一种应用静息细胞转化1,3-丙二醇为3-羟基丙酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种应用静息细胞转化1,3-丙二醇为3-羟基丙酸的方法，属于生物工程领域。本发明首先利用快速筛选法筛选出一株具有高转化性能、高生产能力的微生物菌株，经鉴定为醋杆菌（Acetobacter?sp.）JDB-71，并利用该菌静息细胞在水相体系中高效催化1,3-丙二醇为3-羟基丙酸，所得醋杆菌培养工艺简单、转化效率高、产物产量大、转化液成分简单利于产品分离纯化、转化过程可以人为地调节菌体浓度以缩短生产时间，节约大量的能源和生产成本。
【专利说明】一种应用静息细胞转化1 ’ 3-丙二醇为3-羟基丙酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种应用静息细胞转化1，3_丙二醇为3-羟基丙酸的方法，尤其是以一株醋杆菌及其静息细胞应用于转化1，3-丙二醇为3-羟基丙酸的方法，属于生物工程领域。
【背景技术】
[0002]3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid,简称3-HP),又名β_羟基丙酸,与乳酸互为同分异构体，因其碳链两端分别具有一个羟基和羧基，是一种具有很高价值的化学中间体，如通过羧基还原可得到醇或醛，与醇反应得到酯或转化为酰胺及其衍生物，通过羟基氧化得到醛或二酸，脱水转化为不饱和化合物，聚合得到生物可降解高分子材料等，此外，Schwarz等的研究数据显示3-羟基丙酸能够杀死寄生于植物内的线虫(M.1ncognita)且不会诱导其产生耐药性，正因为其具有这么多潜在的价值，美国能源部将其列为最具潜力的化工产品之一。
[0003]目前3-羟基丙酸的生产方法主要有化学合成法、微生物发酵法和微生物转化法。传统的3-羟基丙酸化学合成法是将3-羟基丙腈(氰化钾与邻卤代醇反应)水解。此外，沈长洲等在1995年报道了丙烯酸高温水合法生产3-羟基丙酸。Haas等1998年提出3-HPA钼金催化法生产3-羟基丙酸。2000年Ishida等提出一种丙烯酸固体酸水合法，该方法以ZSMSzeolite为催化剂。化学合成法在碳末端引入功能团有很大的难度，副反应多、工艺要求较高、副产物较多不易分离提纯，生产成本较高，操作复杂，生产过程存在不安全因素，产量较低。
[0004]微生物发酵法主要是通过基因工程的方法构建工程菌，其主要的策略有两种:以葡萄糖为底物的生产途径和以甘油为底物的生产途径，但是发酵法具有菌种不稳定、生产周期长、产物提纯过程繁琐、转化率低、产量低、产品纯度低、含有相当量的3-羟基丙酸醚键二聚体等不足。
[0005]在上世纪60年代，已开始了微生物转化法制备3-羟基丙酸的研究。Harada等研究Hansenula miso菌时首次发现该菌株可以通过氧化1，3-丙二醇得到3-羟基丙酸；Miyoshi等在研究Fusarium merismoides菌时发现该菌可以利用丙酸羟基化来生产3_羟基丙酸；Hasegawa等发现一株不积累丙酸的突变株Candida rugosa能以2%丙酸为底物生产3-羟基丙酸,产率达89% ；Takamizawa等利用微生物转化丙烯酸生产3_羟基丙酸，在7%丙烯酸和2%葡萄糖培养基中，以氢氧化钙调节pH，经过Ild的培养转化，得到4.8%的3-羟基丙酸。
[0006] 本发明的创新之处在于提供了一株高转化1，3-丙二醇性能、高生产3-羟基丙酸能力的醋杆菌(Acetobacter sp.),并首次报道了利用利用其静息细胞催化1，3_丙二醇转化为3-羟基丙酸的方法，具有微生物培养工艺简单、转化效率高、产物产量大、转化液成分简单，以3-羟基丙酸为主要成分，其他成分含量较少，利于产品分离纯化、转化过程可以人为地调节菌体浓度以缩短生产时间，节约大量的能源和生产成本，利于推广。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的第一个问题是提供一株新的醋杆菌(Acetobacter sp.),于2013年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院，保藏编号为CGMCC N0.8142。
[0008]所述醋酸杆菌是从不同地域采集到的土壤中筛选得到，能够以1，3-丙二醇为底物高效转化生产3-羟基丙酸。
[0009]本发明要解决的第二个问题是提供一种利用醋杆菌静息细胞转化1，3-丙二醇为
3-羟基丙酸的方法，是利用所述醋杆菌，在水相体系中，以1，3-丙二醇为底物进行生物催化反应生产3-羟基丙酸，具体步骤如下:
[0010](I)菌株的培养:发酵培养基(g/L):葡萄糖10-100，酵母膏1-10，蛋白胨1-10，PH3-10 ;培养温度20-40°C ;摇床转速100-300rpm ;培养时间1_3天，将发酵液离心获得菌体。
[0011](2)催化反应体系的建立:菌体经两次洗涤后用缓冲液配制成一定pH (3-10)的菌体悬浮液，菌体浓度2-50g/L，加入终浓度为l-100g/L的1，3-丙二醇，进行单一水相催化反应，催化温度20-40°C，摇床转速100-300rpm，催化时间l_72h。所述缓冲液可以是柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；所用缓冲液体系浓度为0.05-0.5mol/L ；pH范围在3_10。
[0012](3)转化液的处理与分析:微生物催化后的反应液经离心去除菌体后，反应液经
0.22 um的水相滤膜过滤后进行HPLC检测。
[0013]本发明的有益效果:本发明首先通过快速筛选技术筛选到了一株具有高转化1，3-丙二醇性能、高生产3-羟基丙酸能力的醋杆菌(Acetobacter sp.)JDB_71。在水相体系中高效的转化1，3-丙二醇为3-羟基丙酸，在l_50g底物浓度范围内，产物的转化率高达85%以上，利用该菌株静息细胞转化1，3-丙二醇生产3-羟基丙酸的方法培养工艺简单、转化效率高、转化液成分简单，以3-羟基丙酸为主要成分，其他成分较少，利于产品分离纯化、产物产量大、转化时间短、转化过程可以人为地调节菌体浓度以缩短生产时间，节约大量的能源和生产成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1:3_羟基丙酸标样液相色谱图
[0015]图2:静息细胞转化液液相色谱图
[0016]图3:3_羟基丙酸标样质谱图
[0017]图4:静息细胞转化液质谱图
[0018]图5:不同1，3-丙二醇浓度下3-羟基丙酸的产量，▲:转化率
[0019]图6 ;不同pH对初始催化速率的影响
[0020]图7:不同催化温度对初始催化速率的影响
[0021]图8:不同菌体浓度对初始催化速率的影响
【具体实施方式】[0022]实施例1高转化1，3-丙二醇性能、高生产3-羟基丙酸能力微生物菌株的筛选
[0023]富集培养基(g/L):葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨2。
[0024]平板筛选培养基(g/L):葡萄糖20，酵母膏5，琼脂20，CaC0310 (单独灭菌后加入),无水乙醇30 (培养基灭菌完成后加入)。
[0025]种子培养基、发酵培养基(g/L):葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨2，ρΗ6.0。
[0026]分析方法:通过HPLC进行3-羟基丙酸的检测，色谱柱:B10RAD ΗΡΧ-87Η色谱柱；流动相0.005mol/L浓硫酸；流速0.6mL/min ;检测温度60°C ;检测波长210nm。
[0027]将采集到的不同地域土壤加入到含有玻璃珠的无菌生理盐水中震荡Ih后静置取上清液加入富集培养基中进行静置培养2-4天，待培养基表面长出菌膜后取一定量的菌膜再次接种富集培养基中，将培养好的菌液进行梯度稀释然后涂布到平板筛选培养基上，20-40°C培养2-4天挑取透明圈直径与菌落直径比值较大的单菌落进行催化验证。
[0028]将筛选得到的单菌落接入种子培养基(50mL/250mL)中，30°C，220rpm培养16h后，以10%的接种量接入发酵培养基中，30°C，220rpm培养48h后，离心获得菌体，将菌体用PH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤两次后，用pH6.0的磷酸盐缓冲液将菌体悬浮，制成菌体浓度5g/L的菌悬液，加入一定量的底物1，3-丙二醇，使其终浓度为10g/L，在30°C，220rpm下催化24h内取样，转化液经离心去除菌体，0.22 μ m的水相滤膜过滤后进行HPLC和质谱检测。
[0029]经过HPLC检测 得到3-羟基丙酸标准品的出峰时间在13.057min左右(附图1)，转化液经HPLC在相同条件下检测发现中存在很明显的峰，出峰时间在13.051min左右(附图
2)，与标准品出峰时间很吻合。将3-羟基丙酸的标准品与转化液进行HPLC-MS检测，比较质朴图发现两者存在相同的m/z=89特征峰(附图3、4)由此可以判断筛选得到的菌株具有转化1，3-丙二醇为3-羟基丙酸的能力。
[0030]经HPLC检测发现，3-HP的产量在9.5g/L左右，转化率高达95%，筛选到一株具有高转化1，3-丙二醇性能、高生产3-羟基丙酸能力微生物菌株，该菌株经鉴定为醋杆菌(Acetobacter sp.),现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为 CGMCCN0.8142。
[0031]实施例2不同底物浓度对转化的影响
[0032]将在发酵培养基培养32h的菌体离心后用pH6.0的磷酸盐缓冲液洗涤菌体两次后，用pH6.0的磷酸盐缓冲液将菌体悬浮，制成菌体浓度6g/L的菌悬液，加入不同量的底物1，3-丙二醇，使其终浓度分别为 10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L，在 30°C，220rpm 下催化72h内取样，转化液经离心去除菌体，0.22um的水相滤膜过滤后进行HPLC检测其产量，其产量可以分别达到9.6g/L、18.9g/L、27.7g/L、35.9g/L、45.5g/L，转化率均在90%以上(附图5)。
[0033]实施例3不同初始pH对转化的影响
[0034]将在发酵培养基培养32h的菌体离心后分别用ρΗ4.0、ρΗ4.5、ρΗ5.0、ρΗ5.5、ρΗ6.0、ρΗ6.5、ρΗ7.0、ρΗ7.5、ρΗ8.0的缓冲液洗涤菌体两次后，用相应pH的缓冲液将菌体悬浮，制成菌体浓度6g/L的菌悬液，加入20g/L的1，3-丙二醇，220rpm, 30°C测定经6h催化后3-羟基丙酸的生成量作为其初始催化速率。在pH6.0左右催化速率最大，可以达到
1.lg/L*h，pH偏酸或偏碱均造成其催化速率的下降，在pH4.0左右其催化速率大约下降了40% (附图 6)。[0035]实施例4不同培养温度对转化的影响
[0036]将在发酵培养基培养32h的菌体离心后用pH6.0的磷酸缓冲液洗涤菌体两次后，再将其制成菌体浓度6g/L的菌悬液，加入20g/L的1，3_丙二醇，220rpm，分别于20°C、25°C、30°C、35°C、40°C下测定其初始催化速率，静息细胞最合适的催化温度在30V左右(附图7)。
[0037]实施例5不同菌体浓度对转化的影响
[0038]将在发酵培养基培养32h的菌体离心后用pH6.0的磷酸缓冲液洗涤菌体两次后，再将分别制成菌体浓度分别为4g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L的菌悬液，加入20g/L的1，3-丙二醇，220rpm, 30°C测定其初始催化速率。由图8可得，在4_12g/L菌体浓度范围内，随着菌体浓度的升 高，静息细胞的初始催化速率也伴随着升高(附图8)。
[0039]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一株具有高转化1，3-丙二醇生产3-羟基丙酸能力的醋杆菌(Acetobacter sp.)JDB-71，于2013年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路I号院，保藏编号为CGMCC N0.8142。
2.一种利用权利要求1所述醋杆菌转化1，3-丙二醇生产3-羟基丙酸的方法，其特征在于，培养好的微生物经离心洗涤获得菌体后制成菌悬液，在水相缓冲液体系中，以1，3-丙二醇为底物进行催化反应生产3-羟基丙酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)醋杆菌的培养:将醋杆菌种子培养液接种到发酵培养基，20-40°C培养时间1-2天； (2)静息细胞催化反应:将发酵培养24-48h的菌体离心后洗涤两次，用缓冲液重新悬浮制成一定菌体浓度的菌悬液，加入I, 3-丙二醇,在20-4011C和100-300rpm摇床转速下进行催化反应l_72h，转化反应完成后转化液经离心去除菌体，取上清液经0.22 μ m水相滤膜过滤后进行HPLC检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的碳源至少为葡萄糖、蔗糖、果糖、山梨糖醇、甘露醇、甘油中的一种；所述发酵培养基碳源的浓度为10-100g/L，酵母膏 l-10g/L，蛋白胨 l-10g/L，pH3-10。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液可以是柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；所用缓冲液体系浓度为0.05-0.5mol/L ；pH范围在3-10。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌悬液浓度为2-50g/L。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述底物1，3-丙二醇终浓度为1-1OOg/L0
【文档编号】C12N1/20GK103525727SQ201310468917
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】诸葛斌, 吴金鑫, 宗红, 陆信曜, 宋健, 方慧英, 诸葛健 申请人:江南大学