一株产生抗肿瘤抗生素卡利霉素的小单孢菌c-3509的制作方法

专利名称：：一株产生抗肿瘤抗生素卡利霉素的小单孢菌c-3509的制作方法
技术领域：
：本发明涉及从我国土壤中筛选得到的一株产生烯二炔类抗肿瘤抗生素卡利霉素的棘孢小单孢菌蛇山变种C3509。
背景技术：
：自本世纪中期以来，某些恶性肿瘤的发病率，几乎每隔十年增长一倍，已成为严重威胁人们生命的常见病、多发病。肿瘤的防治一直是医学研究的热点。自五十年代氮芥类烷化剂用于肿瘤治疗以来，化学治疗占据着不可替代的重要地位。但是，为了满足临床急需，研究人员不得不加大力度，扩展研究的深度和广度，不断开辟寻找新化疗药的途径。微生物广泛存在于自然界，种类繁多，其代谢产物数量亦很庞大。多年来，微生物提供了各种各样生物活性物质，亦可谓是抗肿瘤抗生素的丰富资源宝库，其潜力是巨大的。自1923年4)rskov建立小单孢菌属并于20世纪60年代从棘孢小单孢菌和绎红小单孢菌发酵液中分离到庆大霉素后，小单孢菌作为寻找新抗生素和其它新生物活性物质的资源愈来愈受到重视。1987年，美国科学家报导从小单孢菌中筛选到一株产生高效抗肿瘤抗生素卡利霉素(calicheamicin)的产生菌Mz'cra附cwo5poraec/u.W(Mporaswfesp.ca/!.c/2ew57's。2000年，美国FDAft匕准用于治疗复发的急性髓性白血病的Mylotarg即为单抗与卡利霉素的偶联物。卡利霉素作为弹头药物疗效已经确认，只要与不同的抗体连接，即可组成新的相关抗体药物。本实验室在前期研究工作基础上，采用精原细胞法("Useofmurinespermatogonialassayasproscreenforantitumordrugsinproc，，,13thIntCongrchemother,Viena，PP38-44;1983)，筛选出了能产生高效抗肿瘤活性物质卡利霉素的新菌种棘孢小单孢菌蛇山变种C3509fi^'crawowo^oraec/nwcw/oravar.57zes/wwew^;s入该变种迄今为止，尚未见有国内外的相关报道。本发明的目的是，从土壤中筛选小单孢菌菌株，对其发酵产物进行鉴定，发掘产生具有抗肿瘤作用的抗生素，以期获得具有良好开发与应用前景的抗肿瘤药物。
发明内容本发明提供一种能产生高效抗肿瘤抗生素卡利霉素的新的小单孢菌。其技术方案主要包括以下步骤1、筛选分类。取其发酵液，测紫外吸收光谱，从相似于Calicheamicin的菌株中，选取生长与发酵稳定、精原细胞活性稀释度高的C-3509菌株进行深入研究；根据菌种的形态特征、菌种的生长条件与培养特征、菌种的生理与生化特性、菌种的细胞壁化学组分及核酸碱基分析以及16SrDNA分析，进行菌种分类。2、发酵制备，采用多级培养，其中斜面培养基主要采用Tryptone、酵母浸膏和麦芽糖；一级种子培养基主要采用糊精、MaltExtractProteose、P印toneYeastextract;二级种子培养基主要采用糊精、葡萄糖、Yeastextract、带鱼蛋白胨；发酵培养基主要采用葡萄糖、蔗糖、酵母浸膏粉和带鱼蛋白胨等。3、分离纯化，发酵液离心，取样测活，收集活性部分，制成粗品，用微生物检定法、DNA断裂法测其活性，TLC测其Rf值，挑取两种检测均为高活性部分，参照Rf值进行合并，取强活性部分，反相制备柱制备，得到高效抗肿瘤活性样品。4、结构确认，取二次薄层层析得到的高效抗肿瘤活性样品进行LC-MS检测，再取二次薄层层析得到的高效抗肿瘤活性样品进行紫外吸收检测，以确认本发明所说新种产生的活性物质与卡利霉素相似。5、活性测定，采用DNA断裂活性测定法和细胞毒性检测法进行。DNA断裂活性测定法，是取活性物质，在紫外灯下检测pBR322DNA拓扑结构的变化，并用Chemiimager5500型凝胶成像系统扫描凝胶，记录结果；细胞毒性检测法，是采用MTT法测定细胞存活率。由于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，加入助溶剂二甲基亚枫(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，所以测定溶解的蓝紫色DMSO溶液在特定波长处的光吸收值，即可间接反应活细胞的数量与活性。根据多相分类定种的原则，综合考虑菌株C-3509的培养特征、生理生化指*示、16SrDNA，确认C—3509与Aferowowos/oraecA/"cw/ora系同属，《旦又有另U于同属中的Mcro附o"cw/orasubspcalichensis，故命名为棘孢小单胞菌蛇山变禾中fAf/c7-o附o"cw/wraec/z'wos/>oravw.幼es/朋sz's上该菌禾中已于2009年3月25日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，编号为CGMCCNo.2978。发明效果本发明所得到的小单孢菌菌株C-3509,培养条件简单、保藏方便，在发酵培养基中产生高效的抗肿瘤抗生素，具有潜在的临床应用前景。图l一小单孢菌C3509菌株的孢子结构放大倍数为9000倍，孢子成球形，表面有钝剌，孢子大小为l.卜1.4Wn.图2—小单孢菌C3509高效液相图其中保留时间为11.05的峰对应f;保留时间为11.20的峰对应^;保留时间为11.5的峰对应f;保留时间为11.61的峰对应3;。图3—小单孢菌C3509f的质谱图其中1322为f的[M+H]峰；1320为f的同位素[M+H]峰。图4一小单孢菌C35097;的质谱图其中-1367.9为7;的[M+H]峰。图5—小单孢菌C3509pfr的质谱图其中1334为f的[M+H]峰。图6—小单孢菌C3509^的质谱图其中1381.8为e;的[M+H]峰。图7—C3509的紫外吸收光谱其中230-260nm,260-290nm处为C3509的特征吸收。图8—小单孢菌C-3509发酵产物对超螺旋质粒DNApBR322的切割其中I一超螺旋DNA;II—切口DNA;III—线性DNA;①一pBR322质粒对照；②一0.0002pg/ml的C-3509;③一0.002pg/ml的C3509;④一0.02pg/ml的C3509;⑤一0.2pg/ml的C3509;⑥一1.0)ig/ml的C3509;⑦一10iig/ml的C3509。图9一不同的细胞株对C3509的化学敏感性其中A中一"一表示HepG2，人肝癌细胞株；一，一表示Bel-7402，人肝癌细胞株；B中—"一表示Hela，宫颈癌细胞株；—一表示MG-63，人成骨肉瘤细胞株；表示KB，人口腔上皮癌细胞株。C中一"一表示A549，人肺癌细胞株；表示MCF-7，人乳腺癌细胞株；表示HT-1080，人纤维肉瘤细胞株。实施方案以下实施例仅为便于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。<实施例1〉小单孢菌C-3509菌株的筛选将从土壤中分离得到的多种小单孢菌菌株分别接到TYM琼脂斜面(Tryptcme5g,酵母浸膏3g,麦芽糖10g，K2HPO4lg,KH2PO4lg,琼脂18g，调PH7.0-7.2,去离子水配置成1000ml)上，在28'C培养12天，然后接种于发酵培养基(葡萄糖10g，蔗糖15g,酵母浸膏粉3g，带鱼蛋白胨4g,KI0.1g,微量元素液lml,冷开水1000ml)220rpm，28。C培养3天，低温离心取上清，用精原细胞法检测，从中筛选检测结果为阳性的菌株；取该菌株的发酵液，测其紫外吸收光谱，筛选出与卡利霉素相似的菌株C-3509。<实施例2>小单孢菌C-3509的分类分类培养采用通常有代表性的培养基及国际链霉菌规划会议拟定的培养基(简称ISP培养基)，28。C静止培养21天，观察C-3509菌株的培养特征。颜色鉴定参考Ridgwa图谱，生理生化实验参照文献方法，细胞壁化学组份研究参照Backer、Lechevalier和Hasegawa的方法，磷酸类脂、醌类及G+Cmol%的分析按照中国科学院微生物所Ross、阮继生的方法进行。1、菌种形态特征C-3509菌株在各种琼脂培养基上菌落光秃，或光滑，或粗糙，不形成气生菌丝。营养菌丝一般为浅粉橙色、杏黄色或无色，以后渐渐变为橄榄灰黑色。一般无可溶性色素产生，孢子堆呈黑色，孢子单生或成簇，孢子形态为球形，表面形成钝刺。(图1)2、菌种生长条件与培养特征C-3509菌株适宜的生长温度为15'C至37°C，在l(TC与45。C条件下均不能生长，在含有0.01%叠氮、0.01%酚或0.001%结晶紫的培养基上不能生长，但在含有0.01%孔雀绿的培养基上能够生长。在各种合成或有机琼脂培养基上的菌落为无色、浅粉橙色或杏黄色，以后渐渐转变为橄榄灰、黑色，在ISP-5、高氏1号(Gauze'sNo.l)及甘油察氏(Czapek's)琼脂培养基上生长差，在ISP-2培养基上可产生浅黄褐色的可溶性色素，在葡萄糖天门冬素培养基上没有或有浅紫色的可溶性色素产生。其培养特征见表l。表l.C-3509菌株的培养特征培养基孢子营养菌丝可溶性色素(SP)~^丰，黑色好，杏黄、橙至橄榄黑茶色或黄褐色ISP3适量，黑色好，粉橙色至灰黑色无ISP4适量，黑色适量，粉橙色至灰黑色无ISP5少，黑色生长差，无色无ISP6无或少量，黑色适量好，杏黄至茶色黄色ISP7适量，黑色适量，无色至橄榄灰黑无或淡紫色葡萄糖察氏琼脂适量，黑色适量，灰黑绿无蔗糖察氏琼脂适量，绿黑至黑色适量，橄榄灰黑无甘油察氏琼脂无生长差，无色无高氏合成l号琼脂少，黑色较差，灰黑绿色无葡萄糖天门冬素琼脂丰，黑色_好，橄榄绿黑色_无3、菌种的生理与生化特性C-3509菌株能够水解淀粉，具有强的还原硝酸盐活性，可以使明胶液化，并有弱的降解酪素与胨化牛奶的作用，但对于酪氨酸、尿素与几丁质均不能降解，不形成黑色素，但能够产生硫化氢(强阳性)。能够较好地利用蔗糖、淀粉、糊精、纤维二糖、蕈糖、葡萄糖、木糖，稍利用水杨苷与醋酸钠，不利用L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-果糖、肌醇、甘露醇、乳糖、D-半乳糖、棉子糖、甘油、山梨醇、卫毛醇、木糖醇、核糖醇、纤维素等；能够很好地利用丝氨酸、组氨酸、精氨酸、色氨酸与天门冬素，较好地利用赖氨酸、甲硫氨酸，不利用苏氨酸、半7胱氨酸。4、菌种的细胞壁化学组分及核酸碱基分析C-3509菌株的全细胞水解产物含有内消旋二氨基庚二酸(Meso-DAP)、少量3-羟基-二氨基庚二酸(3-OH-DAP)、木糖、葡萄糖、半乳糖，及少量的阿拉伯糖。其磷酸类脂属于n型，有磷脂酰乙醇胺(PE)。甲基萘醌成分为MK-9(H4)、MK9(H6)。核酸分子中G+Cmol。/。含量为71.14mol%。5、16SrDNA分析按常规方法提取菌株C-3509的总DNA，以通用引物PCR扩增16SrDNA.，PCR产物经纯化后用相同引物进行测序，所得序列经校正后送Genbank序列数据库做Blast比较，根据所得结果选取相关模式菌株序列构建系统发育树；其中多序列匹配排列通过Clustalw软件进行，Neighbor-Joining(N-J)进化树由Phylipsoftwqarepackage生成。菌株C-3509与棘孢小单孢菌的16SrDNA序列同源性最高，为99.44%。根据多相分类定种的原则，综合考虑菌株C-3509的培养特征、生理生化指丰示，16SrDNA，确认C—3509与A/i'cro附owcw;7oraec&wo5pora同属，il又有另U于同属中的Mz'cra附o"，omgc/u'wcw/7orasubspcalichensis，故命名为棘孢小单胞菌蛇山变禾中fMz'cramowoSjporaecAz'"osporavaK幼esAawe"57's入该菌禾中已于2009年3月25日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.2978。6、C-3509与Calicheamicin产生株的比较C-3509与Calicheamicin产生株同属于刺孢小单孢菌属，且都产生高效的抗肿瘤抗生素Calicheamicins四种组份，但两者菌种不同(见表2)。表2.C-3509与Calicheamicin产生菌形态培养特征的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>〈实施例3〉小单孢菌C-3509菌株的发酵C-3509的斜面采用TYM培养基(Tryptone5g,酵母浸膏3g,麦芽糖10g，K2HP04lg,KH2P04lg,琼脂18g，调PH7.0-7.2,去离子水配置成lOOOml)。将C-3509接种于斜面培养基上，28。C培养12天，使得斜面上长满丰富的黑色孢子。将生长好的斜面培养物挖块接种于一级种子培养基(糊精15g,MaltExtract10g,ProteosePeptone5g,Yeastextract5g,调PH7.0，去离子水配置成1000ml)，28'C震荡培养96小时。一级种子转接二级种子培养基(糊精15g，葡萄糖10g,Yeastextract3g,带鱼蛋白胨5g，调PH7.0,去离子水配置成lOOOml)，接种量为5%，28'C震荡培养48小时。二级种子接种于发酵培养基(葡萄糖10g,蔗糖15g,酵母浸膏粉3g,带鱼蛋白胨4g,KI0.1g，微量元素液1ml,冷开水1000ml)，接种量为5M，28'C震荡培养72小时。微量元素液FeS047H20O.lg，MnC124H20O.lg，ZnS047H20O.lg，蒸馏水lOOml，配成lmg/ml溶液。<实施例4>小单孢菌C-3509菌株发酵产物的检测a).微生物检定法适用于初筛，离心收集发酵液，测量抑菌圈直径。检测菌为枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501];b).DNA断裂法lmg活性物质，DMSO溶解为lmg/ml溶液，将3.5pL50mol'U1Tris-HCL(pH7.6)缓冲液、4.5^LpBR322DNA溶液(100ng^U1)、1不同浓度的样品溶液和1|3-巯基乙醇混合，置室温下暗处反应lh，再加入电泳样品孔，在P/。琼脂糖凝胶中电泳lh，用溴化乙锭水溶液(0,45吗'mL")染色30min。在紫外灯下(302nm)检测pBR322DNA拓扑结构的变化。并用Chemiimager5500型凝胶成像系统扫描凝胶，记录结果。〈实施例5〉小单孢菌C-3509菌株发酵产物的分离纯化C-3509的发酵液低温离心，合并离心液，取样测活。活性部分DIAIONHP20大孔吸附树脂进行吸附柱层析，流速每分钟1/100柱体积，80%丙酮洗脱，收集活性部分，低温吹去丙酮，乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取液减压浓縮，至红棕色油状物。少量乙酸乙酯溶解，正已垸沉淀，静置24小时，离心收集沉淀，制成粗口叩o干法装硅胶柱，抽去硅胶柱内空气，以12个柱体积的流动相A溶液(EA:MeOH95:5)平衡柱子。将粗品溶于流动相A溶液中，进行硅胶柱层析，用流动相A溶液进行洗脱，分管收集，微生物检定法、DNA断裂法测其活性，TLC测其Rf值，挑取两种检测均为高活性部分，参照Rf值进行合并。用流动相B(CH2Cl2:Acetone:MeOH8:l:l)进行TLC薄层层析，刮取TLC条带，测活，取强活性部分，用流动相B二次TLC。刮取条带，测活，取强活性部分，合并。将合并部分溶于流动相C(CH3CN:0.2MNH4OAc1:1),ODS的HPLC反相制备柱制备，得到高效抗肿瘤活性样品。〈实施例6〉C-3509菌株发酵产物的结构鉴定取二次薄层层析得到的高效抗肿瘤活性样品用LC-MS进行检测(图2)，分析结果，其中四个成分的分子量(图3、图4、图5、图6)分别与Calicheamicin相同，且分子量为1319、1381的组份为典型的含Br元素化合物质谱图，分子量为1367、1333的组份为典型的含I元素化合物的质谱图。取二次薄层层析得到的高效抗肿瘤活性样品测定紫外吸收，紫外吸收图谱(图7)与Calicheamicin相似。〈实施例7〉样品的活性测定(1)DNA断裂活性测定DNA断裂检测方法lmg活性物质，DMSO溶解为lmg/ml溶液，将3.5pL50molL/1Tris-HCL(pH7.6)缓冲液、4单pBR322DNA溶液(100ngnL")、1pL不同浓度的样品溶液和1pLP-巯基乙醇混合，置室温下暗处反应lh，再加入电泳样品孔，在1%琼脂糖凝胶中电泳1h，用溴化乙锭水溶液(0.45貼mL—1)染色30min。在紫外灯下(302nm)检测pBR322DNA拓扑结构的变化。并用Chemiimager5500型凝胶成像系统扫描凝胶，记录结果。DNA断裂结果见图8。由图可以看出，C-3509浓度为0.02Pg/ml时，仍有DNA断裂活性。C-3509的DNA断裂活性为阳性的最低样品浓度在0.02Pg/ml左右。(2)细胞毒性检测(图9)MTT法测定细胞存活率MTT是一种可以接受H原子的四甲基偶氮唑蓝染料，化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴蓝，商品名为噻唑蓝，简称MTT。检测原理活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。助溶剂二甲基亚枫(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，测定溶解的蓝紫色DMSO溶液在570nm波长处的光吸收值，该值可间接反应活细胞的数量和活性。检测方法如下①取对数生长期细胞，消化计数后按照各个细胞系生长特性不同以4000~6000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板中。②在细胞培养箱中培养24h后加入不同浓度的活性物质，使每孔内给药后培养液终体积为200|il，每组至少3个平行孔，放入细胞培养箱(培养箱温度为37'C，C025%)中继续培养。③MTT用PBS缓冲液配成5mg/ml溶液。给药48h后取出细胞培养板，向每孔中加入前述的MTT溶液20^1，37。C温育4h。⑤吸出上清液，加入150plDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm处测定每个孔的吸光度(A)。将各测试孔的吸光度A值减去本底吸光度A值(完全培养基加MTT，无细胞)，各平行孔的吸光度A值取平均数。⑦细胞的存活率以T/C(%)表示，T为加药组细胞的A值，C为对照组细胞的A值。细胞存活率％=(加药组细胞A值-本底A值)/(对照组细胞的A值-本底A值)X100%⑧根据T/C的值绘制生长曲线。(D根据细胞生长曲线计算活性物质对肿瘤细胞增殖抑制作用的ICso值(半对数抑制浓度)表3.不同的细胞株对C-3509发酵样品的化学敏感性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>细胞毒性(IC5。值单位M)由MTT检测方法获得。A549,人肺癌细胞株；MCF-7，人乳腺癌细胞株；HT-1080,人纤维肉瘤细胞株；Hela，宫颈癌细胞株；MG-63，人成骨肉瘤细胞株；HepG2，人肝癌细胞株；KB，人口腔上皮癌细胞株;Bel-7402，人肝癌细胞系株。权利要求1、一株棘孢小单胞菌变种C-3509，保藏编号为CGMCCNo.2978。2、权利要求l所述小单胞菌变种C-3509在制备抗肿瘤抗生素卡利霉素中的应用。全文摘要本发明涉及一株产生烯二炔类抗肿瘤抗生素的棘孢小单孢菌蛇山变种C3509，实验结果表明，其发酵液用精原细胞法检测为阳性，经过分离纯化可得到高效抗肿瘤活性物质Calicheamicinsγ₁^I，γ₁^Br，β₁^I，β₁^Br四种组份，因而有望用于制备烯二炔类抗肿瘤抗生素。文档编号C12N1/20GK101591632SQ20091013616公开日2009年12月2日申请日期2009年4月30日优先权日2009年4月30日发明者张文军,李电东,杨秀萍,甄永苏,胡继兰,赵春燕,邵荣光申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所