疾病的发生和发展中发挥重要作用。例如1)心力衰竭Gottlieb等的研究发现心力衰竭患者血浆EO水平增加，且增加幅度与心脏指数及平均动脉压呈负相关，其原因可能是因为继发于左室功能不全的血压降低及心衰时肾上腺等组织的血流灌注减少，刺激EO的分泌增加，从而对维持心衰患者的血压及血容量的平衡起着重要作用。其它临床及动物实验结果也证实心衰时EO水平的改变。对心衰患者进行血浆EO监测具有重要意义，因为血浆EO水平的增加可能使机体对洋地黄类药物的敏感性降低，增加了洋地黄中毒的可能性。
2)冠心病研究发现，急性心肌梗塞患者发病第一天血浆EO含量升高，且并发室性心律失常者较无心律失常者高，但并发心力衰竭者较低，第二天EO即降至正常，且以后两周内无明显变化。
3)心律失常Bagrov等发现由心肌缺血诱发的室性心律失常大鼠血浆中EO含量增高，但给予地高辛抗体后EO下降(可能是因为地高辛抗体与哇巴因存在交叉结合反应所致)，同时心律失常的发生率降低，且持续时间缩短，提示EO的改变可能参与了心律失常的发生。
4)其它妊娠时血容量扩张，刺激了EO的分泌，且并发高血压者EO含量更高，不论血压是否正常，分娩后EO可迅速下降。同时，母体含量较高的EO通过血液及乳汁等传给了新生儿。研究表明，新生儿血浆EO含量明显增高，但通常在出生后几天内恢复正常。
高血压病的发生涉及一系列与血压调节有关的内分泌和生化代谢异常以及细胞膜离子转运障碍，其中钠泵活性改变、细胞膜离子转运障碍及肾排钠缺陷处于中心环节。特别是钠泵主动转运障与信号转导异常在高血压的发生和发展中发挥重要作用，已被公认为是高血压病(尤其是盐敏感性高血压)的发病机制之一。
目前，对于内源性钠泵抑制因子——哇巴因的作用机制研究的较为清楚，这也可能在一定程度上代表了其它钠泵抑制因子的作用模式(Ming-juanZhang，Jun Yang，Zhuo-ren Lu.A New Ouabain Conjugated Peptide Was FoundFrom Phage Displayed Peptide Library.Am J Hypert.2004，17619-623；HamlynJM，Hamilton BP，Manunta P.Endogenous ouabain，sodium balance and bloodpressurea review and a hypothesis.J Hypertens 1996；14(1)151-167；Goto A，Yamnada K.Putative roles of ouabainlike compound in hypertensionRevisited.Hypertens Res 2000；23S7-S13)。
高水平的哇巴因可过度抑制细胞膜钠泵活性，影响阻力血管功能，调节交感神经活性和肾脏功能，导致机体血压升高。其可能机制如下钠泵被过度抑制带来细胞内Na+升高，通过Na/Ca交换器后，使得细胞内Ca2+离子浓度升高，这就带来了肌浆网/内质网摄取Ca2+离子增强，导致肌浆网/内质网贮存Ca2+增加，增强整个细胞Ca2+离子的信号传导，以至引起生物学效应；同时，钠泵抑制因子对细胞膜钠泵的抑制作用还可通过信号转导通路途径引起高血压的发生①、抑制血管Na-K-ATPase，使兴奋-收缩偶联过程加强，引起血管平滑肌收缩，导致血管张力增加；②、哇巴因通过抑制颅内钠泵，增加神经递质的释放，增加外周交感神经系统活性，导致血压上升；③、激活脑内肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)，进而使交感神经兴奋；④、抑制血管钠泵还引起血管对肾上腺素的反应性增高；⑤、近来还发现，哇巴因不止是Na+，K+-ATPase的抑制因子，还通过对分布于肾小管上的II型和III型H+，K+-ATPase抑制，参与高血压的发生。
可见，众多因素均可通过对钠泵活性的抑制导致细胞内Na+暂时或持续升高、细胞内pH值及离子平衡的改变，进而引起①、外周阻力更加；②、血压感受器重调；③、交感活性增加；④、表遗传学的改变或交互作用加剧；⑤、增加血管壁/腔比例。上述因素的单一或联合作用最终导致血压的持续性增高。故此认为，内源性钠泵抑制因子对钠泵活性的抑制，导致细胞膜离子转运障碍，可能是高血压发生的中心环节。
基于上述分析，通过阻断钠泵抑制因子对于钠泵的抑制，使钠泵重新恢复排钠功能，必将会为心血管疾病的药物防治开辟一种全新的方法和思路。已有研究证实这一思路是可行的。1999年Ferrari发现，给Dahl大鼠高盐饮食后脑室内注射一种能与哇巴因结合的新药PST2238，18小时后血压下降到正常水平；给妊娠高血压患者注射PST2238，也能明显降压(QuadriL，Bianchi G，Cerri A，et al.17beta-(3-furyl)-5beta-androstane-3beta，14beta，17beta-triol(PST2238)A very potent antihypertensive agent with a novelmechanism of action.J Med Chem 1997；40(11)1561-1564)。此外，用地高辛抗体可以阻断颅脑损伤患者体内EO对血管Na-K-ATPase的抑制，并降低血压。本研究组采用特异性抗哇巴因抗体及其F(ab)2片段同样也可显著降低实验动物的血压。
上述研究均说明选择性降低循环血液中游离钠泵抑制因子对钠泵的抑制作用，或竞争性结合钠泵，或降低高亲和力哇巴因的钠泵亚单位的数量，均可恢复钠泵活性，达到降低高血压患者特别是盐敏感患者血压的目的。因此，通过阻断钠泵抑制因子对于钠泵的抑制，使钠泵重新恢复排钠功能，达到治疗高血压的策略是完全有效和可行的。
但是，由于机体内存在的多种类型的内源性因子均可抑制钠泵的活性，而采用特异性抗体或抗体片段是通过经典的抗原抗体反应只能阻断单一类型钠泵抑制因子，并不能同时阻断或有效减轻多种不同类型内源性钠泵抑制因子对钠泵的抑制作用。
因此，设计可同时阻断多种类型的钠泵抑制物对钠泵的抑制作用，并尽可能少地影响细胞正常生理功能的更为合理、有效的防治策略对于心血管疾病的防治具有重要意义。
上述分析证实在钠泵α亚单位H1～H2和H3～H4膜外区是钠泵抑制因子的结合位点，在钠泵活性的调节中发挥重要作用。钠泵抑制因子对于钠泵的抑制作用正是通过与钠泵α-亚单位H1～H2和H3～H4间膜外区氨基酸残基的结合实现的，且仅仅包含钠泵α-亚单位H1～H2和H3～H4膜外区的截断性钠泵α-亚单位片段就具备结合钠泵抑制因子的活性。
因此，利用人工制备的包含钠泵α-亚单位H1～H2和H3～H4膜外区的截断性钠泵片段，竞争性结合游离钠泵抑制因子，影响细胞膜钠泵的活性，调节细胞内外离子浓度，从而，可以达到同时阻断多种类型的钠泵抑制因子对钠泵的抑制作用，达到治疗的目的，并最大限度地降低对细胞正常生理功能的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供钠泵α-亚单位膜外区多肽包含的α-亚单位H1～H2和H3～H4膜外区多肽截断性片段。
本发明的另一个目的在于提供上述钠泵α-亚单位膜外区多肽包含的α-亚单位H1～H2和H3～H4膜外区多肽截断性片段在制备治疗钠泵功能异常相关疾病的药物中的应用，尤其是治疗心血管疾病的药物和制备治疗高血压的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案钠泵α-亚单位膜外区的多肽，其特征在于，包含下列6段α-亚单位H1～H2和H3～H4膜外区多肽截断性片段，具体氨基酸序列如下H1～H2膜外区多肽截断性片段Gln Ala Ala Thr Glu Glu Glu Pro Gln Asn Asp AsnGln Ala Ala Met Glu Asp Glu Pro Ser Asn Asp AsnGln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp AsnH3～H4膜外区多肽截断性片段Glu Tyr Thr Trp Leu GluGly Tyr Ser Trp Leu GluGly Tyr Thr Trp Leu Glu。
上述钠泵α-亚单位膜外区的多肽的制备方法，采用体外人工合成法合成α-亚单位H1～H2和(或)H3～H4膜外区多肽截断性片段，经高效液相色谱法纯化合成的钠泵α-亚单位膜外区多肽。具体方法如下首先将一个用Fmoc基团对α-氨基进行保护的氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体树脂上，随后将α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨基酸-支臂-树脂；将第二个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去；或者用α-N端及侧链保护的肽片断代替单个的氨基酸进行耦联反应，缩合反应完成后，用溶液洗涤，重复进行脱保护、耦联，直到得到α-亚单位H1～H2和(或)H3～H4膜外区多肽截断性片段，最后将肽与支臂及树脂裂解即可。
或者采用昆虫杆状病毒表达系统制备包含钠泵α3-亚单位H1～H2和H3～H4膜外区的多肽片段，具体包括下列步骤1)大鼠动脉血管组织mRNA的提取取新鲜的大鼠动脉血管组织称重后，剪碎，直接加入匀浆液中匀浆，采用寡聚-纤维素离心柱快速分离mRNA；2)mRNA的逆转录在无菌的0.5ml离心管中加入5-10μgmRNA，10单位RNasin，10pmol 3’端引物，1mmol/L的各种dNTP，其pH7.0，和50单位左右M-Mulv反转录酶，或5单位左右Taq DNA聚合酶，反应缓冲液加水至20μl，37℃保温1h；3)PCR扩增目的基因片段按照大鼠钠泵α亚单位基因序列(Genbank，登录号M14513.1)设计引物，引物序列primer 15`-c tca cta gtc gtc aag ttc tgc cgg cagctg-3`Primer25`-gac aag ctt tta gca gtt ctt gcg agc cat gcg-3；以逆转录之cDNA为模板，进行PCR反应，扩增钠泵α亚单位基因序列中260～1200之间长度为760bp的核苷酸序列，作为钠泵α-亚单位膜外区的基因序列；或者直接按照大鼠钠泵α亚单位基因序列(Genbank，登录号M14513.1)设计包含α3-亚单位H1～H2和(或)H3～H4膜外区的基因片段的上下游引物，经过复性后，进行PCR扩增或直接经Xbal、HindIII限制性核酸内切酶酶切获得目的基因片段。
4)重组pFB-sp3转移载体的构建目的DNA片段和pFB转移载体均经Xbal、HindIII限制性核酸内切酶酶切后，T4-DNA连接酶作用下，体外连接，然后将重组子转化DH5α宿主菌，碱裂解提取质粒，并经PCR、基因测序及限制性内切酶酶切鉴定，获得重组pFB-sp3转移载体；5)重组Bacmid DNA的制备用重组pFB-sp3转移载体转染DH10Bac感受态细胞，经Luria Agar选择性培养基筛选阳性菌斑，碱解法提取重组BacmidDNA，用PGR鉴定阳性重组体；6)收获重组杆状病毒在35mm培养皿中27℃ Grace`完全培养基培养Sf-9细胞至少1h；配置以下溶液A液5μl重组的Bacmid DNA加入95μl灭菌去离子水；B液6μl Cellfectin加入94μl灭菌去离子水；A液与B液轻轻混匀，室温放置30min；用无血清、无抗生素的TNM-FH洗涤3次Sf-9细胞后，逐滴加入AB混合液，共培养72h收集培养上清，500g离心10min，将上清分成小份作为重组杆状病毒原毒种，命名为重组Ac-sp3，4℃避光保存；7)钠泵α-亚单位膜外区多肽的表达和鉴定27℃培养Sf-9细胞至80％细胞融合时，加入重组杆状病毒毒种400ul/瓶，继续培养72h，收集病毒感染细胞，热变性后，取10ul上清行SDS-PAGE电泳，即12％分离胶，5％积层胶，检测截断性钠泵α亚单位蛋白的表达；8)非变性截断性钠泵α-亚单位膜外区多肽的纯化用ProBondTMColumn树脂吸附经反复冻融裂解的感染重组病毒的Sf-9细胞上清，非变性洗涤液洗涤，50mM、200mM、350mM、500mM非变性-咪唑洗脱液洗脱，800×g离心2min，收集上清，即获得6段α-亚单位H1～H2和H3～H4膜外区多肽截断性片段。
将纯化的钠泵α-亚单位膜外区多肽用于钠泵活性调节药物的制备，直接通过静脉内注射途径注入哺乳类(包括人类)或非哺乳类动物，达到竞争性阻断体内游离钠泵抑制因子对钠泵的抑制作用，恢复细胞膜钠泵活性，最大限度地降低对细胞正常生理功能的影响。从而将其用于钠泵活性异常相关疾病，尤其是心血管疾病的药物制备和制备治疗高血压的药物中的应用。
图1是本发明的6条能与钠泵特异结合的钠泵α-亚单位膜外区多肽的氨基酸序列。
图2是重组pFB-sp3转移载体PCR鉴定。1pFB-sp3转移载体；2阴性对照。
图3是重组Ac-sp3杆状病毒PCR鉴定。1阴性对照；2Ac-sp3杆状病毒。
图4是钠泵α-亚单位膜外区的多肽SDS-PAGE鉴定重组杆状病毒的表达。1Ac-sp3杆状病毒感染的Sf-9细胞裂解液；2阴性对照。
图5是钠泵α-亚单位膜外区多肽对哇巴因抑制红细胞摄取86Rb的阻断作用的体外生物学活性试验结果图。其中，横坐标表示钠泵α-亚单位膜外区多肽的浓度；纵坐标表示红细胞86Rb摄取率。
图6是钠泵α-亚单位膜外区多肽降压作用示意图。横坐标表示钠泵α-亚单位膜外区多肽的浓度；纵坐标表示血压水平。
图7是钠泵由α和β亚单位结构示意图(Blanco，Am.J.Physiol.1998)。
为了更清楚的理解本发明，以下结合附图和发明人给出的对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式
1.钠泵α-亚单位膜外区多肽氨基酸序列的确定通过Genebank获得钠泵α-亚单位的基因序列和蛋白序列，按照α-亚单位的结构和膜外区多肽序列，确定α-亚单位H1～H2和(或)H3～H4膜外区多肽。本发明经过上述方法获得了以下6段钠泵α-亚单位膜外区多肽(图1)，其氨基酸序列为Gln Ala Ala Thr Glu Glu Glu Pro Gln Asn Asp AsnGln Ala Ala Met Glu Asp Glu Pro Ser Asn Asp AsnGln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp AsnGlu Tyr Thr Trp Leu GluGly Tyr Ser Trp Leu GluGly Tyr Thr Trp Leu Glu。
2.制备上述钠泵α-亚单位膜外区多肽可分别采用以下技术方案1)体外人工合成法Fmoc法合成α-亚单位H1～H2和(或)H3～H4膜外区多肽截断性片段，经高效液相色谱法纯化合成的截断性钠泵片段。具体方法如下首先将一个用Fmoc基团对α-氨基进行保护的氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体上，随后将α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨基酸-支臂-树脂。将第二个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去。此外，也可以用α-N端及侧链保护的肽片断代替单个的氨基酸进行耦联反应，缩合反应完成后，用溶液洗涤，重复进行脱保护、耦联，直到得到目的肽，最后将肽-支臂-树脂裂解。这种延长肽链的固相合成法既可采用间断的方法，也可使用连续流动的方法。
2)采用原核表达系统、真核表达系统、昆虫杆状病毒表达系统或其他真核表达系统或非真核表达系统制备钠泵α-亚单位膜外区。具体方法如下采用RT-PCR和分子克隆技术等方法获得包含上述钠泵α-亚单位膜外区基因序列，通过分子克隆技术将其克隆入真核表达载体或非真核表达载体，并经过相应的转染相应的宿主细胞，表达钠泵α-亚单位膜外区多肽，非变性条件纯化(方法详见分子克隆)。
3.钠泵α-亚单位膜外区多肽体外生物学活性检测采用红细胞86Rb摄取率试验鉴定钠泵α-亚单位膜外区多肽体外生物学活性。影响细胞膜钠泵功能，调节细胞内外离子平衡，从而提示其具有治疗心血管疾病的潜在作用。最后，采用动物试验证实其治疗心血管疾病的作用，及其急性毒理学作用。较具体方法见具体实施方式
2。
4.体内试验采用高血压动物模型实验研究钠泵α-亚单位膜外区多肽在动物体内的药效学及毒理学。具体方法见具体实施方式
3、4。
5.钠泵活性调节药物的制备为了证实钠泵α-亚单位膜外区多肽能够影响细胞膜钠泵功能，并且可用于治疗心血管疾病，尤其是高血压，以下所述的实施例用于描述本发明，而不是限制本发明。
实验材料1.钠泵α-亚单位膜外区的多肽片段的获得实施方案1
应用多肽合成仪自动合成钠泵α亚单位膜外区多肽，并且通过HPLC纯化。本实施例合成钠泵α3-亚单位H1～H2膜外区多肽片段，其氨基酸序列如下Gln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp Asn。
Fmoc固相肽合成法首先将一个用Fmoc基团对α-氨基进行保护的氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体上，随后将α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨基酸-支臂-树脂.将第二个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去.此外，也可以用α-N端及侧链保护的肽片断代替单个的氨基酸进行耦联反应，缩合反应完成后，用溶液洗涤，重复进行脱保护、耦联，直到得到目的肽.最后将肽-支臂-树脂裂解.这种延长肽链的固相合成法既可采用间断的方法，也可使用连续流动的方法。即(1)C末端氨基酸与树脂结合；(2)Na-Fmoc的脱除、洗涤；(3)耦联、洗涤；(4)重复步骤(2)～步骤(3)；(5)脱保护基。
同法可以获得本发明所涉及的其他几条α-亚单位H1～H2和(或)H3～H4膜外区多肽截断性片段。
实施方案2采用昆虫杆状病毒表达系统制备包含钠泵α3-亚单位H1～H2和(或)H3～H4膜外区的多肽片段，其氨基酸序列包含如下氨基酸序列Gln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp Asn。
具体制备方法如下(1)大鼠动脉血管组织mRNA的提取取新鲜的大鼠动脉血管组织称重后，剪碎，直接加入匀浆液中匀浆，采用寡聚(dT)-纤维素离心柱快速分离mRNA。
(2)mRNA的逆转录在无菌的0.5ml离心管中加入5-10μgmRNA，10单位RNasin，10pmol 3’端引物，1mmol/L各种dNTP(pH7.0)和50单位左右M-Mulv反转录酶(或5单位左右Taq DNA聚合酶)，反应缓冲液加水至20μl，37℃保温1h。
(3)PCR扩增目的基因片段按照大鼠钠泵α亚单位基因序列(Genbank登录号M14513.1)设计引物，引物序列primer 15`-c tca cta gtcgtc aag ttc tgc cgg cag ctg-3 Primer25-gac aag ctt tta gca gttctt gcg agc cat gcg-3`。以逆转录之cDNA为模板，进行PCR反应，扩增钠泵α亚单位基因序列中260～1200之间长度为760bp的核苷酸序列，作为钠泵α-亚单位膜外区的多肽(图2)。
(4)重组pFB-sp3转移载体的构建目的DNA片段和pFB转移载体均经Xbal、HindIII限制性核酸内切酶酶切后，T4-DNA连接酶作用下，体外连接。然后将重组子转化DH5α宿主菌，碱裂解提取质粒，并经PCR、基因测序及限制性内切酶酶切鉴定，获得重组pFB-sp3转移载体。
(5)重组Bacmid DNA的制备用重组pFB-sp3转移载体转染DH10Bac感受态细胞，经Luria Agar选择性培养基筛选阳性菌斑(具体方法参照GIBCO公司Bac-to-Bac杆状病毒表达系统操作手册)。碱解法提取重组BacmidDNA，用PCR鉴定阳性重组体(图3)。
(6)收获重组杆状病毒在35mm培养皿中27℃ Grace`完全培养基培养Sf-9细胞至少1h；配置以下溶液A液(5μl重组的Bacmid DNA加入95μl灭菌去离子水)与B液(6μl Cellfectin加入94μl灭菌去离子水)轻轻混匀，室温放置30min；用无血清、无抗生素的TNM-FH洗涤3次Sf-9细胞后，逐滴加入AB混合液，共培养72h收集培养上清，500g离心10min，将上清分成小份作为重组杆状病毒原毒种，命名为重组Ac-sp3，4℃避光保存。(具体方法参照GIBCO公司Bac-to-Bac杆状病毒表达系统操作手册)。
(7)钠泵α-亚单位膜外区多肽的表达和鉴定27℃培养Sf-9细胞至80％细胞融合时，加入重组杆状病毒毒种400ul/瓶，继续培养72h，收集病毒感染细胞，热变性后，取10ul上清行SDS-PAGE电泳(12％分离胶，5％积层胶)检测截断性钠泵α亚单位蛋白的表达(图4)。
(8)非变性截断性钠泵α-亚单位膜外区多肽的纯化用ProBondTMColumn树脂(Invitrogen公司)吸附经反复冻融裂解的感染重组病毒的Sf-9细胞上清，非变性洗涤液洗涤，50mM、200mM、350mM、500mM非变性-咪唑洗脱液洗脱，800×g离心2min，收集上清，获得目的片段。
同法可以获得本发明所涉及的含有其他几条α-亚单位H1～H2和(或)H3～H4膜外区多肽截断性片段的表达。
实施方案3采用采用分子生物学技术，原核表达截断性钠泵α-亚单位膜外区多肽片断，包含钠泵α3-亚单位H1～H2和(或)H3～H4膜外区的多肽片段，其氨基酸序列包含如下氨基酸序列Gln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp Asn具体的实施方案如下(1)人肾脏组织mRNA的提取取新鲜的肾脏组织样品称重后，剪碎成约1cm3的组织块，直接加入匀浆液中做mRNA的提取。采用寡聚(dT)-纤维素离心柱快速分离。原理先用异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠，直接裂解匀浆、裂解肾脏组织细胞并抑制RNase活性，细胞裂解液直接上寡聚(dT)-纤维素柱，用不同盐浓度缓冲液洗涤上柱物，最后洗脱下poly(A+)RNA，并且不需要用乙醇沉淀，而用糖原沉淀回收微量RNA。有关操作步骤参照快速mRNA提纯试剂盒产品说明书。
(2)mRNA的逆转录在无菌的0.5ml离心管中胶乳5-10μg细胞mRNA，10单位RNasin，10pmol 3’端引物，1mmol/L各种dNTP(pH7.0)和50单位左右M-Mulv反转录酶(或5单位左右Taq DNA聚合酶)，反应缓冲液加水至20μl，37℃保温1h。
(3)PCR扩增目的基因片段设计4对引物，以mRNA为模板，在适宜的条件下扩增目的基因片段。
(4)克隆载体与目的基因片段的体外连接和转化目的DNA片段和表达载体pGEM-Zf均经合适的限制性核酸内切酶酶切后，经适量的T4-DNA连接酶的作用及适宜的条件下，进行体外连接。将重组子转化到相应的宿主菌。
(5)阳性重组子的筛选及鉴定将转化细菌直接涂布在含100μg/ml Amp、0.5mmol/L IPTG和40μg/mlX-gal琼脂板上，过夜培养后，可见到毫米大小的白色菌落。挑取白色菌落扩增、小量提取DNA，作限制性内切酶图谱，DNA序列测定。
(6)大量制备目的基因将筛选、鉴定后的阳性重组子大量扩增，大量提取DNA。
(7)体外连接和转化目的DNA片段和表达载体pGEX-4t-1均经合适的限制性核酸内切酶酶切后，在适宜的条件下进行体外连接。将重组子转化到相应的宿主菌。
(8)阳性重组子的筛选将细胞转入含氨苄青霉素的LB培养液中，筛选出含重组子转化菌株，提取质粒DNA作限制性内切酶图谱，DNA序列测定，确定无误后进行表达。
(9)截断性钠泵α-亚单位膜外区多肽片段的表达、鉴定和纯化重组子转化菌株在37℃培养数小时达到对数生长期后加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养3-5小时，诱导截断性钠泵催化亚单位的表达。SDS-PAGE鉴定，采用Glutathione Sepharose 4B纯化表达蛋白。
同法可以获得本发明所涉及的含有其他几条α-亚单位H1～H2和(或)H3～H4膜外区多肽截断性片段的表达。
以上三种实施方案所获得的钠泵α-亚单位膜外区的多肽片段均可用于实施方案的下述试验检测。为描述本发明，在本实施例的以下内容均采用实施方案1所获得的人工合成钠泵α3-亚单位H1～H2膜外区的多肽片段进行。
2、钠泵α-亚单位膜外区多肽体外生物学活性(影响细胞膜钠泵功能)的鉴定钠泵α-亚单位膜外区多肽对哇巴因与钠泵结合的阻断作用在新鲜配制的红细胞悬液内，加入固定浓度的哇巴因溶液、不同浓度的钠泵α-亚单位膜外区多肽溶液和Ringer氏缓冲液后，进行混合，温育，再加入86RbCl溶液，温育，终止反应，然后离心、吸去上清液后，置入γ计数器内，测得红细胞摄入的86Rb。其余的实验操作同上，结果显示，钠泵α-亚单位膜外区多肽有阻断抑制红细胞86Rb摄入的作用，在一定范围内，钠泵α-亚单位膜外区多肽的浓度越高，其对哇巴因抑制红细胞86Rb摄取的阻碍作用就越大。
3、钠泵α-亚单位膜外区多肽在体药理学实验(1)实验方法及结果高血压模型实验实验分为3组，即安慰剂组、硝普钠组、截断性钠泵片断组，每组8-10只。
各组大鼠均经25％乌拉坦麻醉，颈动脉插管监测血压，待血压稳定后舌静脉给药，阳性对照药为硝普钠(静注剂量为0.3mg/kg体重)，阴性对照为生理盐水(安慰剂)。
(2)动物药理学实验表明钠泵α-亚单位膜外区多肽的降压作用有以下特点降压效应与用药剂量有关，降压幅度和持续时间与用药剂量呈正相关；降压效果比常用降压药物硝普钠降压持续时间长；降压起效快，用药后2-5分钟起效。
4、钠泵α-亚单位膜外区多肽急性毒性实验选择18-22克体重的健康小鼠20只，雌雄各半，经尾静脉及腹腔两种途径一次注入最大浓度(230mg/Kg体重)的钠泵α-亚单位膜外区多肽。观察结果(1)试验即刻动物反应情况动物活动明显减少，但无抽搐及呼吸急促等发生。
(2)继续观察10天，实验第一天动物饮食及活动明显减少，第二天好转，第三天恢复正常，观察10天无动物死亡。
结论最大耐受性试验显示，钠泵α-亚单位膜外区多肽的急性毒性作用小。
从图5中，可以看出钠泵α-亚单位膜外区多肽用于体外生物学活性试验的结果钠泵α-亚单位膜外区多肽影响了细胞膜钠泵的生物学活性；其溶液浓度愈高时，对哇巴因抑制红细胞86Rb摄取的阻断就愈强，反之愈弱。
动物药理学实验表明(图6所示)钠泵α-亚单位膜外区多肽的降压效应与用药剂量有关，降压幅度和持续时间与用药剂量呈正相关；降压起效快，用药后2～5分钟起效。
总之，以上内容充分说明了钠泵α-亚单位膜外区多肽影响了细胞膜钠泵的生物学活性，并且可以应用于心血管疾病的治疗，尤其是治疗高血压病。
2.技术效果本发明采用上述方案获得的钠泵α-亚单位膜外区的多肽，具有体内外竞争性阻断钠泵抑制因子对钠泵活性的抑制作用，达到调节钠泵活性的目的，可以与细胞膜钠泵竞争结合钠泵调节因子，降低试验动物的血压。可直接以注射方式将其作为药物用于钠泵活性相关疾病患者或试验动物的药物治疗，达到竞争性阻断体内游离钠泵抑制因子对钠泵的抑制作用，恢复细胞膜钠泵活性，最大限度地降低对细胞正常生理功能的影响的目的，因而，可将其用于钠泵活性异常相关疾病，尤其是心血管疾病和降压药物的制备。
3.最佳实施方式3.1钠泵α-亚单位膜外区的多肽的获得3.1.1直接应用多肽合成仪合成钠泵α-亚单位膜外区的多肽，并且通过HPLC纯化(参见实施方案1)。
3.1.2采用昆虫杆状病毒表达系统制备包含钠泵α-亚单位膜外区的多肽片段(参见实施方案2)。
3.1.3采用原核表达系统制备包含钠泵α-亚单位膜外区的多肽片段(参见实施方案3)。
3.2具有体内外竞争性阻断钠泵抑制因子对钠泵活性的抑制作用，达到调节钠泵活性的目的，可直接将本发明获得的钠泵α-亚单位膜外区的多肽以注射方式将其作为药物用于钠泵活性相关疾病患者或试验动物的药物治疗，达到竞争性阻断体内游离钠泵抑制因子对钠泵的抑制作用，恢复细胞膜钠泵活性，最大限度地降低对细胞正常生理功能的影响的目的，因而，可将其用于钠泵活性异常相关疾病，尤其是心血管疾病药物的制备。
钠泵α-亚单位膜外区的多肽含有α-亚单位H1～H2和/或H3～H4膜外区多肽氨基酸序列Gln Ala Ala Thr Glu Glu Glu Pro Gln Asn Asp AsnGln Ala Ala Met Glu Asp Glu Pro Ser Asn Asp AsnGln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp AsnGlu Tyr Thr Trp Leu GluGly Tyr Ser Trp Leu GluGly Tyr Thr Trp Leu Glu
权利要求
1.钠泵α-亚单位膜外区的多肽，其特征在于，包含以下6段α-亚单位H1～H2和/或H3～H4膜外区多肽截断性片段，具体氨基酸序列如下H1～H2膜外区多肽截断性片段Gln Ala Ala Thr Glu Glu Glu Pro Gln Asn Asp AsnGln Ala Ala Met Glu Asp Glu Pro Ser Asn Asp AsnGln Ala Gly Thr Glu Asp Asp Pro Ser Asn Asp AsnH3～H4膜外区多肽截断性片段Glu Tyr Thr Trp Leu GluGly Tyr Ser Trp Leu GluGly Tyr Thr Trp Leu Glu。
2.如权利要求1所述的钠泵α-亚单位膜外区的多肽，其特征在于包含上述H1～H2和H3～H4膜外区多肽截断性片段的单一或两个以上肽段的重复多肽序列片段，且长度小于300个氨基酸的短肽或蛋白。
3.钠泵α-亚单位膜外区的多肽包含的α-亚单位H1～H2和/或H3～H4膜外区多肽截断性片段用于制备治疗心血管疾病的药物应用。
4.钠泵α-亚单位膜外区的多肽包含的α-亚单位H1～H2和/或H3～H4膜外区多肽截断性片段用于制备治疗高血压的药物应用。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的心血管疾病的药物为注射方式的药物。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的高血压的药物为注射方式的药物。
全文摘要
该发明公开了钠泵α－亚单位膜外区的多肽及其在制备调节钠泵活性药物中的应用，钠泵α－亚单位膜外区的多肽是一种包含钠泵alpha亚单位膜外区氨基酸序列的多肽，属于多肽或蛋白质的应用。该发明的钠泵α－亚单位膜外区多肽可以影响细胞膜钠泵的生物学活性，具有治疗心血管疾病的潜能，并且在体外实验中证实其具有阻断或拮抗哇巴因抑制钠泵的作用，以及动物药理学实验表明其可以降低高血压动物模型的血压。因此，该发明可用于心血管疾病的治疗，尤其是应用于高血压病的治疗，同时具有疗效显著、副作用小等特点。
文档编号A61P9/12GK1837236SQ20061004274
公开日2006年9月27日 申请日期2006年4月27日 优先权日2006年4月27日
发明者张明娟 申请人:西安交通大学