专利名称：一种食用菌液体菌种静息化保存方法
技术领域：
本发明属于食用菌液体菌种应用技术领域，具体涉及一种食用菌 液体菌种静息化保存方法。
背景技术：
食用菌液体菌种是应用发酵设备采用液体培养基发酵生产出的 液体种子，应用液体菌种作为栽培种进行接菌生产可以提高食用菌的 产量和质量，且易于实现食用菌的工业化和标准化生产。但食用菌液 体菌种生产出来后难以保存，生产出的液体菌种必须马上应用，如果 久放菌丝球继续生长和分裂，培养基中营养元素被逐渐消耗，液体菌 种的质量逐渐下降，将不能继续应用于食用菌生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用性好，工艺简单，易于掌握的食用 菌液体菌种静息化保存方法。
为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为
保存的方法首先将制备好的食用菌液体菌种离心或过滤收集菌 丝球，然后将菌丝球用清洗缓冲液冲洗l一4次，冲洗后再经离心或 过滤收集菌丝球，把菌丝球悬浮于静息培养基中培养6-24小时，而 后将其冷藏保存;其中，所述静息培养基的成分为葡萄糖0.5%-1%，氯 化钠0. 2%-0. 5%，硝酸铵0.05-1%,氯化钾0.05-0.15%，硫酸镁 0. 01%-0. 5%,硫酸亚铁0. 005°/。-0. 0ly。，余量为水，调整PH值至6. 5-7. 7; 所述清洗缓冲液为灭菌磷酸盐缓冲液、灭菌硼酸盐缓冲液或灭菌生理 盐水。
离心收集菌丝球时离心机转速为3000r/min—8000r/min,离 心时间为5-30 min。所述清洗菌丝球时的清洗缓冲液为菌液体积的 2-6倍；静息培养基为菌体体积的1-3倍。所述静息培养后的菌液冷 藏温度为l-l(TC，时间为1-6个月。过滤收集菌丝球釆用灭菌纱布或 灭菌尼龙网或灭菌滤纸直接过滤或抽滤。所述灭菌磷酸盐缓冲液PH 为6. 5-8. 5,灭菌硼酸盐缓冲液PH为6. 5-8.5。
本发明的优点在于
1. 本发明将食用菌液体菌种经菌丝球收集、冲洗、重悬浮等步骤 处理后冷藏保存，使菌丝球保持静息化状态，既保持了液体菌种持久 的活力，也延长了保存时间。
2. 本发明对于常用的食用菌菌种所制作的液体菌种均有效，可利 用面广，而且适用性好，工艺简单，易于掌握。3. 本发明所保存的食用菌液体菌种在接种应用时可直接使用接 种枪和自动接种机进行接种，简便快捷。
4. 釆用本发明的保存方法，菌丝球中的菌种细胞保持静息化状
态，只进行微弱的内源代谢，菌种细胞也不分裂，菌种可保持持久的 活力，这样就使一次发酵制备的食用菌液体菌种能够长时间保存，改 善了食用菌液体菌种的储藏条件，提髙了食用菌液体菌种的利用水平。
具体实施例方式
实施例l白色金针菇液体菌种静息化保存
白色金针菇液体菌种菌丝球的收集白色金针菇液体菌种培养基 组成为玉米粉2%，麸皮2%， KH2PO40. 1%， MgS04 0. 05 %, 10ugVB1 / 100ml以及50ugVB2 / 100ml。发酵条件为摇瓶装液量70ml / 250ml ， 接种量10%,培^基起始pH为6.5,摇瓶转速200r/min，培养温 度28'C,培养时间7d。
将制备好的白色金针菇液体菌种通过离心机离心收集菌丝球， 离心机转速为3500r/min离心时间为20min;然后用菌丝球清洗缓 冲液冲洗收集的菌丝球2次；将冲洗好的白色金针菇液体菌种菌丝球 通过离心机离心重新收集，离心机转速为3500r/min离心时间为20 min;将重新收集的已冲洗好的白色金针菇液体菌种菌丝球悬浮于静 息培养基中培养12小时；而后将悬浮好的液体菌种菌丝球静息化体 系放于4'C冰箱或冷柜中冷藏保存2-3个月。
所述清洗缓冲液制备相当于白色金针菇液体菌种4倍体积的磷 酸盐缓冲液，将其在1. 05Kg/cm2压力下12rC灭菌20min;磷酸盐缓 冲液、磷酸盐缓冲液配比(质量百分数)为Na2HP04 0. 2 ， KH2P04 0. 69%, PH7. 5。
所述静息培养基制备相当于白色金针菇液体菌种1. 5倍体积的 静息培养基，将其在1. 05Kg/cm2压力下12rC灭菌20min。静息培养 基成分配比为葡萄糖0. 5%-1%,氯化钠0.3%,硝酸铵0.6%,氯化 钾0. 15%,硫酸镁0. 05°/。，硫酸亚铁0. 01%，余量为水，调整PH值至 6. 8-7. 4。
实施例2白灵菇液体菌种静息化保存
白灵菇液体菌种菌丝球的收集白灵菇液体菌种培养基组成为 蔗糖2. 0%，玉米粉3. 0%，蛋白胨O. 3%,麸皮4. 0%,磷酸二氢钾 0.3%,硫酸镁O. 1%，硫酸钙O. 1%。发酵条件为摇瓶装液量60ml / 250ml,接种量8%,培养基起始pH为6. 5，摇瓶转速220r /min, 培养温度25t:,培养时间7d。
将制备好的白灵菇液体菌种通过离心机离心收集菌丝球，离心 机转速为4000r/min离心时间为10 min;然后用菌丝球清洗缓冲液菌种菌丝球通过离心 机离心重新收集，离心机转速为4000r/min离心时间为10 min;将 重新收集的已冲洗好的白灵菇液体菌种菌丝球悬浮于静息培养基中 培养6小时；而后将悬浮好的液体菌种菌丝球静息化体系放于l(TC 冰箱或冷柜中冷藏保存1-4个月。
所述清洗缓冲液制备相当于白灵菇液体菌种3倍体积的硼酸盐 缓冲液，将其在1. 05Kg/cn 压力下121'C灭菌20min;硼酸盐缓冲液 配比(质量百分数)为Na2BA .10H20 0. 45%、 H2BO 11. 89%、NaCl 2. 79%， PH7. 0-7. 5。
所述静息培养基制备相当于白灵菇液体菌种1.2倍体积的静息 培养基，将其在1. 05Kg/cm2压力下U5。C灭菌20min;静息培养基成 分配比为葡萄糖0. 5%-1%,氯化钠0. 5%，硝酸铵0. 1%,氯化钾0. 1%， 硫酸镁O. 05%,硫酸亚铁O. 01%,余量为水，调整PH值至7. 0-7. 2。
实施例3平菇液体菌种静息化保存
平菇液体菌种菌丝球的收集平菇液体菌种培养基组成为蔗糖 2%,玉米粉4%,麦麸3%，酵母粉O. 3%， KH2PO40. 25%， MgSO40. 1%。发 酵条件为摇瓶装液量8Gml/50Gml，接种量10%，培养基起始pH 为6. 4，摇瓶转速150r/min,培养温度28'C,培养时间7d。
将制备好的平菇液体菌种通过离心机离心收集菌丝球，离心机 转速为3000r/min离心时间为30 min;然后用生理盐水冲洗收集的 菌丝球2次；将冲洗好的平菇液体菌种菌丝球通过离心机离心重新收 集，离心机转速为3000r/min,离心时间为30 min;将重新收集的 已冲洗好的平菇液体菌种菌丝球悬浮于静息培养基中培养18小时；
而后将悬浮好的液体菌种菌丝球静息化体系放于rc冰箱或冷柜中冷
藏保存5-6个月。
所述清洗缓冲液制备相当于平菇液体菌种2倍体积的生理盐 水，将其在1. 05Kg/cn 压力下121'C灭菌20min;生理盐水配比(质 量百分数)为NaCl G. 9%, PH7. 0-7. 2。
所述静息培养基制备相当于平菇液体菌种2倍体积的静息培养 基，将其在l. 05Kg/cm2压力下115X:灭菌20min;静息培养基成分配 比为葡萄糖O. 5%-1%，氯化钠O. 4%，硝酸铵O. 05%,氯化钾0. 12%， 硫酸镁O. 03%,硫酸亚铁O. 01%,余量为水，调整PH值至6. 6-7. 0。
实施例4
与实施例l不同之处在于
保存的方法首先将制备好的食用菌液体菌种以8000r/min， 离心时间为5min收集菌丝球，然后将菌丝球用清洗缓冲液冲洗1次， 冲洗后再经8000r/min，离心时间为5 min收集菌丝球，把菌丝球 悬浮于静息培养基中培养24小时，而后将静息培养后的菌液冷藏温度为8'C,时间为1-3个月。其冷藏保存；其中，所述静息培养基的成 分为葡萄糖0. 8%,氯化钠0. 2%,硝酸铵1%,氯化钾0. 05%,硫酸镁 0. 5%,硫酸亚铁0. 005%，余量为水，调整PH值至7. 0-7. 7;所述清洗 缓冲液为灭菌生理盐水。所述清洗菌丝球时的清洗缓冲液为菌液体积 的6倍；静息培养基为菌体体积的3倍。 实施例5
与实施例1不同之处在于
保存的方法首先将制备好的食用菌液体菌种以过滤收集菌丝 球，然后将菌丝球用清洗缓冲液冲洗l次，冲洗后再经过滤收集菌丝 球，把菌丝球悬浮于静息培养基中培养IO小时，而后将静息培养后 的菌液冷藏温度为2t;,时间为3-5个月。其冷藏保存；其中，所述静 息培养基的成分为葡萄糖0. 7%，氯化钠O. 3%，硝酸铵0.55%，氯化 钾O. 12%，硫酸镁O. 25%，硫酸亚铁0.008%,余量为水，调整PH值至 7.0-7.7;所述清洗缓冲液为灭菌生理盐水。所述清洗菌丝球时的清 洗缓冲液为菌液体积的5倍；静息培养基为菌体体积的1倍。过滤釆 用灭菌纱布或灭菌尼龙网或灭菌滤纸直接过滤或抽滤。
权利要求
1.一种食用菌液体菌种静息化保存方法，其特征在于首先将制备好的食用菌液体菌种离心或过滤收集菌丝球，然后将菌丝球用清洗缓冲液冲洗1-4次，冲洗后再经离心或过滤收集菌丝球，把菌丝球悬浮于静息培养基中培养6-24小时，而后将其冷藏保存；其中，所述静息培养基的成分为葡萄糖0.5％-1％，氯化钠0.2％-0.5％，硝酸铵0.05-1％，氯化钾0.05-0.15％，硫酸镁0.01％-0.5％，硫酸亚铁0.005％-0.01％，余量为水，调整PH值至6.5-7.7；所述清洗缓冲液为灭菌磷酸盐缓冲液、灭菌硼酸盐缓冲液或灭菌生理盐水。
2. 按照权利要求1所述的食用菌液体菌种静息化保存方法，其特 征在于离心收集菌丝球时离心机转速为3000r/min—8000r/min, 离心时间为5-30 min。
3. 按照权利要求1所述的食用菌液体菌种静息化保存方法，其特 征在于所述清洗菌丝球时的清洗缓冲液为菌液体积的2-6倍；静息 培养基为菌体体积的1-3倍。
4. 按照权利要求1所述的食用菌液体菌种静息化保存方法，其特 征在于:所述静息培养后的菌液冷藏温度为1-l(TC,时间为1-6个月。
5. 按照权利要求1所述的食用菌液体菌种静息化保存方法，其特 征在于过滤收集菌丝球釆用灭菌纱布或灭菌尼龙网或灭菌滤纸直接 过滤或抽滤。
6. 按照权利要求1所述的食用菌液体菌种静息化保存方法，其特 征在于所述灭菌磷酸盐缓冲液PH为6.5-8. 5,灭菌硼酸盐缓冲液 PH为6. 5-8. 5。
全文摘要
本发明属于食用菌液体菌种应用技术领域，具体涉及一种食用菌液体菌种静息化保存方法。具体为首先将制备好的食用菌液体菌种离心或过滤收集菌丝球，然后将菌丝球用清洗缓冲液冲洗1-4次，冲洗后再经离心或过滤收集菌丝球，把菌丝球悬浮于静息培养基中培养6-24小时，而后将其冷藏保存。采用本发明的保存方法，菌丝球中的菌种细胞保持静息化状态，只进行微弱的内源代谢，菌种细胞也不分裂，菌种可保持持久的活力，这样就使一次发酵制备的食用菌液体菌种能够长时间保存，改善了食用菌液体菌种的储藏条件，提高了食用菌液体菌种的利用水平。
文档编号C12N1/14GK101550399SQ20081001088
公开日2009年10月7日 申请日期2008年4月2日 优先权日2008年4月2日
发明者张惠文, 张晓黎, 苏振成, 蔡颖慧, 阮晓东 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所