一种青霉噻唑酸和/或脱羧青霉噻唑酸的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种青霉嚷挫酸和/或脱簇青霉嚷挫酸的检测方法。
【背景技术】
[0002] 青霉嚷挫酸和脱簇青霉嚷挫酸是青霉素类抗生素的降解物。青霉素类药物的 0-内酷胺环化学性质不稳定，与碱、酸、重金属、径胺和青霉素酶作用时，均易发生水解反 应和分子重排，导致内酷胺环开环而失去抗菌活性。青霉嚷挫酸和脱簇青霉嚷挫酸就是 0-内酷胺环发生水解反应和分子重排后的降解产物。
[0003] 牛奶是一种大众日常的消费品，随着人们对食品安全要求日益提高，牛奶的安全 质量问题也越来越为人们重视。但从我国国内养殖环境来看，在我国大部分地区，特别是广 大农村地区的动物和饲料生产过程中，仍存在超量或超范围使用抗生素、不严格执行药物 配伍禁忌或停药期规定的情况，甚至会存在使用违禁抗生素等现象。因食物链传递，牛奶中 大量残留的抗生素会对人体造成危害。另外，从乳制品加工的角度来看，原料乳中残留的抗 生素会严重影响干酪、黄油和发酵乳的起酵或后期风味的形成。
[0004] 现有技术汇中，原料乳和/或液态乳制品中残留的青霉嚷挫酸和脱簇青霉嚷挫酸 的检测方法主要有高效液相色谱法（册LC)和液相色谱-质谱（HPLC-MS/M巧方法等；其预 处理多采用液液萃取等方法。运些预处理方法存在的主要问题是操作步骤多、耗时长、有机 溶剂使用量大、去除基质效应效果差W及不利于环保的缺陷。该现象亟待解决。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服了现有技术对原料乳和/或液态乳制品中残 留的青霉嚷挫酸和/或脱簇青霉嚷挫酸的含量进行检测前，其预处理方法操作步骤多、耗 时长W及有机溶剂使用量大的缺陷，提供了一种青霉嚷挫酸和/或脱簇青霉嚷挫酸的检测 方法。本发明的预处理方法快速、简单、经济、可靠，能够有效地提取出待测组分，去除复杂 基质影响，有益于待测样品的快速检测。而且在保持较高提取率的同时，节约了有机溶剂 的使用、排放和损失，有利于环境保护，节约了预处理步骤、时间和能耗，具有较强的应用价 值。本发明的检测方法可用于青霉嚷挫酸和/或脱簇青霉嚷挫酸，且检测方法快速，简单， 精密度高，准确性高。
[0006] 本发明通过W下技术方案解决上述技术问题。
[0007] 本发明提供了一种青霉嚷挫酸和/或脱簇青霉嚷挫酸的检测方法，其包括W下步 骤：
[0008] (1)将待测样品和乙腊的混合物，离屯、，收集上清液；所述的待测样品为不含固体 颗粒的乳制品；
[0009] (2)将所述上清液上样至已经活化的OasisP化MEHLB固相萃取小柱，收集流出 液，即得预处理后的待测样品；
[0010] (3)将所述预处理后的待测样品去除溶剂，再用溶剂A溶解，过滤，得进料样品；所 述溶剂A为甲醇水溶液、乙腊水溶液或水；
[0011] (4)将步骤（3)中所述进料样品再进行高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱 (LC-MS/M巧检测青霉嚷挫酸和/或脱簇青霉嚷挫酸，即可。
[0012] 步骤（1)中，所述的待测样品较佳地为原料乳和/或液态乳制品。
[0013] 其中，所述的液态乳制品为本领域常规的液态乳制品，较佳地为高巧牛奶、高铁牛 奶、低乳糖牛奶和低脂牛奶中的一种或多种，更佳地为高巧牛奶和/或低乳糖牛奶。
[0014] 其中，所述的原料乳为本领域常规的原料乳，较佳地为牛乳和/或羊乳。除所述待 测组分外，所述牛乳的成分及含量一般如表1所示： |；001引表1
[0016]
[0017]
[001引其中，上述百分比为各组分相对于牛乳的质量百分比。
[0019] 步骤（1)中，所述的待测样品可能含有青霉嚷挫酸和/或脱簇青霉嚷挫酸。该些 组分可能是由于养殖动物和生产饲料过程中，超量或超范围使用抗生素、不严格执行药物 配伍禁忌或停药期规定或使用违禁抗生素等现象造成的。
[0020] 步骤（1)中，所述的待测样品中，青霉嚷挫酸的含量较佳地为20~1000μg/Kg， 更佳地为20~50μg/Kg。所述的待测样品中，脱簇青霉嚷挫酸的含量较佳地为10~ 1000μg/Kg，更佳地为 20 ~50μg/Kg。
[OOW步骤（1)中，所述乙腊的添加量为本领域常规的添加量，较佳地为3~40mL/l~ 4g待测样品，更佳地为3~lOmL/lg待测样品。
[00巧步骤（1)中，较佳地，在所述离屯、的操作之前，先将所述混合物进行縱满震荡。所 述旋满震荡的方法和条件为本领域常规的方法和条件，所述的旋满震荡的时间较佳地为 1~lOmin，更佳地为5min。所述縱满震荡的溫度本领域常规，一般为室溫。所述旋满震荡 是为了利于提取，使乙腊进一步提取所述待测成分。
[0023]步骤（1)中，较佳地，所述混合物中还包含酸。所述酸为本领域常规的酸，较佳地 为甲酸和/或乙酸。所述酸的添加量为本领域常规，较佳地为0. 1~2%，更佳地为0. 8~ 1. 2%，最佳地为1 % ;上述百分比为所述酸占所述乙腊的体积百分比。添加所述酸后，所述 待测样品中所述青霉嚷挫酸或所述脱簇青霉嚷挫酸的提取率至少能提高10%W上。
[0024]步骤（1)中，根据本领域常识可使用所述乙腊和酸进行多次离屯、操作，较佳地使 用所述乙腊和酸进行两次离屯、操作。所述酸的种类和用量如前所述。根据本领域常识，将 多次离屯、后所得上清液进行合并。
[00巧]步骤（1)中，所述的离屯、的方法和条件为本领域常规的方法和条件。所述的离屯、 的转速较佳地为5000~1500化pm。所述的离屯、的时间较佳地为5~30min。
[00%] 步骤（1)中，较佳地，将所述上清液先进行定容后再进行步骤（2)的操作。所述定 容的操作过程中，较佳地使用水或乙腊进行定容，更佳地使用乙腊进行定容。所述定容的终 点较佳地为10~25mL/g待测样品，更佳地为lOmL/g待测样品。所述定容的目的是为了使 后续进行测试时，用量基本相同。
[0027] 步骤似中，所述OasisP化MEHLB固相萃取小柱较佳地为沃特世科技（上海） 有限公司市售产品。
[0028] 步骤（2)中，所述活化的操作和条件为本领域常规的操作和条件。活化采用的溶 剂种类较佳地为乙腊水溶液。所述乙腊水溶液中，乙腊占水的体积百分比较佳地为20~ 90 %，更佳地为60 %。所述乙腊水溶液的用量为本领域常规，较佳地为3~10血，更佳地为 4mL。
[0029] 步骤（2)中，所述上清液在所述固相萃取小柱中的流速为本领域常规的流速，较 佳地为0. 025~0. 30血/s，更佳地为0. 05血/s。
[0030] 步骤（3)中，所述去除溶剂的方法和条件为本领域常规，较佳地使用平行蒸发仪 在20~50°C下浓缩至干，更佳地使用平行蒸发仪在25°C下浓缩至干。
[00川步骤（3)中，所述乙腊水溶液中，乙腊占水的体积百分比较佳地为1~20%，更佳 地为6 %。所述甲醇水溶液中，甲醇占水的体积百分比较佳地为1~20 %，更佳地为6 %。 阳0巧步骤（3)中，所述溶剂A较佳地为乙腊水溶液。所述溶剂A的用量较佳地为1~ 2mL/g所述待测样品，更佳地为ImL/g所述待测样品。
[0033] 步骤（3)中，所述的过滤的方法为采用有机微孔滤膜进行过滤，较佳地采用孔径 为0. 22μm或0. 45μm的有机微孔滤膜进行过滤。根据本领域常识，所述的过滤为微滤。
[0034] 步骤（4)中，所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱（LC-MS/M巧检测的条件 和方法为本领域常规的条件和方法。
[0035] 步骤（4)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相色谱法检 测的色谱柱较佳地为十八硅烷键合硅胶色谱柱（WaterxselectCiscolumn)。所述的十八 硅烷键合硅胶色谱柱的规格较佳地为4. 6mmX250mm或4. 6mmX150mm。
[0036] 步骤（4)所述的高效液相色谱-电喷雾串联二级质谱检测中，高效液相色谱法较 佳地使用梯度洗脱的方法，流动相A为乙腊，流动相B为甲醇水溶液。所述流动相B中，甲 醇的体积分数较佳地为0. 05~1 %，更佳地为0. 1 %