专利名称：P基因的干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用的制作方法
技术领域：
本发明是关于P基因的干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用，更确切地 说，本发明涉及P基因的干扰靶位点序列，用于抑制P基因表达的小核酸，以及含有该小干 扰核酸的化妆品组合物和该小干扰核酸在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素 的化妆品组合物中的应用。
背景技术：
黑色素(melanin)是由黑素细胞合成的一种生物多聚体，由皮肤、毛囊、虹膜和视 网膜的黑色素细胞产生，分为黑棕色的真黑素和红黄色的褐黑素。动物与人的皮肤和毛发 颜色与黑素体的数目、大小和分布等都有直接的关系。过量的黑色素会使皮肤变黑，而非均 勻分布的黑色素会导致黄褐斑和祛斑的产生。随着生活水平和生活质量的提高，人们对美的关注也日益增强，美白、去斑就是其 中很重要的一项内容。因此，开发一种能够抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的产品称 为迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的第一个目的是提供P基因的干扰靶位点序列。本发明的第二个目的是提供一种用于抑制P基因表达的小干扰核酸。本发明的第三个目的是提供一种含有所述小干扰核酸的化妆品组合物。本发明的第四个目的是提供所述小干扰核酸在制备用于抑制黑色素生成和沉积 或祛除黑色素的化妆品组合物中的应用。RNA干扰技术的出现为抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素提供了一种新的途 径。RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)分子 在mRNA水平关闭相应基因的表达或使该基因沉默的过程。RNA干扰技术又被形象地称为基 因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一种典型的转录后基因调控方法， 又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。最早有关RNA干扰 的报道出现在1990年，由两个不同的研究小组同时报道了转基因植物中的RNA干扰现象， 以后又在线虫、果蝇、斑马鱼和小鼠等几乎所有真核生物中观察到了 RNA干扰现象。1999 年，Hamilton和Baulcombe在发生RNA干扰的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸的 RNA片段，这些RNA片断被证明是RNA干扰所必需的，称为小分子干扰RNA (小干扰核酸)。 双链小干扰核酸与细胞源性的相关酶和蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)。在RNA干扰过程中，双链小干扰核酸中的正义链被排除出复合 体，反义链指导RISC结合到靶mRNA的相应位点，然后由复合物中的核糖核酸酶III降解靶 mRNA,从而关闭靶基因的表达。本发明人对黑色素的合成以及沉积进行了细致的研究，发现黑色素是由多个基因 相互协调并经过一系列复杂的生理生化过程合成，这些与色素沉着相关的基因参与黑色素
4的合成、运输和分布。在与黑色素生成有关的一系列基因中，P基因是其中很重要的一个基 因。P基因也叫0CA2基因，负责合成P蛋白。P蛋白是IlOkDa的跨膜蛋白，由838个 氨基酸残基构成，含有12个跨膜区，6个糖基化位点，位于黑色素小体膜上，与黑色素小体 膜的完整性有关，是产生黑素小体所必需的蛋白。另有研究结果表明，P基因编码的蛋白与 一些参与阴离子转运的膜转运蛋白具有显著同源性，它作为一种膜通道蛋白可减少黑素小 体内质子的浓度，参与黑色素小体内PH值的调节，使局部环境呈中性，这有利于维护高分 子酪氨酸-TYRP1-TYRP2复合体的稳定性，增强酪氨酸酶活性，增加黑色素的生成及沉积。此外，P基因的变异会导致黑素细胞数量的减少以及黑素细胞中黑色素合成的降 低，P基因的编码产物为真黑素合成所必需，因此，通过RNA干扰而专一性地抑制P基因的 表达，从而沉默P基因的活性，是抑制黑色素合成、改善肤色的有效途径。本发明提供了 P基因的干扰靶位点序列，其中，该靶序列具有如SEQ IDNos :2_16 中之一所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种小干扰核酸，其中，该小干扰核酸包括能够在严格条件下与 所述干扰靶位点序列进行杂交的核苷酸序列。本发明还提供了一种用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物， 其中，该化妆品组合物含有所述小干扰核酸作为活性成分。本发明还提供了所述小干扰核酸在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色 素的化妆品组合物中的应用。本发明提供的小干扰核酸对P基因表达的抑制活性高，能够有效地抑制黑色素生 成和沉积。例如，本发明提供的小干扰核酸PGENE-I至PGENE-30能够高效的抑制P基因的 表达，这说明本发明提供的小干扰核酸用于抑制P基因的表达时，对P基因表达的抑制活性较高。
具体实施例方式本发明提供了 P基因的干扰靶位点序列，其中，该靶序列具有如SEQ IDNos :2_16 中之一所示的核苷酸序列。优选情况下，所述靶序列具有如SEQID No :3、SEQ ID No :4、SEQ ID No :7、SEQ ID No 10 或 SEQ ID No 12 所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种小干扰核酸，其中，该小干扰核酸能够通过作用于权利要求1 所述的靶位点序列而抑制P基因的表达，该小干扰核酸的GC含量为35-60%。所述P基因包括24个外显子和23个内含子。第1外显子编码P基因mRNA的5’ 端非翻译序列，翻译的起始位点位于第2外显子。P基因编码一种IlOkDa的跨膜蛋白，该蛋 白为真黑素合成所必需，由838个氨基酸残基构成，含有12个跨膜区，6个糖基化位点，位于 黑色素小体膜上，与黑色素小体膜的完整性有关。本发明所述小干扰核酸为包括正义链和反义链的双链分子，所述正义链和反义链 的长度分别为15-27个核苷酸；优选情况下，所述正义链和反义链的长度分别为19-21个核苷酸。在本发明此方面的优选实施方式中，所述小干扰核酸具有PGENE-1、PGENE_2、 PGENE-3、PGENE-4、PGENE-5、PGENE-6、PGENE-7、PGENE-8、PGENE-9、PGENE-10, PGENE-IUPGENE-12、PGENE-13、PGENE-14 或 PGENE-15 所示的核苷酸序列，或者具有对 PGENE-1、 PGENE-2、PGENE-3、PGENE-4、PGENE-5、PGENE-6、PGENE-7、PGENE-8、PGENE-9、PGENE-10、 PGENE-11、PGENE-12、PGENE-13, PGENE-14或PGENE-15所示的核苷酸序列进行化学修饰所 得到的核苷酸序列，其中，
PGENE-I 正义链5
反义链 PGENE-2 正义链 反义链 PGENE-3 正义链 反义链 PGENE-4 正义链 反义链 PGENE-5 正义链 反义链 PGENE-6 正义链 反义链 PGENE-7 正义链 反义链 PGENE-8 正义链 反义链 PGENE-9 正义链 反义链 PGENE-10正义链 反义链 PGENE-Il正义链 反义链 PGENE-12正义链 反义链 PGENE-13正义链 反义链 PGENE-14正义链 反义链 PGENE-15正义链
，-GCCAGGA⑶UUGCUUCAUUdTdT-3’ ’ -AAUGAAGCAAACUCCUGGCdTdT-3’ ； ’ -GGAG⑶CUCACUCUUCUUUdTdT-3’ ’ -AAAGAAGA⑶GAGACCUCCdTdT-3’ ； ’ -CCUUAUCACCGCUGGAGAAdTdT-3’ ’ -UUCUCCAGCG⑶GAUAAGGdTdT-3’ ； ’ -GCCU⑶GACCAUAAG⑶UGdTdT-3’ ’ -CAACCUUAUG⑶CACAGGCdTdT-3’ ； ’ -GCAGAA⑶GAUCUUCACAAdTdT-3’ ’ -UU⑶GAAGAUCACUUCUGCdTdT-3’ ； ’ -CCGGAUUCACUGCACACAUdTdT-3’ ’ -AUGUGUGCA⑶GAAUCCGGdTdT-3’ ； ’ -GGAGACCAAUAUCCAAGAAdTdT-3’ ’ -UUCUUGGAUAUUG⑶CUCCdTdT-3’ ； ’ -CCCUGGCAUUCAUCUUGAUdTdT-3’ ’ -AUCAAGAUGAAUGCCAGGGdTdT-3’ ； ’ -G⑶GCCAUCUGGUUGCUAAdTdT-3’ ’ -UUAGCAACCAGAUGGCACCdTdT-3’ ； ’ -GGGCUUCCCAAUGAUGGUUdTdT-3’ ’ -AACCAUCAUUGGGAAGCCCdTdT-3’ ； ’ -GGUU⑶⑶CCUGCACUGUUdTdT-3’ ’ -AACAGUGCAGGACACAACCdTdT-3’ ； ’ -GCACUGUUGGGAU⑶⑶UAdTdT-3’ ’ -UAACACAUCCCAACA⑶GCdTdT-3’ ； ’ -GCUUACCCUGGAGAUGCUAdTdT-3’ ’ -UAGCAUCUCCAGGGUAAGCdTdT-3’ ； ’ -GGAAUAGACCUUGACACUAdTdT-3’ ’ -UA⑶⑶CAAGGUCUAUUCCdTdT-3’ ； ’ -UCAAUUCUCCUGAGGCUAAdTdT-3’ ’ -UUAGCCUCAGGAGAAUUGAdTdT-3’。
小干扰核酸具有 PGENE-2、PGENE-3、PGENE-6、PGENE-9 或
PGENE-Il所示的核苷酸序列。根据本发明，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种(1)对所述小干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；(2)对所述小干扰核酸的核苷酸序列中核糖的2’ -OH的修饰；
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(3)对所述小干扰核酸的核苷酸序列中碱基的修饰。所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯 键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式1所示；和硼烷化磷酸盐修饰，如式2所示。两 种修饰都能稳定小干扰核酸结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。 所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’ -OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某 些取代基，例如，2’ -氟代修饰，如式3所示；2’ -氧甲基修饰，如式4所示；2’ -氧亚乙基 甲氧基修饰，如式5所示；2，4’_ 二硝基苯酚修饰，如式6所示；锁核酸(LNA)，如式7所示； 2’ _氨基修饰，如式8所示；2’ -脱氧修饰，如式9所示。
(7)(8)(9)所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，5' _溴尿嘧啶修饰，如式10 所示；5'-碘尿嘧啶修饰，如式11所示；N-甲基脲嘧啶修饰，如式12所示；2，6_ 二氨基嘌 呤修饰，如式13所示。 优选情况下，所述修饰使修饰后的小干扰核酸在细胞内抵抗核酸酶水解的能力增强。此外，为了促进小干扰核酸进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在小干扰核酸正 义链的末端引入胆固醇等亲脂性的基团以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜与细胞 内的mRNA发生作用。本发明提供的小干扰核酸的制备方法包括小干扰核酸序列的设计和小干扰核酸 的制备。所述小干扰核酸序列的设计是指在P基因cDNA序列(Genbank登记号为 NM-000275)的l-3136bp的范围内选取19bp长度的核苷酸序列。19bp核苷酸序列的选取主 要参考以下几项原则=(I)GC含量在35-55%之间，(2)避免处于重复序列或低复杂性序列 区域内，(3)避免出现4个以上的连续碱基序列，(4)避免含有单核苷酸多态性位点，(5)避 免处于读码框起始密码和终止密码的50-100bp区域之内，除此之外，还要分析核苷酸序列 的组成和热力学性质。通过BLAST分析，将候选小干扰核酸靶位点同人类基因序列进行同 源性比对，排除同其它基因有很大的序列同源性(16个以上碱基)的序列，以确保候选小干 扰核酸靶位点不会对其他非相关基因发生抑制作用，而仅对P基因具有特异的抑制作用。最后将这样获得的19bp核苷酸序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为 小干扰核酸序列的正义链，在此19bp核苷酸序列的互补序列3’末端加上两个脱氧胸腺嘧
9啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链。根据本发明，所述小干扰核酸的制备方法为本领域技术人员所公知，例如，所述小 干扰核酸可以通过化学合成得到，或者通过质粒和/或病毒载体的表达而得到。所述小干扰核酸序列的合成可以采用化学合成的方法，或者委托专门从事核酸合 成的生物技术公司合成，如委托上海GenePharma公司进行合成。一般来说，所述化学合成的方法包括以下四个过程(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐。例如，具有PGENE-I所示核苷酸序列的小干扰核酸化学合成的具体步骤如下(1)寡聚核糖核苷酸的合成寡聚核糖核苷酸的合成是在自动DNA/RNA合成仪 (例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上进行，根据PGENE-I所示的核苷酸序列(正 义链5，-GCCAGGA⑶UUGCUUCAUUdTdT-3，，反义链5，-AAUGAAGCAAACUCCUGGCdTdT-3，)的顺 序将对应的核苷酸逐个连接起来。由于小干扰核酸是由一段19个寡聚核糖核苷酸和2个 脱氧胸苷酸组成。因此，起始物为固相连接的5’-0_对二甲氧基-胸苷，具体的每一个循环 合成可分为四步来完成，第一步是将与固定连接的胸苷上5’位的保护基在三氯乙酸的作用 下洗脱；第二步在活性催化剂S-乙基四唑的作用下，将5’ -0-对二甲氧基三苯甲基_胸苷 亚磷酰胺偶联至已脱去保护的上一个胸苷上，形成二胸苷亚磷酸三酯，偶合时间偶合次数 均按仪器厂家提供的程序来完成；第三步是将偶合的二胸苷亚磷酸三酯在0. 05M碘水作用 下，氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙酰化，将固相上的少量未反应的活性基团(例如， 羟基和胺基)在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺，从而达到封闭的作用，以减少整体副产物 的产生，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。(2)脱保护将合成好的固相小干扰核酸放入至一个可以密封的小瓶中，并加入1毫升的乙醇 /胺(体积比为1 3)，然后密封，置于55-70°C温箱中，孵育2-30小时，取出溶液，并将固 相再次用双蒸水淋洗，收集洗脱液，并干燥去除溶剂。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四 氢呋喃溶液(IM)，室温放置4-12小时，再经过乙醇沉淀，得到小干扰核酸的粗产物。(3)纯化分离将小干扰核酸的粗产物溶解于2毫升的乙酸铵水溶液中，然后经过反应C18高压 液相色谱的分离，运用梯度淋洗的方法，收集小干扰核酸主产物(淋洗液A :0. IM乙酸铵； 淋洗液B :20%的0. IM乙酸铵和80%的乙腈)，除去主产物中的溶剂，并加入5毫升80% 的乙酸水溶液，在室温静置15分钟，然后将此溶液进行阴离子交换的分离(DEAE-5PW，阴 离子交换柱)，即可得到纯度在90 %以上的小干扰核酸(梯度淋洗，淋洗液A 0. 025M的 Tris-HCl, 0. 025M 的 NaCl，pH = 8，5% 的乙腈；淋洗液B 0. 025M 的 Tris-HCl，2. OM 的 NaCl， PH = 8，5%的乙腈)。(4)脱盐纯化的小干扰核酸经过透析，除去盐份，随后将小干扰核酸溶液进行过滤消毒和 干燥结晶。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸经过退火处理形成稳定的双链小干扰核 酸，其方法是将正义链和反义链的寡聚核糖核苷酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(IOmM Tris,pH = 7. 5-8. 0,50mM NaCl)，将此溶液加热至95°C，然后缓缓将此溶液冷却至室温，最 后将此溶液存放在4°C冰箱中保存，以备随时使用。
除化学合成外，小干扰核酸还可通过质粒和/或病毒载体的表达而得到，得到具 有发夹结构的shRNA，其长度为50-90个核苷酸。shRNA的结构为5，-GATCCG-正义链 GAAGCTTG-反义链 TTTTTTGGAATT-3，两端为酶切位点(例如BamHI和EcoRI)，中间为一段loop序列(例如GAAGCTTG)， 通过克隆技术将其插入到用相应内切酶酶切过的载体中，再整合到染色体中，即可稳定表 达小干扰核酸。根据本发明提供的用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物，该 化妆品组合物含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分。根据本发明，所述化妆品组合物还含有载体。本发明中，所述小干扰核酸与载体的含量可以在很大范围内变动，优选情况下，相 对于100重量份的小干扰核酸，所述载体的含量为1000-10000000重量份；进一步优选为， 相对于100重量份的小干扰核酸，所述载体的含量为2000-100000重量份。本发明中，对所述载体没有特别的限制，可以是任何用于化妆品组合物的载体，例 如可以为动植物油、烃油、酯、高级脂肪酸和高级脂肪醇中的一种或几种；例如，所述动植物 油可以为貂油、鳖油、大豆油、芝麻油、玉米油、油菜籽油、棉籽油、橄榄油和蓖麻油中的一种 或几种；所述烃油可以为石蜡油、异三十六烷和凡士林中的一种或几种；所述酯可以为棕 榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸己酯、异壬酸异壬酯、2-乙基己基棕榈酸酯、2-己基癸基 月桂酸酯和2-辛基十二烷基肉豆蔻酸酯中的一种或几种；所述高级脂肪酸可以为棕榈酸、 硬脂酸、亚油酸和亚麻酸中的一种或几种；高级脂肪醇可以为鲸蜡醇和/或十八烷醇。根据本发明，所述化妆品组合物还含有其它用于化妆品组合物的成分。本发明中，所述小干扰核酸与其它用于化妆品组合物的成分的含量可以在很大范 围内变动，优选情况下，相对于100重量份的小干扰核酸，所述其它用于化妆品组合物的成 分的含量为1000-10000000重量份；进一步优选为，相对于100重量份的小干扰核酸，所述 其它用于化妆品组合物的成分的含量为2000-100000重量份。本发明中，对所述其它用于化妆品组合物的成分没有特别的限制，例如，可以为保 湿剂、着色剂、防腐剂、增稠剂、抗氧化剂、表面活性剂和佐剂中的一种或几种。本发明中，对所述保湿剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的保湿 剂，例如，所述保湿剂可以为丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇、山梨醇、己二醇、1， 3- 丁二醇和甘油中的一种或几种。本发明中，对所述着色剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的着色 剂，例如，所述着色剂可以为胭脂红、滑石、云母、碳酸镁、碳酸钙、硅酸镁、二氧化硅、氧化锌 和群青中的一种或几种。本发明中，对所述增稠剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的增稠 剂，例如，所述增稠剂可以为蜂蜡、小烛树蜡、鲸蜡、微晶蜡、淀粉、黄原胶、阿拉伯胶、瓜尔 胶、果胶和膨润土中的一种或几种。本发明中，对所述防腐剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的防腐 剂，例如，所述防腐剂可以为苯甲酸、水杨酸、羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯和间苯二酚中 的一种或几种。本发明中，对所述抗氧化剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的抗氧化剂，例如，所述抗氧化剂可以为抗坏血酸、维生素Α、β-胡萝卜素、维生素B、半胱氨酸、 谷胱甘肽、过氧化氢酶、柠檬酸和二茶酚中的一种或几种。本发明中，对所述表面活性剂没有特别的限制，可以为各种用于化妆品组合物的 表面活性剂，例如，所述表面活性剂可以为脂肪酸甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、烷基苯磺 酸钠、磺基琥珀酸二烷基酯、N-酰基谷氨酸和聚氧乙烯烷基硫酸钠中的一种或几种。所述佐剂的种类没有特别的限制，可以为各种能够用于化妆品组合物的佐剂，例 如，所述佐剂可以为维生素Β3、海藻提取物、氮酮、海藻糖、双咪唑烷基脲和透明质酸中的一 种或几种。所述化妆品组合物可以为各种常规的化妆品组合物的形式，例如，可以为乳剂、膏 剂、液剂、气雾剂或粉剂。所述化妆品组合物为外用剂，可以用于身体各个部位的皮肤，例如 脸部、颈部、手臂、躯干(胸部、腹部和背部)、腿部、手部和脚部。本发明还提供了所述小干扰核酸在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色 素的化妆品组合物中的应用。本发明提供的P基因的干扰靶位点、小干扰核酸、化妆品组合物和应用可以用于 防止、改善、和祛除皮肤的色素沉淀，以达到防止、改善、和祛除不理想或不健康的皮肤以及 美白皮肤的目的。并且，本发明的小干扰核酸能够特异、高效、稳定地特异抑制P蛋白的表 达，本发明提供的小干扰核酸能够广泛地用于制备各种用于防止、改善、和祛除皮肤的色素 沉淀相关的药品或化妆品。并且本发明提供的小干扰核酸、化妆品组合物等可以直接涂抹 或转载到作用部位。下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基 均为市售商品。实施例1小干扰核酸的合成在P基因的cDNA序列(Genbank登记号为NM-000275)的l_3136bp的范围内选 取19bp长度的核苷酸序列。19bp核苷酸序列的选取主要参考以下几项原则(I)GC含量在 35-55%之间，(2)避免处于重复序列或低复杂性序列区域内，(3)避免出现4个以上的连续 碱基序列，(4)避免含有单核苷酸多态性位点，(5)避免处于读码框起始密码和终止密码的 50-100bp区域之内，除此之外，还要分析核苷酸序列的组成和热力学性质。通过BLAST分 析，将候选小干扰核酸靶位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同其它基因有很大的 序列同源性(16个以上碱基)的序列，以确保候选小干扰核酸靶位点不会对其他非相关基 因发生抑制作用，而仅对P基因具有特异的抑制作用。最后将这样获得的19bp核苷酸序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为 小干扰核酸序列的正义链，在此19bp核苷酸序列的互补序列3’末端加上两个脱氧胸腺嘧 啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链。设计好的小干扰核酸经上海吉玛(GenePharma)公司进行化学合成，得到小于扰 核酸PGENE-I至PGENE-15，所述小干扰核酸PGENE-I至PGENE-15的核苷酸序列如表1所不。表1 所述攻击范围是指该小干扰核酸在序列表第1号序列中的相对应位置。实施例2P基因表达的抑制活性检测(1)黑素细胞的培养用含有10%胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素的MEM 完全培养基，在六孔细胞培养板上以5 X IO6个细胞/孔的密度接种SK-MEL-3黑色素肿瘤 细胞(北京百星高科技术开发有限公司)，在温度为37°C及CO2含量为5%的培养箱中进行 培养，每48小时传代、更换新鲜培养基。2)小干扰核酸的转染使用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000脂质体对实施例1得到 的小干扰核酸PGENE-I至PGENE-15分别进行转染，以无关小干扰核酸(正义链 5-UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶TT-3 ；反义链5_AC⑶GACACGUUCGGAGAATT-3)作为阴性对照。具体 操作步骤如下将小干扰核酸溶解于无RNA酶的无菌水中，配制成浓度为20ymol/L的溶 液。将SK-MEL-3黑色素瘤细胞接种至24孔板中，用OptiMEM I低血清培养基(Invitrogen 公司，31985-062)稀释成浓度为8 X IO5个细胞/ml，每孔500 μ 1。分别将1. 5 μ 1小干扰核酸 (20ymol/L)稀释于50μ 1 Opti-MEM I 低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)中，将
131 μ 1 Lipofectamine 2000 脂质体稀释于 50 μ 1 Opti-MEM I 低血清培养基(Invitrogen 公司，31985-062)中，然后将上述两种溶液在室温下孵育5分钟后混合，混合溶液于室温静 置20分钟后，把100 μ 1该混合溶液加到接种有细胞的所述24孔板中。小干扰核酸的最终 浓度是50ηΜ。细胞37°C培养4小时，再加入Iml含10%胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ ml青霉素、100μ g/ml链霉素的MEM完全培养基，然后在37°C下再培养24小时。(3)抑制活性检测通过RT-PCR分别检测转染了小干扰核酸PGENE-I至PGENE-15的SK-MEL-3黑色 素瘤细胞中P基因mRNA的表达量，具体步骤为用1ml TRIzol (GIBC0L公司)裂解转染小干扰核酸的SK-MEL-3黑色素瘤细胞，并 提取总RNA，提取总RNA的具体步骤为将转染后的细胞在37°C温度下，及CO2含量为5% 的培养箱中培养24小时，离心收集细胞，去除上清，并用预冷的PBS洗一遍；所述PBS的组 成为NaCl 137mmol/L, KC12. 7mmol/L, Na2HP044. 3mmol/L, KH2P041. 4mmol/L ；每孔加入 Iml Trizol裂解细胞3分钟；吹打细胞，将裂解物转移到1. 5ml EP管中，室温放置10分钟；加入 200 μ 1氯仿，在振荡器上剧烈震荡15秒，室温放置10分钟；12000rpm 4°C离心20分钟；取 上清约300-500 μ 1放于一新的EP管中，加入等体积的异丙醇，_30°C沉淀过夜；12，OOOrpm, 4°C离心10分钟。去上清，Iml 75%乙醇洗一次；12，OOOrpm，4°C离心10分钟；吸去上清，干 燥RNA沉淀10分钟；加入20 μ 1 DEPC水溶解RNA。将2单位的DNase I (RNase-free) (TakaRa公司)加入至总RNA中，并在37°C条件 下静置30分钟，以除去总RNA中残留的DNA。经过DNase I处理后，对总RNA进行提纯，提纯 的具体步骤为(采用 Invitrogen 公司 PureLinkMicro-to-Midi Total RNA Purification Kit)，在总RNA中加入等体积的70%乙醇，振荡混合均勻，将混合物转移至纯化柱上，室温 12000g离心15秒，弃过滤液，加入700 μ 1清洗缓冲液I，室温12000g离心15秒，弃过滤液， 加入500 μ 1清洗缓冲液II，室温12000g离心15秒，弃过滤液，再加入500 μ 1清洗缓冲液 II，室温12000g离心15秒，弃过滤液，室温12000g离心1分钟，将纯化柱转移至RNA收集 管上，加入30 μ IDEPC水，室温放置1分钟，室温13000g离心2分钟，丢弃纯化柱，将RNA样 品至于_80°C保存。对提纯后得到的总RNA进行逆转录反应，在逆转录反应中，所用的逆转录酶为 Promega公司的M-MLV逆转录酶，逆转录反应的具体步骤为将Iug提纯后的总RNA与0. 5ug 的Oligo dT在试管中进行混合，用DEPC水将总体积补足至16. 25μ 1，将试管进行加热，加 热的条件包括加热温度为70°C，加热时间为5分钟；然后将试管迅速冷却至0°C，并加入缓 冲液(5XMLVbuffer 5 μ 1, IOmM Dntp 1. 25 μ 1，RNasin 0. 5 μ 1,M-MLV 1口1)，在42°0条件 下孵育1小时，得到cDNA。将得到的cDNA作为PCR反应的模板，进行Real-time PCR反应。Real-time PCR 反应体系为ddH20 17. 5 μ 1, IOmM Dntp 0. 5μ 1, IOXTaq buffer2. 5 μ 1, Taq 0. 5μ 1, F primer 0· 5 μ 1，R primer 0· 5 μ 1，Syber Green I 1 μ 1, cDNA 2 μ 1 ；PCR 反应的条件为 94度2分钟，94度15秒，60度30秒，共40个循环。根据以下公式计算小干扰核酸的抑制 活性，结果如表2所示。小干扰核酸抑制活性=[1_(小干扰核酸转染后的P基因的拷贝数/小干扰核酸 转染后的GAPDH拷贝数)/ (对照孔P基因的拷贝数/对照孔GAPDH拷贝数)]X 100%。
GAPDH :3_磷酸甘油醛脱氢酶基因。3_磷酸甘油醛脱氢酶基因是细胞中的看家基 因，在细胞中稳定表达，不受其他外加因素的影响，因此作为荧光定量PCR反应的内参照。表2 从表2可以看出，本发明提供的小干扰核酸PGENE-I至PGENE-30能够高效的P基 因的表达,特别是小干扰核酸PGENE-2、PGENE-3、PGENE-6、PGENE-9和PGENE-Il对P基因 的抑制活性分别达到85%、82%、82%、81%和82%，说明本发明提供的小干扰核酸用于抑 制P基因的表达时，对P基因表达的抑制活性高。实施例3黑素细胞内黑色素含量的抑制(1)黑素细胞的培养用含有15%胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素的MEM 完全培养基，在温度为37°C及CO2含量为5%的培养箱中对SK-MEL-3黑色素瘤细胞进行培 养，每48小时传代、更换新鲜培养基。(2)黑色素含量检测分别检测小干扰核酸PGENE-I至PGENE-15对黑色素含量的抑制效果，具体步骤如 下以每孔2 X IO5细胞/ImL接种于6孔培养板，每孔分别加入小干扰核酸 和LipOfectamineTM2000脂质体(Invitrogen)进行转染，小干扰核酸的最终浓度 为50nM。以无关小干扰核酸(正义链5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ；反义链 5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3)作为阴性对照。转染后72小时弃培养基，用pH7. 4的 PBS 洗涤 2 次，所述 PBS 的组成为NaCl 137mmol/L, KCl 2. 7mmol/L, Na2HP044. 3mmol/ L，KH2P041. 4mmol/L ；然后每孔加500 μ L浓度为1重量％的TritonX-IOO溶液，所述 TritonX-100溶液的组成为99ml水、Iml TritonX-IOO ；迅速放置于_80°C中，冻存30分钟； 随后室温融化使细胞完全破裂，离心，沉淀用浓度为10重量％的三氯乙酸和无水乙醇各洗 涤1次，12000g离心5分钟，弃上清液，最后加入IM NaOH(含10%体积DMS0)在80°C水浴 保温2小时后于405nm测吸光度值并计算黑色素含量的抑制率，结果如表3所示。黑色素含量的抑制率=[1-[(小干扰核酸转染后的孔吸光度值_空白孔吸光度 值)/ (对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)]]X100 %。
表3 从表3可以看出，本发明提供的小干扰核酸PGENE-I至PGENE-30能够显著的提 高黑色素含量的抑制率，特别是通过小干扰核酸PGENE-2、PGENE-3、PGENE-6、PGENE-9和 PGENE-Il的抑制，黑素细胞内黑色素含量的抑制率达到45%以上，说明本发明提供的小干 扰核酸能够显著的提高黑色素含量的抑制率。实施例4人体皮肤的美白效果检验为了增强小干扰核酸的稳定性，委托上海吉玛公司合成化学修饰的小干扰核酸 PGENE-I至PGENE-15，其中，化学修饰是指对小干扰核酸PGENE-I至PGENE-15正义链的U、 C和G核苷酸戊糖的2’ -OH进行了 2’ -氟代修饰，反义链U和C核苷酸戊糖的2’ -OH进行 了 2’-氧甲基修饰。然后按表4所示的组成将各组分混合，然后搅拌均勻得到组合物1-30， 以评价含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分的组合物的临床美白效果。选择20名健康的年龄在18-55岁之间的女性志愿者，在志愿者的臀部利用GS2006 型日光模拟器(中国北京奥华设备有限公司)诱导皮肤的黑化，诱导黑化的时间为1小时， 形成直径1. Ocm的黑化斑点，明显黑于未黑化皮肤的肤色；之后，分别使用组合物1-15施用 于黑化的皮肤，早、晚各一次，每次用量为0. 5ml，并在施用后每一个月的最后一天观察黑化 皮肤颜色的变化，结果如表5所示。表4 表 5 美白效果评价标准无效果无任何变化；轻微效果黑化皮肤的肤色略微变白，但仍比未黑化皮肤的肤色略黑；显著效果黑化皮肤的肤色明显变白与未黑化皮肤的肤色基本一致。从表5可以看出，含有本发明提供的小干扰核酸PGENE-1至PGENE-15的组合物 在使用5个月后，对黑化皮肤具有显著的美白效果，特别是通过含有PGENE-2、PGENE-3、 PGENE-6.PGENE-9和PGENE-11的组合物，在使用1个月后，对黑化皮肤具有轻微美白效果， 使用3个月后，对黑化皮肤具有显著的美白效果。SEQUENCE LISTING<110>苏州瑞博生物技术有限公司<120>P基因的干扰靶位点序列和小干扰核酸及组合物和应用<130>I 10627SRB<160>31<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>3136<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)<400>1tctgagttct tacttcgaag gctgtgctcc gctcaccatc cagagcggag gtgcggacct 60taaactcact cctggagaaa gatctgcaag tgcgcagaga gaagactggc agtggagcat 120gcatctggag ggcagagacg gcaggcggta ccccggcgcg ccggcggtgg agctcctgca 180
gacgtccgtg cccagcggac tcgctgaact tgtggccggc aagcgcaggc ttcctcgggg240agccggtgga gctgacccct cgcactcctg ccccaggggg gctgccgggc agagctcttg300ggctcctgca ggccaggagt ttgcttcatt cctcacaaaa gggaggtctc actcttcttt360gccccagatg tccagctcca ggtctaaaga ttcctgcttt acagaaaaca ctcctttgct420gaggaattcc ttacaggaga aagggtcacg gtgcatacct gtttaccatc cagagttcat480cactgctgaa gagtcttggg aagacagctc tgctgactgg gagcgaagat acctgctaag540cagggaggtg tctggtctgt ctgcatctgc ctcctccgag aagggagacc ttctggacag600cccgcacatc cgactccgtc tttccaagct gaggcgctgt gtgcagtggc tgaaagtcat660gggcctgttt gcctttgtgg tgctgtgttc tattttgttc agcctatatc cggatcaagg720aaagctctgg cagctgttgg ccttatcacc gctggagaac tactccgtga accttagcag780ccacgtggac tccacgctgc tgcaggtgga cctggcaggg gccctagtgg ccagtgggcc840gagtcgtcct gggagggaag agcacatcgt ggtggagctg acccaggatg acgctttggg900ctccaggtgg cggcggccac agcaggtcac tcacaactgg acggtgtatt taaatccgag960gagaagcgag cactcagtga tgagcaggac ctttgaggta ctgaccagag agacggtgtc1020catcagcatc cgggcctccc tgcagcagac ccaggctgtc cctcttttga tggctcatca1080gtacctccgc ggaagtgtag aaacccaggt gaccatcgcg acggccatcc tcgcgggcgt1140ctacgcgctg atcatatttg agatcgtgca cagaactctg gcggccatgc tgggttccct1200tgcagcactg gcagcactgg ctgtgattgg cgatagaccc agcctgaccc atgtggtgga1260gtggattgat tttgagacgc tggccctgct gtttggcatg atgatcttag tagccatatt1320ttcagaaacg ggatttttcg attattgtgc tgtaaaggca taccggctct cccggggacg1380ggtgtgggcc atgatcatca tgctctgtct catcgcggcc gtcctctctg ccttcttgga1440caacgtcacc accatgctcc tcttcacgcc tgtgaccata aggttgtgtg aggtgctcaa1500ccttgatcca agacaagtcc tgattgcaga agtgatcttc acaaacattg gaggagctgc1560cactgccatc ggggaccctc caaatgtcat tattgtttcc aaccaagagc tgaggaagat1620gggcctggac tttgccggat tcactgcaca catgttcatt gggatttgcc ttgttctcct1680ggtctgcttt ccgctcctca gactccttta ctggaacaga aagctttata acaaggaacc1740cagtgagatt gttgaactga agcacgagat tcacgtctgg cgcctgactg ctcagcgcat1800cagcccggcc agccgcgagg agacagctgt gcgccgcctg ctgctgggga aggtgctggc1860actggagcac ctgctcgccc ggaggctgca caccttccac agacagatct cacaggagga1920caaaaattgg gagaccaata tccaagaact ccaaaaaaag cataggatat ctgacgggat1980tctgctcgcc aaatgcctga cagtgttggg atttgttatc ttcatgtttt tcctcaattc2040gtttgtccct ggcattcatc ttgatcttgg atggattgct attctgggtg ccatctggtt2100gctaatttta gctgatattc atgattttga gataattcta cacagagtgg aatgggcaac2160ccttctgttt tttgcagcgc tctttgttct gatggaggca ttggcacatc tccacttaat2220agaatatgtt ggagaacaaa ctgctttgct aataaagatg gtcccagagg agcagcgcct2280catagccgcc attgtcctgg tggtgtgggt ctcagccctg gcgtcgtccc tgattgacaa2340catcccgttc actgctacca tgattcccgt gctcctgaac ctgagccacg accctgaggt2400tggcctgccc gcaccgccgc tcatgtatgc cctggccttc ggtgcttgcc tgggaggcaa2460cgggacactg attggcgcgt cggcaaacgt cgtgtgtgca gggattgcag aacagcatgg2520CN 10
921744 A
说明书
17/21页
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CN
[0361 [0362 [0363 [0364 [0365 [0366 [0367 [0368 [0369 [0370 [0371 [0372 [0373 [0374 [0375 [0376 [0377 [0378 [0379 [03 [0； [0； [0； [0； [0； [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0 [0
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2权利要求
P基因的干扰靶位点序列，其特征在于，该靶位点序列具有如SEQ IDNos2 16中之一所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的干扰靶位点序列，其中，所述靶序列具有如SEQID No:3、SEQ ID No :4、SEQ ID No :7、SEQ ID No 10 或 SEQ IDNo 12 所示的核苷酸序列。
3.一种小干扰核酸，其特征在于，该小干扰核酸能够通过作用于权利要求1所述的靶 位点序列而抑制P基因的表达，该小干扰核酸的GC含量为35-60%。
4.根据权利要求3所述的小干扰核酸，其中，该小干扰核酸通过化学合成得到，或者通 过质粒和/或病毒载体的表达而得到。
5.根据权利要求3所述的小干扰核酸，其中，该小干扰核酸为包括正义链和反义链的 双链分子，所述正义链和反义链的长度分别为15-27个核苷酸。
6.根据权利要求4所述的小干扰核酸，其中，所述正义链和反义链的长度分别为19-21 个核苷酸。
7.根据权利要求5所述的小干扰核酸，其中，该小干扰核酸具有PGENE-1、PGENE-2、 PGENE-3、PGENE-4、PGENE-5、PGENE-6、PGENE-7、PGENE-8、PGENE-9、PGENE-IO, PGENE-IU PGENE-12、PGENE-13、PGENE-14 或 PGENE-15 所示的核苷酸序列，或者具有对 PGENE-1、 PGENE-2、PGENE-3、PGENE-4、PGENE-5、PGENE-6、PGENE-7、PGENE-8、PGENE-9、PGENE-IO, PGENE-11、PGENE-12、PGENE-13, PGENE-14或PGENE-15所示的核苷酸序列进行化学修饰所 得到的核苷酸序列，其中，PGENE--1正义链5，-GCCAGGA⑶UUGCUUCAUUdTdT--3反义链5，-AAUGAAGCAAACUCCUGGCdTdT--3PGENE--2正义链5，-GGAG⑶CUCACUCUUCUUUdTdT--3反义链5，-AAAGAAGAiiUGAGACCUCCdTdT--3PGENE--3正义链5，-CCUUAUCACCGCUGGAGAAdTdT--3反义链5，-UUCUCCAGCG⑶GAUAAGGdTdT--3PGENE--4正义链5，-GCCU ⑶ GACCAUAAGiiUUGdTdT--3反义链5，-CAACCUUAUG⑶CACAGGCdTdT--3PGENE--5正义链5，-GCAGAA⑶GAUCUUCACAAdTdT--3反义链5，-UU⑶GAAGAUCACUUCUGCdTdT--3PGENE--6正义链5，-CCGGAUUCACUGCACACAUdTdT--3反义链5，-AUGUGUGCA⑶GAAUCCGGdTdT--3PGENE--7正义链5，-GGAGACCAAUAUCCAAGAAdTdT--3反义链5，-UUCUUGGAUAUUG⑶CUCCdTdT--3PGENE--8正义链5，-CCCUGGCAUUCAUCUUGAUdTdT--3反义链5，-AUCAAGAUGAAUGCCAGGGdTdT--3PGENE--9正义链5，-G⑶GCCAUCUGGUUGCUAAdTdT--3反义链5，-UUAGCAACCAGAUGGCACCdTdT--3PGENE--10正义链5，-GGGCUUCCCAAUGAUGGUUdTdT--3反义链5，-AACCAUCAUUGGGAAGCCCdTdT--3PGENE--11正义链5，-GGUU ⑶⑶ CCUGCACUGUUdTdT--3反义链5，-AACAGUGCAGGACACAACCdTdT-3，；PGENE-12 正义链5’ -GCACUGUUGGGAU⑶⑶UAdTdT-3’ 反义链5，-UAACACAUCCCAACA⑶GCdTdT-3，；PGENE-13 正义链5’ -GCUUACCCUGGAGAUGCUAdTdT-3’ 反义链5，-UAGCAUCUCCAGGGUAAGCdTdT-3，；PGENE-14 正义链5’ -GGAAUAGACCUUGACACUAdTdT-3’ 反义链5，-UA⑶⑶CAAGGUCUAUUCCdTdT-3，；PGENE-15 正义链5’ -UCAAUUCUCCUGAGGCUAAdTdT-3’ 反义链5’ -UUAGCCUCAGGAGAAUUGAdTdT-3，。
8.根据权利要求7所述的小干扰核酸，其中，该小干扰核酸具有PGENE-2、PGENE-3、 PGENE-6、PGENE-9或PGENE-Il所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求7所述的小干扰核酸，其中，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种(1)对小干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；(2)对小干扰核酸的核苷酸序列中核糖的修饰；(3)对小干扰核酸的核苷酸序列中碱基的修饰。
10.一种用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物，其特征在于，该化 妆品组合物含有权利要求3-9中的任意一项所述的小干扰核酸作为活性成分。
11.根据权利要求10所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物还含有载体，所述 载体选自动植物油、烃油、酯、高级脂肪酸和高级脂肪醇中的一种或几种。
12.根据权利要求11所述的化妆品组合物，其中，相对于100重量份的小干扰核酸，所 述载体的含量为1000-10000000重量份。
13.根据权利要求11或12所述的化妆品组合物，其中，所述化妆品组合物还含其它用 于化妆品组合物的成分，所述其它用于化妆品组合物的成分选自保湿剂、着色剂、防腐剂、 增稠剂、抗氧化剂、表面活性剂和佐剂中的一种或几种。
14.根据权利要求13所述的化妆品组合物，其中，相对于100重量份的小干扰核酸，所 述其它用于化妆品组合物的成分的含量为1000-10000000重量份。
15.根据权利要求10所述的化妆品组合物，其中，该化妆品组合物为乳剂、膏剂、液剂、 气雾剂或粉剂。
16.权利要求3-9中的任意一项所述的小干扰核酸在制备用于抑制黑色素生成和沉积 或祛除黑色素的化妆品组合物中的应用。
全文摘要
本发明提供了P基因的干扰靶位点序列，用于抑制P基因表达的小核酸，以及含有该小干扰核酸的化妆品组合物和该小干扰核酸在制备用于抑制黑色素生成和沉积或祛除黑色素的化妆品组合物中的应用。本发明提供的小干扰核酸对P基因表达的抑制活性高，能够有效地抑制黑色素生成和沉积。
文档编号C12N15/11GK101921744SQ20091014732
公开日2010年12月22日 申请日期2009年6月11日 优先权日2009年6月11日
发明者张鸿雁, 梁子才 申请人:苏州瑞博生物技术有限公司