专利名称：成熟miRNA定量检测方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物领域中一种标本中成熟miRNA的定量检测方法及试剂盒，可用于 标本中成熟miRNA的表达量分析及临床检测。
背景技术：
miRNA (microRNA)是一类非编码、内源性的小RNA，长约21 25核苷酸 (nucleotides，nt)。目前已经被发现并被miRBase数据库收录的人类miRNA有695种，绝大 多数miRNA可以通过与靶基因的3-UTR区互补结合，抑制靶基因翻译成蛋白质，进而在细胞 及组织水平影响生物体的发育，并参与多种疾病的发生发展过程。一系列的研究表明miRNA 在细胞成长、细胞分化及凋亡、同源异性盒基因调节、神经元极性、胰岛素分泌、胚胎发育中 的大脑形成及心脏发生、代谢等过程中都发挥着重要作用。成熟miRNA作为体液中客观存 在的标志物，其表达量的检测也将有很重要的临床意义。自1993年首次发现miRNA以来，检测其表达水平的技术方法也发展了许多种，目 前已有的检测方法主要有(I)Northern杂交法从1993年始，Northern杂交法就被应用 于miRNA表达谱研究，也是首个用于半定量检测miRNA的实验技术，通过将已知浓度梯度的 寡核苷酸参照物与待测样品进行平行杂交，实现对miRNA的半定量检测。而后，Northern 杂交法成为检测细胞中miRNA表达的常规研究方法之一。但Northern杂交法最大的缺点 是对样品的需求量较高，需要微克级样品才能避免假阴性，有时样品量需要达到40yg才 会出现明显杂交信号；(2)原位杂交法原位杂交分为细胞和组织内原位杂交，该技术检测 miRNA表达，可更直观的展示出miRNA的时空表达模式。该技术可以检测同一细胞系中单 个细胞中的miRNA表达，也可在不经分类和分离的情况下，比较不同细胞系中miRNA的表达 水平，是分析miRNA表达的组织和时序特异性的有力工具。但其同样存在跟Northern杂交 的缺点，那就是对样品的需求量高，很难在一般的检测实验中推广；(3)基因芯片最初的 miRNA基因芯片，是将反义DNA探针点在尼龙膜上，然后以5'端放射性标记的miRNA样品 杂交，再经放射自显影获得信号。经过发展，基因芯片技术敏感度有了很大提高，且可用于 多个miRNA同时检测，但仍有很多不足之处基因芯片的制作和检测需要昂贵的仪器设备、 结果是半定量的、重复性较差、不能同时优化所有待测miRNA的杂交环境、不能区分高度类 似的miRNA等；(4)半定量RT-PCR =RT-PCR作为半定量检测miRNA表达的常用实验方法，在 研究miRNA表达的过程中不断得到改进。半定量RT-PCR是常用的一种简洁、快速、特异的 相对定量的RNA检测技术，有研究用该技术成功对比了待测和对照样本之间特异miRNA的 表达差异，但只能测定miRNA的相对含量。该技术有以下优点可在较短时间内获得结果； 高通量，可同时检测多种miRNA的表达；与Northern杂交相比，仅需少量RNA，且不用放射 性同位素标记；操作过程简单。但该技术检测miRNA表达时也有以下缺点有的miRNA和其 他miRNA具有同源区域，它们的引物序列就是miRNA基因序列5'端的一部分，检测的特异 性不容易控制，不能很好的区分标本中的成熟miRNA和前体miRNA。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种可以特异性定量检测标本中成 熟miRNA的简便、实用的方法及成套的试剂盒，可用于多种类型标本中成熟miRNA的表达量 分析及临床检测。本发明所涉及的miRNA检测方法，其特征在于提取总RNA(含miRNA)，以发卡结 构引物在逆转录酶的催化下合成cDNA，以miRNA特异性正向引物及通用反向引物进行实时 荧光PCR定量检测成标本中成熟miRNA的含量。该检测方法通过以下技术方案实现⑴ 总RNA提取A、样品处理；B、RNA分离；C、RNA沉淀；D、RNA洗涤；E、RNA溶解；F、RNA浓度测 定；G、RNA电泳检测。(2) RNA的逆转录以一个包含20_230nt长度的发卡序列和6_30nt 特异性序列的引物进行逆转录反应，扩增相应的成熟miRNA的第一链cDNA。(3)荧光定量 PCR检测以miRNA特异性正向引物及通用反向引物进行实时荧光PCR定量检测标本中成 熟miRNA的含量。检测的基本原理示意图见附图1，下面将通过一个具体实施方式
详细描述 该技术方案。该技术有以下优点高度特异性，特异的发卡反转录引物确保反应不受其前体及 基因组DNA污染等因素的干扰，对序列高度同源的miRNA也可精确区分；超宽的定量线性范 围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级；样品消 耗少，仅需1 IOng的总RNA ；适用范围广，总RNA、细胞裂解物以及纯化的RNA都可作为标 本用于miRNA的定量检测，也可用于其他小分子RNA的检测，如siRNA。
图1是检测的基本原理示意图；图2是RNA的电泳结果图。
具体实施例方式实施例一人血液中hsa-miR-29a miRNA的定量检测1、总 RNA 提取(1)样品处理取100 μ L 500 μ L血液标本，加imL TRIzol试剂，反复混勻；(2) RNA分离室温放置上述样品液10分钟，加入氯仿200 μ L，剧烈振荡约1分钟， 室温静置5分钟，4°C 12000g离心15分钟，小心取出样品，通过观察可以发现样品分三层， 其中最上层含有RNA组份；(3) RNA沉淀小心吸取上清液约450 μ L至含有600 μ L冰冷异丙醇的新离心管 中，混勻，4°C 12000g离心10分钟；(4) RNA洗涤去上清，加入500 μ L冷冻的75%乙醇，弹起沉淀，4°C 12000g离心5 分钟，去上清，4°C 12000g再离心5分钟，吸去上清液；(5) RNA溶解风干约5 10分钟，加入DEPC处理水约30 μ L，溶解RNA ；(6) RNA浓度测定吸取1 μ L RNA用DEPC水稀释10倍后，在微量分光光度计上测 定RNA浓度，以DEPC水做空白对照，同时记录RNA浓度及其0D26(1/0D28(1，按照公式计算RNA 浓度，RNA浓度=40ng/μ LXOD260 X稀释倍数；
(7) RNA电泳检测A、变性胶制备取1. 2g琼脂糖加75mL去离子水煮沸，冷却至 70°C左右加入IOmL 10XMops和15mL甲醛及适量溴化乙锭，倒胶至插有梳子的胶板上；B、 电泳缓冲液配制(IXMops)取50mL 10 XMops，用去离子水稀释至500mL，倒入电泳槽中； C、RNA样品处理取RNA样品约9yL，65°C变性IOmin后立即冷却，加入IyLlO X RNA上样 缓冲液；D、RNA电泳把RNA胶放入电泳槽中，100V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处 理过的RNA样品，100V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶观察或拍照；(8) RNA抽提结果RNA电泳图见附图2 ；(9)所得总RNA可立即使用或放-80°C保存；2、检测用相关引物设计根据hsa-miR-29a的序列ACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAG设计实验所需的弓丨物如下(1)发卡结构逆转录引物为5 ’ GACCGACATCACGTACACTCCGAGGTACTTACGTGATGTC GGTCCTGAAC 3 ’，前面 55nt 的序 列是发卡结构区，后面6nt的序列是针对miRNAhsa-miR-29am的特异性序列；(2)正向引物为5，ACTGATTTCTTTTGGTGTTCAG 3，；(3)反向引物为5，GACCGACATCACGTACACTCC 3，；3、RNA的逆转录(1)在冰上按如下比例配制RNA及引物混合液上述所得总RNA2 μ L，10 μ M逆转 录引物1 μ L，去RNA酶超纯水7 μ L，总体积为10 μ L ；(2)混勻上述RNA及引物混合液，短暂离心，放65°C变性10分钟，置冰上2分钟；(3)按如下比例配制反转录反应液RNA及引物混合液10μ L，5X逆转录反应缓冲 液 5 μ L，IOmM dNTPs 4 μ L，25U/ μ L RNA 酶抑制剂 1 μ L, 200U/ μ L M-MLV 逆转录酶 1 μ L，去 RNA酶超纯水4 μ L，总体积为25 μ L ；(4)混勻上述反应混合物，短暂离心，置42°C反应60分钟，95°C 5分钟灭活处理；(5)所得产物是单链cDNA，可立即使用或放置于_20°C保存。4、荧光定量PCR检测反应(1)在冰上按如下比例配制荧光定量PCR的反应液10X荧光定量PCR缓冲液 2 μ L, 5U/ μ L DNA 聚合酶 0. 5 μ L，40 X 荧光定量染料 0. 5 μ L，IOmM dNTPs 2μ ，2μΜ 正向 弓丨物2 μ L，2 μ M反向弓丨物2 μ L，单链cDNA 2 μ L，去RNA酶超纯水9 μ L，总体积为20 μ L ；(2)混勻上述荧光定量PCR的反应液，移至PCR反应管，短暂离心使所有试剂到反 应管底部；(3)荧光定量PCR反应使用标准的三步法进行检测，反应循环设定如下95°C预 变性10分钟；95°C变性10秒钟，57°C退火20秒钟，72°C延伸10秒钟；40个循环；(4)扩增分析按照所用仪器的软件分析扩增曲线及溶解曲线，确定标本中的 has-miR-29a 的量。
权利要求
一种生物标本中成熟miRNA的定量检测方法，其特征在于提取总RNA(含miRNA)，以发卡结构引物在逆转录酶的催化下合成cDNA，以miRNA特异性正向引物及通用反向引物进行实时荧光PCR定量检测标本中成熟miRNA的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，所采用的检测标本包含提纯的总RNA、提纯的小RNA及 未纯化的全血、血清、血浆、唾液、尿液、组织液原液。
3.根据权利要求1所述的方法，反转录引物采用的是发卡式结构设计，包含发卡互补 区、发卡环状区和特异性序列区。发卡序列的总长度为20-230nt，其中发卡互补区序列长 度为lO-lOOnt，发卡环状区序列长度为lO-lOOnt，成熟miRNA特异性序列区的序列长度为 6-30nto
4.一种生物标本中成熟miRNA的定量检测试剂盒，其特征是包含以下组份(1)发卡 结构逆转录引物；(2)逆转录反应混合物；(3)荧光定量PCR反应混合物；(4)无RNA酶超纯 水。
5.如权利要求4所述的逆转录反应混合物，其特征在于含有以下任何一种或多种组份 的组合(1)逆转录反应缓冲液，(2)dNTPs, (3)RNA酶抑制剂，(4)逆转录酶，(5)超纯水。
6.如权利要求4所述的荧光定量PCR反应混合物，其特征在于含有以下任何一种或多 种组份的组合(1)荧光定量PCR缓冲液，(2)DNA聚合酶，(3)荧光染料，(4)dNTPs，(5)正 向引物，(6)反向引物，(7)超纯水。
7.上述任一项权利要求所述的内容，用于任一种成熟miRNA的检测试剂盒。
8.上述任一项权利要求所述的内容，用于任一种成熟miRNA表达水平的分析及临床检测。全文摘要
本发明涉及一种生物标本中成熟miRNA的定量检测方法及试剂盒。其主要步骤为提取总RNA(含miRNA)，以发卡结构式引物在逆转录酶的催化下合成cDNA，以miRNA特异性正向引物及通用反向引物进行实时荧光PCR定量检测成标本中成熟miRNA的含量。本发明具有适用范围广、高特异性、高灵敏度及超宽的线性检测范围等优点。该方法简便快速，可广泛用于成熟miRNA的表达量分析及临床检验。
文档编号C12Q1/68GK101871004SQ20091013571
公开日2010年10月27日 申请日期2009年4月27日 优先权日2009年4月27日
发明者冯长访, 王保君, 陶建国 申请人:冯长访