一种利用拉曼光谱技术联合染色快速鉴别周围神经性质的方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用拉曼光谱技术联合染色快速鉴别周围神经性质的方法，包括以下步骤：获取周围神经的断面标本，厚度为1-2mm；进行冰冻切片，切片厚度为20-30μm；在显微拉曼光谱仪下，将激光束聚焦于神经纤维断面进行拉曼光谱采集；Karnovsky-Roots染色30min；再次在显微拉曼光谱仪下，用同样波长的激光束聚焦于神经纤维断面进行拉曼光谱采集；根据染色前后的光谱结果判断神经纤维的性质。本发明的鉴别周围神经性质的方法能快速识别周围神经内运动纤维和感觉纤维的性质，还具有较好的灵敏度、特异度和准确度，帮助科研与临床上需要对两种神经纤维进行鉴别的各种需求。
【专利说明】一种利用拉曼光谱技术联合染色快速鉴别周围神经性质的 方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及光学分析【技术领域】，具体地说，是一种利用拉曼光谱技术联合染色快 速鉴别周围神经性质的方法。
【背景技术】
[0002] 周围神经损伤在骨科临床较为常见，其损伤后的修复与再生一直是国内外学者重 点研究的课题。众所周知，神经功能恢复不理想的主要原因是运动或感觉神经纤维之间的 错向吻合。端端神经吻合是公认的完全断离最有效的修复方法，简单的周围神经损伤可以 通过无张力下残端吻合来恢复功能，但对较长距离缺损则无法使用，需要运用自体神经以 及去抗原化处理过的同种异体神经移植等技术。无论哪种修复方式，如何对周围神经纤维 的性质进行快速、准确的识别，是当前迫切需要解决的问题之一，对于临床上周围神经损伤 术中手术方式的选择具有较好的参考价值。
[0003] 目前临床上识别神经性质的方法主要可归为以下几类：1)根据解剖学特点和术中 探查判断；2)术中电流刺激；3)胆碱酯酶或碳酸酐酶染色；4)同位素法测定乙酰基胆碱转 移酶活性等。这些方法普遍耗时较长，不能满足手术中医师对神经性质的信号进行快速获 取与鉴别的要求。
[0004] 中国专利文献CN101246159B公开了一种快速鉴别周围神经束性质的方法，步骤 为：①切取一段长度小于等于2mm的新鲜神经，放入浓度大于等于90%的乙醇中浸泡ΚΓ20 分钟，然后放入浓度为2(Γ40%的蔗糖溶液中浸泡10-20分钟；②在-2(T-40°C的条件下， 在冰冻切片机上切片，切片厚度为2(Γ50μπι ;③利用相干成像的方法，对切片样品的三维 结构做相干成像，根据成像样品的三维投影特征来进行神经束性质的判定，其中交错的 条纹所占面积比例7(Γ100%的神经束为运动神经束，否则为感觉神经束。中国专利文献 CN101246141B公开了一种快速鉴别周围神经束性质的电化学检测方法，首先采用聚合物一 金纳米粒子复合物修饰电极，然后依次在胆碱氧化酶和乙酰胆碱酯酶溶液中孵育，通过复 合物膜对蛋白质良好的吸附力，使两种酶在电极表面富集，通过三电极系统，基于双酶体 系测定底物乙酰胆碱的安培响应，从而间接实现对乙酰胆碱酯酶的检测（检测浓度范围： 1. 0-2. Ounit/mL)。用神经组织匀浆代替标准乙酰胆碱酯酶溶液进行孵育，通过对乙酰胆碱 是否有响应的检测，实现了对运动束和感觉束的快速鉴别。本发明提供一种目前未见报道 的快速鉴别周围神经性质的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种利用拉曼光谱技术联合染色快 速鉴别周围神经性质的方法。
[0006] 研究表明，Karnovsky-Roots染色1小时时，无髓神经纤维淡染而运动有髓纤维几 乎没有着色，无法区分神经纤维性质；2小时开始有轻度着色，染色的神经纤维数量增加； 8?12小时起染色阳性区域则不再变化。显然，漫长的染色时间不能满足例如临床手术等 需要能快速对神经纤维功能完成快速识别的工作的需要。
[0007] 拉曼光谱分析法是基于拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析 以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法，能够反映微小生 物标本内核酸、蛋白质、脂质的含量及其化学结构和变化。然而，对直接采集的运动纤维和 感觉纤维的拉曼光谱信号进行分析，并未发现两种周围神经纤维的拉曼信号之间有显著差 异，同时每条光谱曲线之间却又完全不同。根据使用拉曼光谱检测生物标本的经验及诸多 文献中的结果来看，生物样品的拉曼信号极为复杂，并且拉曼强度受扫描范围内被测物质 密度、结构组成以及杂质的存在等各种因素影响，导致即使同一位置两次测量的光谱信号 之间也会存在一定微小偏差。通过实验我们也发现，不同功能的神经切片样品本身的光谱 差别可能同样十分微小，通过细微的信号差异进行组织学上的识别非常困难。
[0008] Karnovsky-Roots染色的本质实为通过碘化硫代乙酰胆碱与乙酰胆碱酯酶 (AChE)结合，经过与染色液的氧化还原反应，生成棕褐色亚铁氰化铜沉淀沉积在运动神经 纤维的轴突内，而在感觉神经纤维的轴突内由于没有AChE则不会发生化学反应产生沉淀 沉积，如此使得运动与感觉神经纤维在光镜下能够通过光谱特性变化而识别。
[0009] 经过Karnovsky-Roots染色的运动神经纤维均能在本身的拉曼散射以外的峰位 上产生拉曼散射信号，并且随着染色时间的增加即沉淀分子数量的增加，拉曼强度呈递增 关系，能够从复杂的神经生物信号中脱颖而出，避免了神经纤维本身信号差异的干扰。神经 纤维的拉曼光谱的特点是，在 550CHT1、1080CHT1、lllOcnT1、1280CHT 1、1440CHT1、1660CHT1 具有 明显的拉曼强度，其中以1440CHT1的强度最大。除了神经纤维本身的拉曼强度，运动纤维由 于含有AChE,经过Karnovsky-Roots染色后，轴突内产生亚铁氰化铜沉淀，因此在480〇11' 510〇11- 1、595〇11-1、2110〇11-1、2155〇11-1检测到来自染色沉淀的拉曼强度，其中以2100-2200〇11- 1 的信号强度最大，参考有机物拉曼频率对照表，可以确定2100 cnT1?2200 cnT1为CN信号， 所反映的基团与沉淀亚铁氰化铜的化学组成相符；感觉神经纤维中由于缺乏AChE，亚铁氰 化铜沉淀积聚少，无法观察到相应峰位的拉曼强度。本发明的快速鉴别周围神经性质的方 法基于前述科学原理所完成。
[0010] 本发明采取的技术方案是：所述的方法包括以下步骤：获取周围神经的断面标 本，厚度为l_2mm ;进行冰冻切片，切片厚度为20-30Mm ;在显微拉曼光谱仪下，将激光束聚 焦于神经纤维断面进行拉曼光谱采集；Karnovsky-Roots染色30min ;再次在显微拉曼光谱 仪下，用同样波长的激光束聚焦于神经纤维断面进行拉曼光谱采集；根据染色前后的光谱 结果判断神经纤维的性质。
[0011] 所述的显微拉曼光谱仪为H0RIBA Jobin Yvon LabRam-lB型激光共聚焦显微拉曼 光谱仪。
[0012] 所述的显微拉曼光谱仪为H0RIBA Jobin Yvon XploRA-FDU型激光共聚焦显微拉 曼光谱仪。
[0013] 所述的激光束波长为532nm。
[0014] 所述的激光束波长为632. 8nm。
[0015] 所述的拉曼光谱采集范围为1400-220001^,采集时间为10s。
[0016] 所述的拉曼光谱采集范围为1400-220001^,采集时间为50s。
[0017] 所述的判断神经纤维性质的方法为：对采集得到的拉曼光谱数据使用LabSpec软 件进行人工基线处理和计算机多项式迭代法平滑曲线，获得最终用于数据分析的显微拉曼 光谱，染色30min后1 2_/1144(|比值>0. 2的神经纤维是运动神经纤维，反之则是感觉纤维。
[0018] 所述的判断神经纤维性质的方法为：对采集得到的拉曼光谱数据使用LabSpec软 件进行人工基线处理和计算机多项式迭代法平滑曲线，获得最终用于数据分析的显微拉曼 光谱，经过Karnovsky-Roots染色30min后，拉曼光谱在210001^-216001^ 1出现明显的拉曼 强度是运动神经纤维，反之则是感觉神经纤维。
[0019] 本发明优点在于： 1、本发明的鉴别周围神经性质的方法能在较短的时间识别周围神经内运动纤维和感 觉纤维的性质，帮助科研与临床上需要对两种神经纤维进行鉴别的各种需求。
[0020] 2、本发明的鉴别周围神经性质的方法具有较好的灵敏度、特异度和准确度。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 附图1是本发明实施例2以I21TO/ 1145(|鉴别脊髓前根或后根的诊断性试验的R0C 曲线。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0023] 本发明的一种利用拉曼光谱技术联合染色快速鉴别周围神经性质的方法包括以 下步骤： 1) 获取周围神经的断面标本，厚度为1-2_; 2) 进行冰冻切片，切片厚度为20-30Mm ; 3) 在显微拉曼光谱仪下，将激光束聚焦于神经纤维断面进行拉曼光谱采集； 4) Karnovsky-Roots染色30min，染色液配方如表1所示； 表1染色液配方
【权利要求】
1. 一种利用拉曼光谱技术联合染色快速鉴别周围神经性质的方法，其特征在于，所 述的方法包括以下步骤：获取周围神经的断面标本，厚度为l-2mm;进行冰冻切片，切片厚 度为2〇-3〇μπι ;在显微拉曼光谱仪下，将激光束聚焦于神经纤维断面进行拉曼光谱采集； Karnovsky-Roots染色30min ;再次在显微拉曼光谱仪下，用同样波长的激光束聚焦于神经 纤维断面进行拉曼光谱采集；根据染色前后的光谱结果判断神经纤维的性质。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的显微拉曼光谱仪为HORIBA Jobin Yvon LabRam-lB型激光共聚焦显微拉曼光谱仪。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的显微拉曼光谱仪为HORIBA Jobin Yvon XploRA-FDU型激光共聚焦显微拉曼光谱仪。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激光束波长为632. 8nm。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激光束波长为532nm。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的拉曼光谱采集范围为 1400-2200CHT1，采集时间为 50s。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的拉曼光谱采集范围为 1400-2200CHT1，采集时间为 10s。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的判断神经纤维性质的方法为：对采 集得到的拉曼光谱数据使用LabSpec软件进行人工基线处理和计算机多项式迭代法平滑 曲线，获得最终用于数据分析的显微拉曼光谱，染色30min后Ι 21(ΚΙ/Ι144(Ι比值>0. 2的神经纤 维是运动神经纤维，反之则是感觉纤维。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的判断神经纤维性质的方法为：对采 集得到的拉曼光谱数据使用LabSpec软件进行人工基线处理和计算机多项式迭代法平滑 曲线，获得最终用于数据分析的显微拉曼光谱，经过Karnovsky-Roots染色30min后，拉曼 光谱在ZlOOcn^jieOcnr 1出现明显的拉曼强度是运动神经纤维，反之则是感觉神经纤维。
【文档编号】G01N21/65GK104142322SQ201410405809
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】陈增淦, 徐沁同 申请人:复旦大学附属中山医院