专利名称：：一种抗肿瘤类抗生素及其制备方法
技术领域：
：本发明属于医药
技术领域：
，涉及一种抗肿瘤类抗生素及其制备方法，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的抗生素和其药学上可接受的盐；本发明也涉及这一化合物的微生物发酵方法和其在制造抗肿瘤药物上的用途。肿瘤严重威胁着人类的生命健康，世界各国都投入大量人力物力开发新的高效抗肿瘤药。化学治疗在肿瘤治疗中起着不可替代的作用。现已经知道有许多经培养不同种微生物所产生的抗生素类物质可表现有抗肿瘤活性。迄今为止，已广泛使用了某些已知的抗肿瘤在临床实践中为治疗肿瘤提供了一种重要的治疗手段。然而，临床上使用的许多已知的抗肿瘤抗生素物质都对人体有明显的毒性，从而在应用上受到很大限制。在这个意义上说，临床上所使用的所有已知抗肿瘤抗生素均不一定是令人完全满意的抗肿瘤药物。因此，目前仍急需找到并提供既对人体毒性低，又有高抗肿瘤活性，而且可有效而安全地用于治疗人体肿瘤或癌症的新的物质。
发明内容本发明的一个目的在于提供一种用于治疗肿瘤疾病的新的抗肿瘤类抗生素3-取代-2-吲哚酮类化合物，其分子结构式为C15H12N02，分子量238,化学结构式如式(I)所示。熔点185.0-186.9°C,外观呈橙黄色粉末，它在药学上可接受的盐是盐酸盐、硫酸盐或者有机盐。本发明抗生素的结构釆用核磁共振、红外、紫外等光谱学的方法确定。本发明的另一个目的是提供这种抗肿瘤抗生素的发酵用菌种和制备方法。°经初步测试，该化合物体外能有效抑制多种肿瘤细胞的生长，其IC5。在3-27ng/mL范围内，具有显著的抗肿瘤活性。式i本发明的吲哚酮类化合物是从山西省芮城县古魏乡土壤中分离得到链霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的发酵培养物中提取得到，所用的链霉菌Y05A-1065已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.:2363，保藏曰为2008年2月19曰。制备方法的具体步骤如下(1)链霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的斜面菌株培养斜面培养基按重量比为葡萄糖0.5-1.5,酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2,L跳'3H200.01-0.3,MgS04'7H200.Ol-O.1,蒸馏水100，制成斜面培养基，挑取菌种接入斜面培养基，28-30°C恒温静止培养7-9天；(2)链霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)种子液的制备种子培养基按重量比为葡萄糖0.5-1.5，酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2,NaCl0.01-0.05,5K2HP043H200.01—0.3,MgS047H200.01-0.1,水100,制成种子培养液，挑取斜面菌种接入，28-30°C恒温，220r/min震荡培养24-36小时；(3)链霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的发酵液的制备发酵培养基按重量比为玉米淀粉2.0-10.0，黄豆饼粉0.5-3.5，花生饼粉0.05-1.0，酵母粉0.01-0.5，玉米浆0.01-0.2,CoCl2.H200.01-0.03，pH6.8，水IOO,28°C220r/min摇床振摇培养120-168小时；(4)将上述培养好的发酵液过滤，收集菌体，晾干；菌体在室温下用甲醇浸泡，合并提取液，浓缩得到总提取物；用水重新溶解；(5)将上述去除菌体的培养液过分子量为10000的超滤膜，以进一步去除可溶性大分子物质；(6)收集超滤膜过滤后的滤液，加热浓缩(温度不超过5(TC)至原体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯以等体积比加入到浓缩液中，萃取三次，合并萃取相，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以CHClfMeOH为洗脱剂进行梯度洗脱；(7)发酵液经过硅胶柱层析后，收集20-60。/。的CHCl3-MeOH洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，干燥，即得到橙黄色粉末。经本发明所制备的化合物能有效抑制多种肿瘤细胞的生长，具有显著的抗肿瘤活性。本发明所用的链霉菌Y05A-1065已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.:2363,保藏日为2008年2月19日。具体实施例方式实施例1化合物(I)的制备1.链霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的斜面菌株培养斜面培养基按重量比为葡萄糖0.5-1.5，酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，K2HP04.3H200.01-0.3,MgS047H200.01-0.1,蒸馏水100,制成斜面培养基，挑取菌种接入斜面培养基，28-30°C恒温静止培养7-9天；2.链霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)种子液的制备种子培养基按重量比为葡萄糖0.5-1.5，酵母粉O.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，NaCl0.01—0.05,5K2HP043H200.01-0.3,MgS047H200.01-0.1，水100,制成种子培养液，挑取斜面菌种接入，28-30°C恒温，220r/min震荡培养24-36小时；3.链霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的发酵液的制备发酵培养基按重量比为玉米淀粉2.0-10.0,黄豆饼粉0.5-3.5，花生饼粉0.05—1.0，酵母粉0.01-0.5，玉米浆0.01-0.2,CoCl2.H200.01-0.03,pH6.8,水IOO,28°C220r/min摇床振摇培养120-168小时；4.将上述培养好的发酵液过滤，收集菌体，晾干；菌体在室温下用甲醇浸泡，合并提取液，浓缩得到总提取物；用水重新溶解；5.将上述去除菌体的培养液过分子量为10000的超滤膜，以进一步去除可溶性大分子物质；6.收集超滤膜过滤后的滤液，加热浓缩(温度不超过5(TC)至原体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯以等体积比加入到浓缩液中，萃取三次，合并萃取相，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以CHC13-MeOH为洗脱剂进行梯度洗脱；7.发酵液经过硅胶柱层析后，收集20-60y。的CHCl3-MeOH洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，干燥，即得到橙黄色粉末(I)。化合物U)的实验数据外观为橙黄色粉末，m.p.185-186.9。微溶于水、苯、氯仿、乙醚等溶剂，溶于乙醇、甲醇。FAB-MS:239(M+1)。最大紫外吸收波长262.8nm(1.171),355.6nm(1.144)。IRu/cm,KBr):3548(u。-H)，3356(uM)，3185(uC_H)，3144(uc-H)，3066(uc—H)，1699(uc,。)，1640(uc-c)。13CNMR(CDC13):170.2(C-2)，156.1(C—1，)，141.7(C-9),133.7(C-3)，131.7(C-10)。实施例2MTT还原法检测化合物(I)的抗肿瘤活性1.材料1.1四脞盐(MTT):用0.OIM的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(3-(4，5-dimethythiazo1-z-yl)2，5-diphenyltetrazoliumbromide,SIGMA)终浓度5mg/mL,过滤除菌，分装后4°C避光保存。1.2靶细胞的制备(以A549细胞为例)从液氮罐中取出人肺癌细胞株A549细胞的冻存管，迅速置入37°C水浴中，不停摇动使之迅速溶化，无菌搡作移入离心管中；加入全培养液(含10Vj、牛血清的RPMI1640(Gibco1BRL公司))至10mL,1000rpm离心5s,弃上清；重复以上操作一次；以全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5%C02，37°C培养；观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。取对数生长期细胞，胰酶消化，调整细胞数至lxl07mL;将细胞悬液加入到96孔板中，各孔加入A549细胞100|uL(lxl05/mL)，5%C02，37。C培养8hr。加入不同浓度B6-9(使用全培养液配制)溶液IOOjaL,对照加全培养液100yL，继续培养48hr。每孔加入MTT溶液各10|uL,继续培养4hr。去除培养液，每孔加入DMS0100卩L,轻轻振荡5-10min，使颗粒溶解。使用酶联免疫仪测定570mn下每孔OD值。计算肿瘤细胞杀伤率和抑制率，以抑制率对药物浓度的对数作图，求得ICs。。肺癌细胞株A549，肝癌细胞株HepG-2,胃癌细胞株HGC-27，乳癌细胞株MCF-7的试验方法同上。肿瘤细胞杀伤率％=[(对照组测定的平均OD值-加药组测定的平均0D值)/对照组测定的平均0D值]xlO(W13实验结果实验rf果i示化合物(I)均能有效抑制肺癌细胞株A549,肝癌细胞株HepG-2，胃癌细胞株HGC-27，乳癌细胞株MCF-7的生长。其对这些癌细胞的ICs。值(ng/mL)见表l。表1B6-9的体外细胞毒试验结果(IC50jug/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例3链霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的培养特征形态特征孢子丝1-3圈螺旋形。孢子椭圆形。性状特征高氏合成1号琼脂气丝青绿色，有次生白色丛。基丝无色。无可溶色素。淀粉琼脂气丝青绿色。基丝无色。无可溶色素。纤维素气丝绿色。基丝好，黄色。无可溶色素。权利要求1、一种抗肿瘤类抗生素，其特征在于该化合物的结构式如下所示。2、按照权利要求l所述的一种抗肿瘤类抗生素，其特征在于还包括该抗生素在药学上可接受的盐。3、按照权利要求2所述的一种抗肿瘤类抗生素，其特征在于所述的药学上可接受的盐为其盐酸盐、硫酸盐或者有机盐。4、按照权利要求2或3所述的一种抗肿瘤类抗生素，其特征在于所述的药学上可接受的盐是盐酸盐或者硫酸盐。5、一种如权利要求1所述的一种抗肿瘤类抗生素的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)链霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的斜面菌株培养斜面培养基按重量比为葡萄糖0.5-1.5，酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，K2HP043H200.01-0.3,MgS047H200.01-0.1,蒸馏水100，制成斜面培养基，挑取菌种接入斜面培养基，28-3(TC恒温静止培养7-9天；(2)链霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)种子液的制备种子培养基按重量比为葡萄糖0.5-1.5,酵母粉0.05-0.5，蛋白胨0.05-0.2，NaCl0.Ol-O.05，5K2HP043H200.01—0.3,MgS047H200.01-0.1,水100，制成种子培养液，挑取斜面菌种接入，28-30"恒温，220r/min震荡培养24-36小时；(3)链霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.:2363)的发酵液的制备发酵培养基按重量比为玉米淀粉2.0-10.0，黄豆饼粉0.5-3.5，花生饼粉0.05-1.0，酵母粉0.01-0.5，玉米浆0.01-0.2，CoCl2H200.01-0.03,pH6.8,水IOO，28'C220r/min摇床振摇培养120-168小时；(4)将上述培养好的发酵液过滤，收集菌体，晾干；菌体在室温下用甲醇浸泡，合并提取液，浓缩得到总提取物；用水重新溶解；(5)将上述去除菌体的培养液过分子量为10000的超滤膜，以进一步去除可溶性大分子物质；(6)收集超滤膜过滤后的滤液，在温度不超过5(TC条件下加热浓缩至原体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯以等体积比加入到浓缩液中，萃取三次，合并萃取相，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以CHCl「MeOH为洗脱剂进行梯度洗脱；(7)发酵液经过硅胶柱层析后，收集20-60y。的CHCl3-MeOH洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，干燥，得到橙黄色粉末。6、抗肿瘤类抗生素或者其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明属于医药
技术领域：
，提供一种抗肿瘤类抗生素及其制备方法，其结构式如右。该物质可通过培养链霉菌Y05A-1065(CGMCCNo.2363)的发酵液中获得。其主要通过链霉菌Y05A-1065的斜面菌株培养、链霉菌Y05A-1065种子液的制备、链霉菌Y05A-1065发酵液的制备、菌体浓缩得到总提取物、去除菌体的培养液过超滤膜、乙酸乙酯萃取后硅胶柱中进行色谱分离、聚酰胺柱层析分离获得。该方法简单可行，重现性好。该物质具有显著的抗肿瘤活性，该物质和其药学上可接受的盐可与药学上可接受的载体结合制成抗肿瘤类药物。文档编号C12P17/10GK101538239SQ200810010679公开日2009年9月23日申请日期2008年3月17日优先权日2008年3月17日发明者吴春福,张怡轩申请人:沈阳药科大学