专利名称：烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种羟基化烟酸的生产方法，具体涉及一种微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺。
背景技术：
6-羟基烟酸是一种重要的合成医药、农药、染料等化合物的中间体，6-羟基烟酸再进一步酰氯化、还原，可达到6-氯-3-羟甲基吡啶，应用十分广泛。生产6-羟基烟酸的传统方法是利用烟酸可被微生物羟基化的发酵技术获得。利用微生物羟基化烟酸已有瑞士公司申请欧洲专利(Lehky，P et al.，Eur.Pat.Appl.No.0152948，1985；Kulla H and Lehky，P.，Eur.Pat.Appl.No.0152949，1985)，该专利采用Achromobacter xylosoxydans DSM2783菌株和Pseudomonas putida NCIB 10521菌株和8176菌株进行微生物转化，其专利生产工艺分为两步第一步是先培养一定生物量的具有高活性烟酸羟基化酶的菌体，第二步是利用收获的菌体静息细胞进行烟酸的羟基化反应。该专利强调这两步过程不可能合并为一个过程。日本学者Nagasawa等人(Biosci.Biotech.Biochem.58(4)，665-668，1994)和Hurh等人(J Fermentationand bioengineering，77(4)，382-385，1994)也分别报道首先在一定培养基中培养荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens TN5)或沙雷铁氏菌(Serratiamarcescens IFO 12648)，培养过程中可加烟酸诱导羟基化酶的形成，然后通过离心获得菌体静息细胞，再使用静息细胞在含有烟酸的缓冲溶液中进行羟基化反应。以往生产工艺存在的主要问题是，烟酸转化菌体的静息细胞的生产需要使用大量的烟酸作为诱导物加入到发酵培养的介质中，以便在培养过程中诱导菌体产生较高的羟基化酶活性，然后收获菌体静息细胞，再加入到转化液中，转化烟酸为6-羟基-烟酸，由于菌体培养时使用的诱导剂浓度通常为1％烟酸，结果造成菌体诱导发酵培养过程需要很高的成本，难以在生产中推广使用。
发明内容
针对现有技术的上述不足，以及现有技术中存在的培养菌体与烟酸的羟基化“两步过程不可能合并为一个过程”的传统偏见，本发明采用分离保藏的烟酸羟基化转化菌种，分析烟酸作为诱导物培养微生物时的代谢去向，发现在微生物培养过程中，诱导物烟酸并没有被彻底降解，而只是被羟基化成6-羟基烟酸，因而可以将转化菌在合适培养基中生长，将转化底物加到培养液中，微生物在生长过程中，不断将底物转化成产物，直到转化完成。但转化发酵培养液中底物烟酸浓度不能超过1％，否则将抑制微生物生长和羟基化酶活性的诱导，而使用1％底物浓度进行转化生产效率低、成本高，这就是为什么以往微生物烟酸羟基化是采用静息细胞转化法，而不是采用转化发酵一步法。我们通过研究采用不断补加消耗的烟酸以维持底物在1％左右的恒定水平，解决了发酵转化过程需要尽可能高的底物浓度，同时又避免了底物浓度过高对微生物生长和酶诱导活性产生抑制作用的问题。我们还研究发现，发酵转化培养结束时，尽管发酵液中底物的转化率大幅降低，但检测表明，这主要是由于转化产物的抑制作用引起的，实际上菌体的转化活力并没有下降，可作为静息细胞用于随后的底物转化反应。在静息细胞转化液中，回收菌体细胞的转化活力与以往常规方法培养获得的菌体静息细胞相比不但不低，相反还高出20％以上，这主要得益于发酵转化过程中要不断补充转化掉的底物，以维持底物(亦即诱导物)在一个恒定的高浓度水平，不象静息细胞培养时只是在开始时加入一定量的诱导物，很快诱导物就被全部转化消耗，因而导致诱导作用很快消失，使所收获的菌体静息细胞的诱导酶活性较低。这样，当转化发酵结束后，回收转化发酵培养液中的菌体作为静息细胞，与底物溶液混合继续进行底物转化，改变了以往转化发酵一步法转化技术只使用微生物生长与转化同步进行过程，而反应结束后仍具有转化活力的菌体被抛弃不再被利用的状况。据此，我们将目前通常用于微生物转化使用的“微生物生长与转化同步进行即转化发酵培养一步法技术”和“静息细胞培养/转化两步法技术”相组合，建立了新的“烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺”。该工艺比以往烟酸微生物羟基化单独使用“静息细胞培养/转化两步法技术”的生产效率提高1倍以上。该工艺也可广泛应用于其他微生物转化过程，大大提高现有的微生物转化工艺的生产效率。
本发明的烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺，步骤如下将具有烟酸羟基化酶活力的微生物菌种接种到含烟酸培养液中，进行烟酸微生物转化发酵培养，同时不断添加底物烟酸到转化发酵培养液中，维持烟酸浓度在0.1％以上，使微生物在生长同时，不断将烟酸转化为产物6-羟基烟酸；转化发酵培养结束后，将转化发酵培养液与菌体分离，所获转化发酵培养液经酸化静置，使6-羟基烟酸结晶析出，所获菌体沉淀作为静息细胞；菌体沉淀获得的静息细胞可直接或经适当处理后，加入到烟酸转化液中进行静息细胞转化反应，同时不断添加被消耗的烟酸，使转化液中的烟酸转化为6-羟基烟酸，转化结束后，去除菌体细胞，将转化液酸化静置使6-羟基烟酸结晶析出；将转化发酵培养液中和静息细胞转化液中分别析出的6-羟基烟酸晶体单独或合并，经洗涤、干燥，得到纯度＞90％的6-羟基烟酸产品。
上述具有烟酸羟基化酶活力的微生物菌种，可以是Achromobacter spp.，Comamonas spp.，Pseudomonas spp.，Serratia spp.等，也可以是任何其他可羟基化烟酸的微生物。
上述用于烟酸羟基化微生物转化发酵培养所用的含烟酸培养基，可以是任何一种适合于微生物生长的营养介质，但是其中要加入0.1％以上的烟酸。
上述烟酸羟基化微生物转化发酵培养条件是10～60℃，1～300rpm摇瓶震荡通气、或搅拌通气、或管道通气供氧，发酵转化培养1～96小时。在培养过程中不断添加烟酸到发酵培养液中，维持诱导物烟酸浓度在0.1％以上，以补充因被转化为6-羟基烟酸而减少了的烟酸，保证转化底物烟酸源源不断获得供给，维持微生物在烟酸转化发酵培养生长过程中，不断将烟酸转化为产物6-羟基烟酸，而不是以往仅在配制培养基时一次性加入烟酸作为诱导物，以便最大限度获得转化产物6-羟基烟酸。
上述烟酸羟基化微生物转化发酵培养过程中，添加底物烟酸到转化发酵培养液中时，可使用含0.5％以上烟酸的水溶液、或含0.5％以上烟酸的发酵培养基、或含0.5％以上烟酸的任何一种缓冲溶液，也可以直接使用烟酸固体。添加方式可通过管道流加、或滴加或直接间歇添加。
上述烟酸羟基化微生物转化发酵培养过程结束后，转化发酵培养液与菌体分离时可采用＞1000rpm的离心分离方法、或过滤分离方法。
上述烟酸羟基化微生物转化发酵培养液经菌液分离后，转化发酵培养液不是排放丢弃，而是需要回收。回收得到的不含菌体细胞的转化发酵培养液，用盐酸、或硫酸、或其他任意一种有机或无机酸调至pH1～5，低温静置使6-羟基烟酸结晶析出，回收晶体并用酸化水溶液(pH1～5)洗涤、干燥后为6-羟基烟酸成品，若产品不纯，可通过中性水溶液或缓冲溶液重新溶解晶体，再酸化重结晶予以纯化。
上述烟酸羟基化微生物静息细胞转化反应时，可直接使用的菌体是指烟酸羟基化微生物转化发酵培养结束后，培养液经离心或过滤获得的菌体沉淀；可使用经适当处理的菌体既可是指前述的菌体沉淀经30～90℃加热处理一段时间后所获得的死菌体；也可是指前述的菌体沉淀经任意一种已知的固定化方法(如凝胶包埋法和离子吸附法)处理所获得的固定化菌体；也可是指前述的菌体沉淀，通过细胞自溶、或细胞破碎等方法使酶释放到溶液中，通过离心或过滤等方法除去菌体细胞碎片后，所得的细胞酶提取液，或经硫酸铵盐析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等纯化后的羟基化酶制剂。
上述烟酸羟基化微生物静息细胞转化反应时，需要控制底物烟酸浓度＞0.1％(在任意一种pH6～8的溶液中)，温度范围在10～60℃，1～300rpm摇瓶震荡通气、或搅拌通气、或管道通气供氧，反应时间1～96小时。转化过程中要流加或间歇添加含0.5％以上烟酸的水溶液、或含0.5％以上烟酸的发酵培养液、或任何一种含0.5％以上烟酸的缓冲溶液，也可以直接添加烟酸固体，以维持转化液中烟酸浓度在0.1％以上。转化结束后，将转化液与菌体通过离心或过滤分开。所获转化液用任意一种有机或无机酸调至pH1～5，0℃至室温静置，使6-羟基烟酸结晶析出。
上述从烟酸羟基化微生物发酵转化培养液中和从静息细胞转化液中分别析出的6-羟基烟酸晶体，可以单独或合并后用酸化水溶液(pH1～5)洗涤去除杂质，室温或不超过120℃加热干燥，得到纯度＞90％的6-羟基烟酸产品。亦可通过重结晶进一步提高产品纯度。
具体实施例方式
实施例1，将50ml含1％烟酸的LB培养基放入250ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Pseudomonas sp.NJ1菌种，28℃，200rpm震荡培养进行烟酸羟基化的转化发酵培养，培养过程中每1h补充一次因转化消耗了的烟酸，使之浓度恢复到1％，32h后停止转化发酵培养，5000rpm离心3分钟，使菌体和发酵培养液分离。用1M硫酸将去除菌体的转化发酵培养液调至pH2.0，静置过夜待晶体析出后，过滤收集晶体，洗涤、干燥后，得10.2克6-羟基烟酸。将菌体加入到50ml含1％烟酸的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，28℃，200rpm震荡通气进行烟酸羟基化的微生物静息细胞转化反应，转化过程中每1h补充一次因转化消耗了的烟酸，使之浓度恢复到1％，32h后停止转化反应，5000rpm离心3分钟去除菌体，上清液用1M硫酸调至pH2.0，静置过夜待晶体析出后，过滤收集晶体，洗涤、干燥后，得11.7克6-羟基烟酸。
实施例2、将50ml含1.0％烟酸的牛肉膏蛋白胨培养基放入250ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌后，接入Pseudomonas sp.NJ2菌种，28℃，200rpm震荡培养进行烟酸羟基化转化发酵培养，培养过程中每2h补充一次因转化消耗了的烟酸，使之浓度恢复到1.0％，36h后停止转化发酵培养，离心使菌体和发酵培养液分离。用1M盐酸将去除菌体的转化发酵培养液调至pH2.0，静置使晶体析出后，过滤收集晶体，洗涤、干燥后，得7.2克6-羟基烟酸。将菌体加入到50ml含1％烟酸的20mM硼酸盐缓冲溶液(pH7.0)中，28℃，200rpm震荡通气进行烟酸羟基化的静息细胞转化反应，转化过程中每2h补充一次因转化消耗了的烟酸，使之浓度恢复到1％，36h后停止转化反应，离心去除菌体，上清液用1M盐酸调至pH3.0，静置晶体析出后，过滤收集晶体，洗涤、干燥，得8.1克6-羟基烟酸。
权利要求
1.一种烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺，步骤如下将具有烟酸羟基化酶活力的微生物菌种接种到含烟酸培养液中，进行烟酸微生物转化发酵培养，同时不断添加底物烟酸到转化发酵培养液中，维持烟酸浓度在0.1％以上；转化发酵培养结束后，将转化发酵培养液与菌体分离，所获转化发酵培养液经酸化静置，使6-羟基烟酸结晶析出，所获菌体沉淀作为静息细胞；菌体沉淀获得的静息细胞可直接或经适当处理后，加入到烟酸转化液中进行静息细胞转化反应，同时不断添加被消耗的烟酸，使转化液中的烟酸转化为6-羟基烟酸，转化结束后，去除菌体细胞，将转化液酸化静置使6-羟基烟酸结晶析出；将转化发酵培养液中和静息细胞转化液中分别析出的6-羟基烟酸晶体单独或合并，经洗涤、干燥，得到纯度＞90％的6-羟基烟酸产品。
2.按照权利要求1所述的烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺，其特征在于所述的具有烟酸羟基化酶活力的微生物菌种，是Achromobacter spp.，Comamonas spp.，Pseudomonas spp.，Serratia spp.中的任意一种。
3.按照权利要求1或2所述的烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺，其特征在于所述的烟酸羟基化微生物转化发酵培养条件是10～60℃，1～300rpm摇瓶震荡通气、或搅拌通气、或管道通气供氧，发酵转化培养1～96小时。
4.按照权利要求3所述的烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺，其特征在于上述烟酸羟基化微生物转化发酵培养过程中，添加底物烟酸到转化发酵培养液中时，使用含0.5％以上烟酸的水溶液、或含0.5％以上烟酸的发酵培养基、或含0.5％以上烟酸的任何一种缓冲溶液，也可以直接使用烟酸固体。
5.按照权利要求4所述的烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺，其特征在于所述的烟酸羟基化转化发酵培养液与菌体分离，采用＞1000rpm的离心分离方法、或过滤分离方法。
6.按照权利要求4所述的烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺，其特征在于回收获得的不含菌体的转化发酵培养液的方法是，用盐酸、或硫酸、或其他任意一种有机或无机酸调至pH1～5，0℃至室温静置，使6-羟基烟酸结晶析出。
7.按照权利要求4所述的烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺，其特征在于当进行所述的烟酸羟基化静息细胞转化反应时，直接使用的菌体是指烟酸羟基化微生物转化发酵培养结束后，直接从培养液经离心或过滤获得的菌体沉淀；使用经适当处理的菌体是指前述的菌体沉淀经30～90℃加热处理一段时间后所获得的死菌体；或是指前述的菌体沉淀经任意一种已知的固定化方法处理所获得的固定化菌体；或是指前述的菌体沉淀，通过细胞自溶、或细胞破碎等方法使酶释放到溶液中，通过离心或过滤等方法除去菌体细胞碎片后，所得的细胞酶提取液，或经硫酸铵盐析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法等纯化后的羟基化酶制剂。
8.根据权利要求4所述的烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺，其特征在于所述的烟酸羟基化静息细胞转化反应条件为，底物烟酸浓度＞0.1％，温度范围在10～60℃，1～300rpm摇瓶震荡通气、或搅拌通气、或管道通气供氧，反应时间1～96小时。转化过程中要流加或间歇添加含0.5％以上烟酸的水溶液、或含0.5％以上烟酸的发酵培养液、或任何一种含0.5％以上烟酸的缓冲溶液，也可以直接添加烟酸固体，以维持转化液中烟酸浓度在0.1％以上。转化结束后，将转化液与菌体通过离心或过滤分开。所获转化液用任意一种有机或无机酸调至pH1～5，0℃至室温静置，使6-羟基烟酸结晶析出。
9.根据权利要求5或6或7或8所述的烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺，其特征在于所述的从烟酸羟基化微生物转化发酵培养液中和静息细胞转化液中分别析出的6-羟基烟酸晶体，单独或合并后用酸化水溶液洗涤去除杂质，室温或不超过120℃加热干燥，得到纯度＞90％的6-羟基烟酸产品，或通过重结晶进一步提高产品纯度。
全文摘要
烟酸羟基化微生物转化发酵与静息细胞转化综合生产工艺将菌种接种到含烟酸培养液中进行转化发酵培养，不断添加烟酸到培养液中，维持浓度在0.1％以上；培养结束后将培养液与菌体分离，培养液经酸化静置使6－羟基烟酸结晶析出，菌体沉淀作为静息细胞；静息细胞加入到烟酸转化液中进行静息细胞转化反应，不断添加烟酸，使烟酸转化为6－羟基烟酸，转化结束后，去除菌体细胞，转化液酸化静置使6－羟基烟酸结晶析出；将培养液中和转化液中分别析出的6－羟基烟酸晶体，洗涤、干燥，得到纯度＞90％的6－羟基烟酸产品。本发明克服了培养菌体与烟酸的羟基化“两步不可能合并为一个过程”的传统偏见，新工艺的生产效率提高了1倍以上。
文档编号C12P17/10GK1526824SQ0315827
公开日2004年9月8日 申请日期2003年9月22日 优先权日2003年9月22日
发明者袁生, 王鑫, 张湘宁, 徐尚成, 陆伟宏, 李学贵, 倪珏萍, 袁 生 申请人:南京师范大学, 江苏省农药研究所有限公司