一种盐酸表柔比星脂质体注射液及抗肿瘤活性应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一种注射液及其药物用途，特别涉及一种适合工 业化生产的盐酸表柔比星脂质体注射液及抗肿瘤活性应用。 技术背景
[0002] 表柔比星（Epirubicin)，又名表阿霉素，是典型的蒽环类抗肿瘤抗生素。1975年 意大利学者通过半合成途径合成表柔比星，与另一典型的蒽环类抗肿瘤抗生素药物多柔比 星（阿霉素）是同分异构体，区别在于其氨基糖苷的4'位上的羟基由顺势变为方式。表柔 比星用于乳腺癌、卵巢癌等多种实体瘤。
[0003] 脂质体作为药物载体，具有一定的靶向性，尤以与抗肿瘤药物的结合既增强治疗 作用又可以降低药物毒性。普通脂质体由磷脂和胆固醇组成，但靶向性差，为提高脂质体的 稳定性、靶向性和细胞内导入能力，可以采用某些功能基团修饰脂质体表面，如聚乙二醇 链修饰的脂质体（长循环脂质体，STEALTH技术）。STEALTH技术采用PEG的磷脂作为载体， 延长药物在血液循环时间，使脂质体可以有效的达到病变部位。
[0004] 目前，上市的PEG化脂质体包括美国Sequus公司开发的盐酸多柔比星脂质体注射 液，商品名Doxir (楷莱），是第一个得到美国认可的长循环脂质体（1995年）。Doxir静 脉注射后，盐酸多柔比星脂质体会蓄积到肿瘤组织中，很少进入正常组织，体内分布呈现肿 瘤靶向性，显著提高多柔比星的抗癌效能。国内三家公司成功仿制开发了该产品，其中上海 复旦张江生物医药股份有限公司自主创新的阿霉素脂质体（里葆多）是国内批准上市的首 个PEG化阿霉素脂质体，作为乳腺癌、淋巴癌等癌症的一线化疗药物。已上市的阿霉素脂质 体Myocet 8属于传统的脂质体，即表面没有任何修饰。技术的核心就是利用脂质体内外pH 的差异而使药物被动装载于脂质体内，即pH梯度法。与PEG修饰的多柔比星脂质体比较， Myocet 4的膜结构的组成缺少PEG的保护，容易被巨噬细胞吞噬清除，因此其体内半衰期要 短得多，对肿瘤组织的靶向性，Myocet 4也较Doxir低，因此带来更多的急性毒性。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种盐酸表柔比星脂质体注射液及其制备方法，本发明是由 如下技术方案实现的：
[0006] 本发明所述的盐酸表柔比星脂质体注射液，该注射液由如下原料制成（按脂质体 注射液每100体积份计）：
[0007]
盐酸表柔比星 160重量份 氢化大豆卵磷脂（HSPC) 2000重量份 胆固醇(CH0) 55重量份 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 900重量份 (DSPE-PEG2000) 组氨酸缓冲液 4体积份 蔗糖溶液 200体积份 硫酸铵水溶液 0. 1体积份。
[0015] 本发明所述的盐酸表柔比星脂质体注射液，原料优选为：
[0016] 盐酸表柔比星 230重量份 氢化大豆卵磷脂（HSPC) 170重量份 胆固醇(CH0) 1000重量份 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 60重量份 (DSPE-PEG2000) 组氨酸缓冲液 8体积份 蔗糖溶液 15体积份 硫酸铵水溶液 3体积份。
[0017] 本发明所述的盐酸表柔比星脂质体注射液，其中：
[0018] 硫酸按溶液的浓度为0? 1~0? 3mol/L ;组氨酸缓冲液浓度为0? 05mol/L~ 0? 4mol/L，pH为6. 2~6. 8 ;蔗糖溶液浓度为7~10 %，pH为6. 50~7. 50。优选地，硫酸 铵溶液的浓度为〇? 15mol/L~0? 25mol/L ;组氨酸缓冲液浓度为0? lmol/L~0? 3mol/L ;蔗 糖溶液浓度为8%。优选地，硫酸按溶液的浓度为0. 2mol/L ;组氨酸缓冲液浓度为0. 2mol/ L;蔗糖溶液浓度为9%。
[0019] 本发明所述的盐酸表柔比星脂质体注射液，其中HSPC :CH0 :DSPE-PEG2000的最佳 比例为3:1:1。
[0020] 本发明所述的盐酸表柔比星脂质体注射液终产品中磷脂的最佳浓度16mg/mL ;终 产品中磷脂与药物盐酸表柔比星的最佳比例为8:1，药物盐酸表柔比星的浓度为2mg/mL。
[0021] 本发明盐酸表柔比星脂质体注射液的制备工艺包含以下步骤：
[0022] (1)油相：称取氢化大豆卵磷脂/胆固醇/二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000,溶于无水乙醇，加热溶解后，于55~65°C保温；
[0023] (2)水相：配制硫酸铵水溶液，于55~65 °C保温；
[0024] (3)乳化：在55~65°C条件下，将油相注入到水相中，不断加热搅拌，并通入氮气， 直到无水乙醇完全挥发，得到空白脂质体a ;
[0025] (4)整粒：将空白脂质体a高压均质减小粒径，最大均质压力在1400bar以下；挤 出器挤出，挤出器中采用孔径为0. 05~0. 5nm的滤膜，得到空白脂质体b;
[0026] (5)制造脂质体内外跨膜梯度：采用超滤法或采用凝胶柱层析法，用蔗糖溶液置 换外水相的硫酸铵溶液，得到空白脂质体c;
[0027] (6)载药、孵化：空白脂质体c中加入组氨酸缓冲液，将盐酸表柔比星溶于上述混 合液中，55~65°C保温，蔗糖溶液定容，得到盐酸表柔比星脂质体注射液d;
[0028] (7)除菌、分装：将d用0. 22 ym微孔滤膜除菌、分装。
[0029] 本发明方法中所述超滤法可以是：向空白脂质体加入同等体积的9%蔗糖溶液， 混合均匀，设置流量10_25mL/min，泵速15-35rpm/min，用蔗糖溶液置换内水相硫酸铵，置 换5-8次，得到空白脂质体。处理量不同，流量、泵速也不同，过大会破坏脂质体。
[0030] 本发明方法中所述凝胶柱层析法可以是：空白脂质体上样到凝胶柱中，用蔗糖溶 液洗脱，收集洗脱液。
[0031] 将盐酸表柔比星脂质体注射液平均粒径控制在50~150nm，更优选为70~ 100nm，经过挤出后粒径分布均匀。
【附图说明】
[0032] 图1为屯粒径分布图；
[0033] 图2为d2粒径分布图；
[0034] 图3为乳腺癌小鼠相对肿瘤体积随时间的变化。
[0035] 本发明采用无水乙醇溶解磷脂，解决了以氯仿为溶剂产生毒性的问题；通过加热 搅拌的方法除去乙醇，容易得到空白脂质体，解决了采用减压旋转蒸发除乙醇缓慢且不易 工业化生产的问题；空白脂质体中残留的乙醇采用超滤法去除，与其他方法相比，极好的控 制了乙醇的残留量。本发明中空白脂质体用高压均质机减小粒径后，采用挤出器挤出，使空 白脂质体粒径分布更均匀。
[0036] 本发明将盐酸表柔比星为长循环脂质体注射液，符合工业化大生产要求。与盐酸 表柔比星注射液以及盐酸多柔比星脂质体注射液（楷莱）进行对比试验，治疗MCF-7乳腺 癌荷瘤小鼠的抗肿瘤活性结果表明，本发明将盐酸表柔比星长循环脂质体注射液具有更好 的抗肿瘤作用。
[0037] 下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
[0038] 实验例1:本发明以MCF-7荷瘤小鼠为模型，采用尾静脉注射给药，比较盐酸表柔 比星脂质体注射液、盐酸多柔比星脂质体注射液（楷莱）、表柔比星注射液的抗肿瘤活性。
[0039] 1?实验方法
[0040]取裸鼠（4周龄），将MCF-7细胞混悬均匀，右前肢腋下进行接种，每只注射 0.2mL(l*107)细胞液，80只全部接种。接种肿瘤细胞后，每天观察肿瘤生长情况。当裸鼠 接种MCF-7细胞3天后，可在右前腋下隐约触及肿块，肿块逐渐增大，5天后由外观可见肿块 形成，待肿瘤直径至〇. 6~0. 8cm时，取60只进行实验。
[0041] 将成模裸鼠随机分为6组，每组10只（每隔7天给药1次，给药3次）。
[0042] 1组：实施例5盐酸表柔比星脂质体注射液5mg/kg
[0043] 2组：实施例5盐酸表柔比星脂质体注射液10mg/kg
[0044] 3组：实施例5盐酸表柔比星脂质体注射液15mg/kg
[0045] 4组：盐酸多柔比星脂质体注射液（楷莱）lOmg/kg
[0046] 5组：盐酸表柔比星注射液10mg/kg
[0047] 6组：空白对照（9%蔗糖溶液）
[0048] 尾静脉注射给药，每隔7天给药1次（一个给药周期），待生理盐水对照组肿瘤体 积达到2000mm 3时（长径a达到20mm)，停止试验（试验必须彡注射3个周期）。
[0049] 给药后每天观察裸鼠的精神：自主活动量、动物休息时体态、爬行时体态、饮食等 情况，每隔3天用游标卡尺测量肿瘤最长直径（a)、最短径（b)及体重，估算肿瘤体积。肿瘤 体积=aXb2/2。根据估算出的肿瘤体积计算相对肿瘤体积RTV，RTV = Vt/VQ，其中V。为测 量开始时同一肿瘤的体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。
[0050] 获得的数据以（5土SD )表示，并做t检验，取a =〇? 05显著性水平。
[0051] 注：实验过程中正常饲养小鼠（记录发生的异常情况）。
[0052] 2?实验结果
[0053] 实验结果显示，盐酸表柔比星脂质体注射液有显著的抗肿瘤活性，且抗肿瘤活性 优于盐酸多柔比星脂质体注射液和盐酸表柔比星注射液。实验过程中，15mg/kg给药剂量 组在21天时有2只小鼠死亡，盐酸表柔比星注射液组在21天有3只小鼠死亡。结果见表 1和表2。
[0054] 表1不同制剂给药后体重的变化
[0055]
[0056]
[0057] 注：*对比于空白对照组有显著意义（P〈0. 05)。
[0058] 结果显示：
[0059] 1)与空白对照组相比，其他5组药物对小鼠体重变化有显著意义（P〈0. 05);
[0060] 2)第3组高剂量组小鼠在21天有2只死亡，第5组