用于声学流式细胞计量术的方法

用于声学流式细胞计量术的方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于声学流式细胞计量术的方法。一种流式细胞计数器，包括：具有样本通道的毛细管；耦合到所述毛细管的至少一个振动产生换能器，所述至少一个振动产生换能器被配置成产生声信号，所述声信号引起所述样本通道内的声辐射压力以声学集中在所述样本通道中的流体样本流内流动的颗粒；以及具有紫光激光器和蓝光激光器的探询源，所述紫光激光器和所述蓝光激光器被配置成与经声学集中的颗粒的至少一些相互作用以产生输出信号。
【专利说明】用于声学流式细胞计量术的方法
[0001] 本申请是申请号为201080061774. 5(国际申请号：PCT/US2010/058242)、申请日 为2010年11月29日（进入国家阶段日为2012年7月18日）、发明名称为"用于声学流 式细胞计量术的装置、系统、方法和计算机可读介质"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求于2009年12月4日提交的美国临时申请第61/266, 907号、于2010 年2月12日提交的美国临时申请第61/303, 938号以及于2010年6月28日提交的美国临 时申请第61/359, 310号的优先权，上述每一申请的全部内容通过引用被合并于本文中。

【技术领域】
[0004] 本申请一般地涉及流式细胞计量术，尤其涉及使用声学流式细胞计量术检测罕见 事件的装置、系统、方法和计算机可读介质。

【背景技术】
[0005] 在传统流式细胞计量术中，通过使鞘液以极高的容积流率（大约是样本流体的容 积流率的100-1000倍）围绕样本流体流动而将样本流体聚焦到大约10-50ym的小核心直 径。样本流体中的颗粒以极快的线速度（以米/秒的数量级）流动并且因此仅需要极短的 时间穿过探询点（通常仅1-lOus)。这具有明显的缺点。首先，颗粒不能被重定向到探询 点，原因是流动不能被反向。其次，颗粒不能保持在探询点，原因是在没有鞘液的情况下聚 焦丢失。再次，较短的通过时间限制了灵敏度和分辨率，这导致罕见事件检测困难并且耗 时。
[0006] 解决这些缺点的以前尝试不令人满意。可以增加样本流体中的颗粒浓度以补偿这 些缺点中的一些，但是这可能不总是可行的并且可能是成本很高的。同样地，可以增加探询 点处的光子通量以提取更多的信号，但是这可能常常光漂白（即，激发到非辐射状态）用于 生成信号的荧光团并且可能增加背景瑞利散射、拉曼散射和荧光。因此，需要用于流式细胞 计量术的新装置、系统、方法和计算机可读介质，其在避免或最小化这些缺点中的一个或多 个的同时，允许颗粒的高吞吐量分析以及快速高效的罕见事件检测。


【发明内容】

[0007] 根据在本申请中具体化的原理，提供了用于流式细胞计量术的新装置、系统、方法 和计算机可读介质，其在避免或最小化这些缺点中的一个或多个的同时，允许颗粒的高吞 吐量分析以及快速高效的罕见事件检测。
[0008] 根据本发明的实施例，提供了一种流式细胞计数器，其包括：（1)包括样本通道的 毛细管；（2)耦合至所述毛细管的至少一个振动产生换能器，所述至少一个振动产生换能 器被配置成产生声信号，所述声信号引起所述样本通道内的声辐射压力以声学地集中在所 述样本通道中的流体样本流内流动的颗粒；以及（3)包括紫光激光器和蓝光激光器的探询 源，所述紫光激光器和所述蓝光激光器被配置成与所述经声学集中的颗粒中的至少一些相 互作用以产生输出信号。
[0009] 根据本发明的另一个实施例，提供了一种流式细胞计数器，其包括：（1)毛细管， 被配置成允许包括颗粒的样本流体在其中流动；（2)第一聚焦机构，被配置成将所述样本 流体中的所述颗粒中的至少一些声学聚焦在所述毛细管内的第一区域中；(3)第二聚焦机 构，被配置成将包括所述至少一些经声学聚焦的颗粒的样本流体流体动力学地聚焦在所述 毛细管内位于所述第一区域下游的第二区域中；(4)在所述毛细管中或下游的探询区，所 述经声学和流体动力学聚焦颗粒中的至少一些可以流动通过所述探询区；以及（5)至少一 个检测器，被配置成检测在所述探询区获得的关于所述经声学和流体动力学聚焦的颗粒中 的至少一些的至少一个信号。
[0010] 根据本发明的另一个实施例，提供了一种使用流式细胞计数器检测罕见事件的方 法，包括：（1)使包括颗粒的样本流体流入通道；（2)通过将声辐射压力施加到包含在所述 通道内的第一区域而将所述样本流体中的所述颗粒的至少一些声学聚焦在所述第一区域 中；（3)通过使鞘液围绕所述样本流体流动而将包括所述至少一些经声学聚焦的颗粒的样 本流体流体动力学地聚焦在位于所述第一区域下游的第二区域中；(4)调节所述鞘液与所 述样本流体的容积比以保持位于所述第二区域内或下游的探询区中的大致恒定的总颗粒 速度；(5)分析所述探询区中的所述经声学和流体动力学聚焦的颗粒中的至少一些；以及 (6)基于在所述探询区检测到的至少一个信号检测一个或多个罕见事件，所述一个或多个 罕见事件选自下列：一个或多个罕见荧光事件、一个或多个罕见细胞类型以及一个或多个 死亡细胞。
[0011] 在附图和以下描述中阐述了本发明的这些和其它实施例的附加细节，其仅仅是示 例性的和解释性的并且不以任何方式限制本发明。本发明的其它实施例、特征、目的和优点 将从描述和附图并且从权利要求中显见。

【专利附图】

【附图说明】
[0012] 包含在说明书中并且形成说明书的一部分的附图示出了本发明的一个或多个实 施例，并且与描述一起用于解释本发明的各实施例的原理。附图仅仅是示例性的和解释性 的并且不应当被理解为以任何方式限制或约束本发明。
[0013] 图1示出了平面和线驱动毛细管聚焦的比较。
[0014] 图2A和2B示出了线驱动声学聚焦装置。
[0015] 图3示出了流动越过线驱动声学聚焦装置中的层流线的经声学聚焦的颗粒。
[0016] 图4A和4B示出了声学聚焦装置中的经声学再定向的层流。
[0017] 图5A-5C示出了声学聚焦装置中的微米级聚苯乙烯荧光橙色/红色颗粒与纳米级 绿色颗粒的背景的分离。图?示出了流动越过声学聚焦装置中的层流线的声学聚焦颗粒。
[0018] 图6A-6C示出了越过层流边界的颗粒的声学分离。
[0019] 图7A-7C示出了若干声学聚焦装置。
[0020] 图8示出了与声学流式细胞计数器组合的声学聚焦流动室的示意图。
[0021] 图9示出了声学聚焦系统的流程图。
[0022] 图10示出了修改成包括线内分层冲洗的图9的示图。
[0023] 图11示出了分层冲洗流体的声学聚焦。
[0024] 图12示出了并行流体声学切换装置的示意图。
[0025] 图13A和13B示出了未溶解全血的切换的示意图。
[0026] 图14示出了声学流切换颗粒计数装置的示意图。
[0027] 图15示出了阴性对比载体颗粒与血液样本核心的分离。
[0028] 图16示出了声学冲洗系统中的多路免疫测定。
[0029] 图17示出了使用声学聚焦的高吞吐量筛选的流程图。
[0030] 图18示出了使用声学冲洗的双室培养/收获皿。
[0031] 图19A-19C示出了来自库的适体选择。
[0032] 图20示出了双级声学阀分拣器。
[0033] 图21A和21B示出了经声学再定位的颗粒和介质的光学分析。
[0034] 图22示出了具有不同参数的颗粒分组的示图。
[0035] 图23示出了由成像器成像的经声学再定位的颗粒。
[0036] 图24示出了颗粒的声学融合。
[0037] 图25示出了颗粒的声学聚焦和分离。
[0038] 图26A-26F示出了使用各种激光器和灵敏度设置在非声学流式细胞计数器上和 在声学聚焦细胞计数器上运行的荧光微球的比较输出绘图。
[0039] 图27A和27B是直方图绘图，示出了与声学细胞计量术关联的通过时间的8倍增 加对细胞周期分析的影响。
[0040] 图28A是细胞被声学集中以形成在声学细胞计数器中流动的绳状结构的血液的 照片。图28B是细胞被声学集中在声学细胞计数器中的单行线中的更为稀释的血液的照 片。
[0041] 图29是光谱图，显示了紫光激发荧光团PacificBlue?的激发和发射光谱。
[0042] 图30示出了将0. 07%⑶34阳性细胞的罕见事件群体检测作为活⑶45阳性细胞 的亚群。
[0043] 图31A和31B分别显示了声学聚焦系统中和单独流体动力学聚焦系统中的溶解全 血的FSC相对于SSC的绘图。
[0044] 图32A和32B显示了使用与图31A和31B中相同的系统和参数获得的Jurkat细 胞的FSC相对于SSC的绘图。
[0045] 图33示出了声学流式细胞计量系统的示意图。
[0046] 图34示出了声学流式细胞计数器中的声学聚焦毛细管的示意图。
[0047] 图35示出了声学流式细胞计数器中的光学收集块的一部分。
[0048] 图36示出了声学流式细胞计数器中的光学数据收集块的示意图。
[0049] 图37示出了声学流式细胞计数器中的射流系统的示意图。
[0050] 图38示出了具有下游流体动力学聚焦的单换能器声学聚焦毛细管的示意图。
[0051] 图39示出了可以调节声学流式细胞计数器中的前向散射孔径的阻挡杆装置的示 意图。
[0052] 图40A-40F示出了将0. 050%和0. 045%⑶34阳性细胞的罕见事件群体检测作为 活⑶45阳性细胞的亚群。
[0053] 图41A-41D示出了在非声学流式细胞计数器上和声学聚焦细胞计数器上运行的 细胞检测的比较输出绘图。
[0054] 图42示出了声学聚焦细胞计数器的各部件的示意图。
[0055] 图中的相似标记指示相似元件。

【具体实施方式】
[0056] 当在本文中使用时，"声学对比度"表示两对象的材料性质在用声辐射压力操纵其 位置的能力方面的相对差异，并且例如可以包括密度和压缩率的差异；"测定"表示用于探 询一个或多个颗粒或一个或多个流体的方法；"测定物"表示产品，例如包括测定套件、数据 和/或报告；"流动室"表示通道、室或毛细管，具有选自矩形、方形、椭圆形、扁圆形、圆形、 圈形（round)、八边形、七边形、六边形五边形和三角形的内部形状；并且"通道"表示至少 具有入口并且优选地具有出口的路线、路径或管道，其可以包含一定量的流体，并且具有选 自矩形、方形、椭圆形、扁圆形、圆形、圈形、八边形、七边形、六边形五边形和三角形的内部 形状。
[0057] 当在本文中使用时，"声学聚焦"、"经声学聚焦"、"经声学聚焦的"以及"经声学聚 焦地"表示借助于声场定位流动室内的颗粒的动作。颗粒的声学聚焦的例子是沿着通道 的轴线对准颗粒。颗粒所在的聚焦区域的空间范围可以由流动室几何形状、声场和声学对 比度确定。在流动室的横截面中观察，观察到的聚焦区域的形状可以类似于规则几何形状 (例如点、线、弧、椭圆等）或者它可以是任意的。用于定位对象的主要的力是声辐射压力。
[0058] 当在本文中使用时，"声学再定向的"和"声学再定向"表示用声辐射压力再定位装 置内的流体或介质的可混溶、部分可混溶或不可混溶层流的位置的动作。该技术利用的是 流动通道中的独立层流的机械性质（声学对比度）的差异。当使两个流体接触时，会由于 它们的分子组成的差异而存在大浓度梯度，导致界面密度和/或压缩率梯度（各流之间的 声学对比度）。在声场的作用下，各个流可以基于其声学对比度在流动室内再定向。
[0059] 当在本文中使用时，"颗粒"表示物质的小单位，例如包括生物细胞（例如真核细胞 和原核细胞）、古生菌、细菌、霉菌、植物细胞、酵母菌、原生动物、变形虫、原生生物、动物细 胞；细胞器；有机/无机元素或分子；微球；以及不可混溶流体的小滴（例如水包油）。
[0060]当在本文中使用时，"分析物"表示待分析的物质或材料；"探针"表示物质，其有标 签或以另外方式被标记并且用于检测或识别流体或样本中的另一种物质；"靶部"表示探针 的结合部分；并且"试剂"表示已知以特定方式反应的物质。
[0061] 当在本文中使用时，"微球"或"小珠"表示具有声学对比度的颗粒，其可以与球形 一样是对称的、与哑铃形一样是不对称的或者是不具有对称性的大分子。微球或小珠的例 子例如包括硅石、玻璃和中空玻璃、乳胶、硅橡胶、聚合物，例如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲 酯、聚亚甲基三聚氰胺、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈、聚（偏二氯乙烯共丙烯腈）和聚交酯。
[0062] 当在本文中使用时，"标签"表示可识别物质，例如染料或放射性同位素，其被引入 系统（例如生物系统）中并且可以跟随流动室或通道的路线，提供关于流动室或通道中的 颗粒或靶部的信息；并且"信号分子"表示可识别物质，例如染料或放射性同位素，其被引入 系统（例如生物系统）中并且可以用作颗粒的信号。
[0063]图1示出了根据本发明的示例性实施例的平面驱动和线驱动毛细管聚焦的比较。 在平面聚焦103/105中，可能包括一个或多个罕见事件颗粒的颗粒102可被聚焦为二维片 并且具有沿着流动方向的可变速度（参见不同箭头）。在线驱动毛细管聚焦107/109中，颗 粒102可被聚焦到毛细管的中心轴线并且具有沿流动方向的共同速度。毛细管可以具有例 如圆形、扁圆形或椭圆形横截面。作为替换，颗粒102也可被聚焦到毛细管内的另一轴线或 沿着毛细管的壁。
[0064]图2A和2B示出了根据本发明的示例性实施例的线驱动声学聚焦装置的侧视图和 轴视图。可能包括一个或多个罕见事件颗粒的颗粒203可以使用换能器205被声学聚焦到 管201 (例如可以是圆柱形管）的中心209中的压力最小值。颗粒203可以形成单线轨迹 211，其可以允许具有类似尺寸和声学对比度的颗粒的均匀停留时间，这又可以允许颗粒的 _吞吐量系列分析而不损害灵敏度和分辨率。
[0065]图3示出了流经根据本发明的示例性实施例的线驱动声学聚焦装置中的层流线 的经声学聚焦的颗粒。可能包括一个或多个罕见事件颗粒的颗粒305可以使用换能器303 从样本流309被声学聚焦到线驱动毛细管301中的流动流体/冲洗流315的中心307。颗 粒305可以越过层流线移动并且于是可以作为单行线移动并且在分析点311处被分析。 [0066] 图4A和4B示出了根据本发明的示例性实施例的声学聚焦装置中的声学再定向层 流。在图4A中，没有声场并且层流403和407彼此平行地在声驱动毛细管401中流动。在 图4B中，声场由换能器405施加并且因此流403和407可以基于它们的声学对比度被声学 再定向。具有较大声学对比度的流403b可以被再定向到毛细管401的中心，而具有较低声 学对比度的流407b可被再定向为靠近毛细管401的壁。如果在偶极模式中启动声场，则流 403b与毛细管401的中心轴线重合地移动，部分地移位流407b，如图4B中所示。流可以是 不可混溶的、部分可混溶的或可混溶的。大浓度梯度可能由于它们的不同分子组成而存在 于流之间。为了声压力，浓度梯度可以被视为密度和/或压缩率梯度，并且流可以被视为可 以用声辐射压力作用的具有不同密度和压缩率（声学对比度）的孤立实体。
[0067]图5A-5C示出了根据本发明的示例性实施例的声学聚焦装置中的微米级聚苯乙 烯荧光橙色/红色颗粒与纳米级绿色颗粒的背景的分离。图?示出了流动越过根据本发 明的示例性实施例的声学聚焦装置中的层流线的经声学聚焦的颗粒。分离可以基于尺寸和 声学对比度，原因是时间平均声力与颗粒的体积成比例。如果中心冲洗流具有比外部样本 流更高的特定比重和/或更低的压缩率，则初始在具有比中心冲洗流更大的声学对比度的 外部样本流中的颗粒将继续聚焦到毛细管轴线，而较小对比度的颗粒将被排除。图5A显示 了当声场关闭时与绿色200nm颗粒混合的红色5. 7ym颗粒在落射荧光照明下流动通过毛 细管。图5B显示了当声场打开时5.7pm颗粒（其在蓝光照明下发出黄色荧光）被声学聚 焦到中心线，而200nm颗粒保持在它们的初始流中。图5C显示了 5. 7iim颗粒在具有红色带 通滤光器的绿光照明下发出红色荧光，而200nm颗粒未被激发。图?示出了在同轴流505 的旁边引入的清洁核心流507，所述同轴流包含在毛细管501中流动的荧光背景流体。当换 能器503产生声驻波（未显示）时，可能包括一个或多个罕见事件颗粒的颗粒509可以被 声学聚焦并且从同轴流505移动到核心流507,在那里它们以单行朝着分析点511流动。 [0068]图6A-6C示出了越过根据本发明的示例性实施例的层流边界的颗粒的声学分离。 介质或流体可被声学再定向，同时可能包括一个或多个罕见事件颗粒的介质或流体中的颗 粒可被声学操纵或聚焦。图6A显示了当声场关闭时耦合到250ym声学聚焦室609的端 部的光室的荧光图像。白线601和611指示流动室的边缘。掺有25iig/ml的藻红蛋白 (R-Phycoerythrin)荧光蛋白（橙色荧光）的PBS缓冲液中的10%全血的混合物流动通过 流动室的下半部605(白血细胞DNA用SYTOX?绿色染色）；在上半部603的是6%碘 克沙醇（i〇dixan〇l)PBS缓冲液（暗）。图6B显示了当声场打开时，PBS缓冲液中的6%碘 克沙醇被声学再定向到中心613,血液/PBS缓冲液/藻红蛋白混合物朝着室侧（图中的顶 部和底部）被声学再定向，并且白血细胞离开它们的初始介质并且被声学聚焦到中心，在 那里它们显示为绿线（红血细胞类似地被声学聚焦，但是在荧光图像中不可见）。图6C示 出了比背景密度更大/压缩率更小的颗粒的近似声力势（AcousticForcePotential)的 MATLAB绘图617。密度较大、压缩率较小的颗粒/介质（例如细胞和碘克沙醇/PBS缓冲 液）朝着中心被声学聚焦/声学再定向（暗蓝区域、势最小），而密度较小和/或压缩率较 大的介质（例如血液/PBS缓冲液/藻红蛋白混合物）朝着左侧和右侧被声学聚焦/声学 再定向（暗红区域、势最大）。如果密度较低（和/或压缩率较高）的样本流沿着大致圆柱 形毛细管的轴向中心流动并且密度较高（和/或压缩率较低）的流邻近它流动，则各个流 将被声学再定向到与图6C中所示的势一致（尚未在平面系统中证明或报告的特征）。 [0069]图7A-7C示出了根据本发明的示例性实施例的若干声学聚焦装置。图7A显示了 流式细胞计量系统700a，其中包括颗粒712 (可能包括一个或多个罕见事件颗粒）的样本 715a和冲洗缓冲液713a被引入毛细管703。线驱动器701 (例如，PZT驱动器或能够产生 声驻波的其它机构）在用户定义模式（例如偶极模式）下引入声驻波（未显示）。因此， 样本715a和冲洗缓冲液713a可以被声学再定向（如715b和713b)并且颗粒712可以基 于它们的声学对比度被声学聚焦（如717)。照明源709(例如激光器或一组激光器，或任 何合适的照明源，例如发光二极管）在探询点716照明颗粒717。照明源可以是紫光激光 器（例如405nm激光器）、蓝光激光器（例如488nm激光器）、红光激光器（例如640nm激 光器）或它们的组合。来自被测样本的光信号719可以由检测器或检测器阵列705(例如 PMT阵列、光电倍增管、雪崩光电二极管（APD)、多像素APD装置、硅PMT等）检测。图7B显 示了流式细胞计量系统700b，其中清洁流713a可以独立地流动通过光室。可能包括一个或 多个罕见事件颗粒的颗粒702可以被声学聚焦以如线717流动，样本缓冲液715b可以被丢 弃到废物721，并且线717可以传递到第二声波引起机构714。图7C显示了流式细胞计量 系统700c，其中样本715a可被喷射为稍偏向中心的一侧并在毛细管壁703附近流动，同时 缓冲液713a贴靠相对壁流动。换能器701可以声学再定向样本715a(如715b)，可以声学 聚焦可能包括一个或多个罕见事件颗粒的颗粒702 (如714/717)，并且可以声学地再定向 缓冲液713a。
[0070]图8示出了与根据本发明的示例性实施例的用于声学定向颗粒和流的声学流式 细胞计数器组合的声学聚焦流动室的示意图。包括颗粒803、807和809且可能包括一个 或多个罕见事件颗粒的样本801被引入包含换能器811的流动室810,所述换能器将颗粒 803、807和809声学聚焦为在收集/培育部位819收集的颗粒815。来自冲洗容器802的 冲洗或其它试剂805作为侧向离开的背景流813被引入流动室810。另一冲洗流821从冲 洗容器817引入具有声场发生器822的聚焦细胞计数器850的流动室810b中，在进入另一 个流动室851中的入口 829之前所述声场发生器将颗粒823声学聚焦为颗粒825/827。在 由探询光833在探询点852进行探询之前换能器831还将颗粒825/827声学聚焦为颗粒 832。在收集点837收集被测量颗粒之前，来自被探询颗粒的信号854被发送到检测器835 进行分析。
[0071] 图9示出了根据本发明的示例性实施例的声学聚焦系统的流程图。在步骤901中， 包括颗粒的样本被收集并且引导到可控流动泵。在步骤903中，可控流动泵将样本泵送到 声学聚焦设备。在步骤905中，声学聚焦设备将可能包括一个或多个罕见事件颗粒的颗粒 中的至少一些聚焦成线或平面，并且然后将颗粒引导到探询区进行光学激发和检测。在步 骤907中，光学激发颗粒中的至少一些并且检测来自激发颗粒的至少一些信号，并且随后 引导颗粒进行进一步分析或者引导到废物或进行某些其它处理。在步骤909中，可以由更 长通过时间数据收集和分析部分进一步分析颗粒。在步骤911中，颗粒可以由废物或附加 处理部分提取为废物或者受到附加处理。可控泵可以为颗粒的期望线速度而被调节到期望 颗粒流率，其可以在例如大约〇m/s至大约10m/s、大约Om/s至大约0. 3m/s或大约0. 3m/s 至大约3m/s的范围内。激发/检测可以是脉动的或经调制的，并且可以使用在模拟/数字 电子学和/或光学中已知的任何合适的激发/检测方法进行，包括使用瑞利散射检测器。
[0072] 颗粒速度的控制具有许多优点。首先，它可以通过增加由荧光/发光标签发出的 光子的数量来改善信号，原因是标签可以被照明更长时间。在〇. 3m/s的线速度下，光子的 数量可以增加大约10倍并且然后当使用声学聚焦时每秒可以分析大约3, 000个颗粒（假 设颗粒中心之间的平均距离为100微米）。并且在0. 03m/s的线速度下，该数量可以增加大 约100倍并且每秒可以分析300个颗粒。其次，典型地由于快速通过时间在常规流式细胞计 量术中不使用的标记物（例如镧系元素、镧系元素螯合物、使用铕的纳米颗粒、半导体纳米 晶体（例如量子点）、诸如细胞染色剂和台盼蓝的吸收性染料等可以变得可使用。再次，其 它标记物（例如具有长寿命和/或低量子产率/消光系数的荧光团或发光团；多数化学-生 物发光物种；寿命大于大约l〇ns、在大约10nm至大约liis之间、在大约liis至大约10iis 之间、在大约10Us至大约100iis之间和在大约100iis至大约lms之间的标签）可以受 益于减小光漂白的更低激光功率并且受益于通过线速度的控制成为可能的更长通过时间。 对于例如l〇ms的通过时间，在每秒一千次的速率以10ys脉冲进行的脉冲调制允许激发和 发光收集的10个周期，其中实际上例如铕螯合物的所有发光衰减可以被监测。在该脉冲速 率下若没有通过本发明的实施例提供的线速度的控制而成为可能的更长通过时间的益处， 90%或以上的颗粒可能在未被探询的情况下通过。如果脉冲速率增加到100kHz并且具有 1Us脉冲，则可能仍然有将近9ys监测镧系元素发光（原因是多数荧光团具有l-2ns寿命 并且多数自发荧光在l〇ns内衰减）。
[0073] 图10示出了根据本发明的示例性实施例的修改成包括线内分层冲洗的图9的示 图。在步骤1001中，包括颗粒的样本被收集并引导到可控样本流动泵。在步骤1005中，可 控样本流动泵将样本泵送到声学装置1019的分层冲洗装置部分中（其可以基于颗粒和流 体的声学聚焦和/或再定向）。与此同时，在步骤1003中，冲洗流体被收集并引导到可控 冲洗流体泵。在步骤1007中，可控冲洗流体泵将冲洗流体泵送到分层冲洗装置中。在步骤 1009中，分层冲洗装置线内冲洗样本/颗粒。在步骤1011中，收集清洁流体，并且然后将 可能包括一个或多个罕见事件颗粒的已冲洗样本/颗粒引导到探询区以进行光学激发和 检测。在步骤1013中，光学地激发颗粒中的至少一些，检测来自经激发的颗粒的至少一些 信号，并且然后引导颗粒进行进一步分析或将其引导到废物或进行某些其它处理。在步骤 1015中，所述颗粒可由更长通过时间数据收集和分析部分进一步分析。在步骤1017中，所 述颗粒可由废物或附加处理部分提取为废物或者受到附加处理。
[0074] 图11示出了根据本发明的示例性实施例的分层冲洗流体的声学聚焦。包含颗粒 1109 (可能包括一个或多个罕见事件颗粒）的样本连同分层冲洗流体1107 -起被引入平面 声学流动室1101中。换能器1103基于声学对比度生成声波1105,所述声波将颗粒1109声 学聚焦到穿过节点1111的轨迹。平面声学流动室1101也可以具有位于外部的声学节点， 在该情况下颗粒1109可以声学聚焦到流动室的顶部。
[0075] 图12示出了根据本发明的示例性实施例的并行流体声学切换装置的示意图。包 含第一颗粒1202和第二颗粒1204 (可能包括一个或多个罕见事件颗粒）的第一、最外侧样 本介质1205被引入毛细管1201。第二、中间介质1213连同第三、最内侧介质1209 -起被 引入毛细管1201。线驱动器1203可以声学地再定向第一、第二和第三介质并且可以基于它 们的声学对比度而声学聚焦第一颗粒和第二颗粒。所述颗粒然后可以流到毛细管之外。当 切换时，颗粒中的一些可以从第一介质穿过第二介质（其可以是试剂流）声学聚焦到第三 介质，或者它们可以从第二介质声学聚焦到第三介质。
[0076] 图13A和13B示出了根据本发明的示例性实施例的未溶解全血的切换。血液样本 1309和冲洗缓冲液1307在不同位置被引入毛细管1302。当启动换能器1304时，可能包括 一个或多个罕见事件红/白血细胞的红血细胞1303和白血细胞1305被声学聚焦，并且样 本1309和冲洗缓冲液1307被声学再定向。由于它们的数量较小，所以白血细胞在经聚焦 血液的绳状结构中保持分离。
[0077] 图14示出了根据本发明的示例性实施例的声学流切换颗粒计数装置的示意图。 所述装置1400允许与未知或不可用导电缓冲液1403 -起流动的具有颗粒1409 (可能包括 一个或多个罕见事件颗粒）的样本1405的线内分析。颗粒1409可以使用换能器1407声 学聚焦到缓冲液1403,而样本介质可以在废物出口 1411被丢弃。当颗粒移动经过第二换能 器1413到达具有孔径大小1419b的检测点1419时颗粒可以由检测电极1415处的信号的 任何合适的电子检测器1417分析并且计数。
[0078] 图15示出了根据本发明的示例性实施例的阴性对比度载体颗粒与血液样本核心 的分离。其中，换能器1507可以声学聚焦可能包括一个或多个罕见事件颗粒的阴性对比度 载体颗粒1505,这些颗粒1505从初始包括它们和血细胞1503的血液核心样本1511横越血 液核心样本1511和清洁缓冲液1513之间的界面1502,朝着毛细管壁1501移动。在其它声 学模式中，血细胞1503可以被驱动到壁，而阴性对比度载体颗粒1505可以被驱动到中心轴 线。
[0079] 图16示出了根据本发明的示例性实施例的声学冲洗系统中的多路免疫测定。在 声学冲洗系统1600中，可以通过使分析物1609/1611/1613在中心流1607中流动并且将预 先结合有荧光抗原的小珠1603/1605/1621从外部流1601推入中心流1607中而快速地执 行竞争免疫测定。特定化学制品可被置于在单反应容器中混合并且在流动中处理的每个群 体上。离开容器的群体1615(可能包括一个或多个罕见事件群体）可以在分析点1617经 由尺寸和或荧光颜色和/或荧光而加以区分。
[0080] 图17示出了根据本发明的示例性实施例的使用声学流体的高吞吐量筛选的流程 图。在步骤1701中，可能包括一个或多个罕见事件颗粒的细胞/小珠型颗粒被收集和/或 培养以供试验。在步骤1703中，用感兴趣的标签和/或药物候选培育这些颗粒并将其引 导到声学聚焦器/流切换器。与此同时，在步骤1709中，（一种或多种）其它药物和/或 (一种或多种）附加反应物可以被引入声学聚焦器/流切换器。在步骤1705中，声学聚焦 器/流切换器聚焦和/或切换颗粒和/或流，并且可以使颗粒从过量的药物/配体中分离。 在步骤1707中，立即或在附加切换之后使用声学聚焦器/流切换器收集清洁流体。在步骤 1711中，可以识别和/或分拣颗粒。然后，在步骤1713中，可以将不需要的颗粒送往废物， 并且在步骤1715中，可以将选定颗粒送往附加分析或处理。在步骤1717中，可以执行包括 药物结合的确定、闪烁计数、存活/凋亡确定和基因表达分析的附加处理。
[0081]图18示出了根据本发明的示例性实施例的使用声学冲洗的双室培养/收获皿。其 中，可能包括一个或多个罕见事件细胞的细胞在室1801中培养并且可被定期发送以声学 聚焦到通道1805中，在那里它们可由光学检测器1817检查细胞密度/生长。当满足生长 目标并且室1801中的培养基用完时，可以启动阀以允许来自容器1803的新鲜培养基沿着 通道1805流动并且在室1811中收获用过的培养基。细胞然后可被声学聚焦到新鲜培养基 中并被转移到第二培育室1809。于是可以反向重复相同过程，以使得细胞在室1809中培养 并被转移到室1801内的新鲜培养基中。
[0082] 图19A-19C示出了根据本发明的示例性实施例的来自库的适体选择。图19A显示 了具有用适体库1901培育的靶分子的多重小珠/细胞1903。图19B示出了使用线内声学 介质切换使小珠/细胞1903和1907从未结合适体1904分离。可以调节冲洗核心（中心 圆）的盐和/或pH以选择更高亲和力适体，并且可以执行连续冲洗以增加纯度。图19C示 出了经分选的小珠1911。
[0083] 图20示出了根据本发明的示例性实施例的允许罕见细胞群体的线内非稀释高速 分选的双级声学阀分选器。其中，包括颗粒2007的样本被引入声学阀分选器2000的部分 2001。第一换能器2002引起通道2004中的声波，并且探询源2013在探询点2006探询颗 粒2007。在分选点2009检测到的不需要的颗粒可以被引导通过废物阀2010a，而选定颗粒 可以沿着通道2004被引导到下游处理2011以供第二换能器2002进一步聚焦、由光源2015 探询并且对于不需要的颗粒朝着废物阀2010b适当地分选或者对于选定颗粒2019从通道 2004离开。对于罕见细胞，上述分选提供捕获感兴趣细胞的高速初始阀分选，因此增加了分 选部分中的期望细胞的比率。随后，上述分选可以在更低速率下再次进行以用于提高纯度。 如果例如以每秒30, 000个细胞的速率分析细胞并且阀分选能够以每秒300个细胞的速度 进行分选，则每个初始分选决定应当包含平均大约100个细胞。如果这些100个细胞随后 以更慢的流速转移到第二分选器（或在初始分选之后的相同分选器），则可以显著地纯化 感兴趣的细胞。
[0084] 图21A和21B示出了根据本发明的示例性实施例的声学再定位颗粒和介质的光学 分析。其中，样本2103中的颗粒2102 (可能包括一个或多个罕见事件颗粒）基于声学对比 度由线驱动器2105声学聚焦（作为颗粒2115)。颗粒2115进入光室2117并且探询源2111 探询这些颗粒。检测器阵列2107随后收集来自每个颗粒的光信号2113,并且如果信号满足 某个用户确定的标准，则相应颗粒（或颗粒组）由光源2119 (例如闪光LED(宽带或UV)) 照明并且由成像器2109成像。在图21A中，不采集图像并且颗粒2125的流速2129保持不 变。然而在图21B中，颗粒2125的流速2127减小到适合于所需成像分辨率的值以采集颗 粒的图像。
[0085] 图22示出了具有不同参数的颗粒分组的示图，所述参数例如可以在如图21A和 21B中所示的系统中被分析。颗粒组2202内的每个颗粒关于参数1和参数2(各自例如可 以是前向散射、侧向散射或荧光）是类似的。用户定义的阈值2201基于参数1和参数2的 值识别满足该阈值的用于成像的颗粒。如果颗粒满足用户定义的阈值，则流动可以减小到 合适速率以供成像器捕获颗粒的焦内图像。也可以建立其它检测阈值2205、2209和2215。 当然，不需要成像每个颗粒。相反地，可以构造来自选通亚群的颗粒的采样矩阵以基于它们 的散射和荧光标记来限定待捕获的一组颗粒图像，这可以允许高颗粒分析速率（例如超过 每秒2000)。图像可以捕获细胞形态、定向和内部结构（例如细胞核的位置和数量），并且 可使用本领域中已知的任何合适的成像装置获得，包括电子CCD摇拍技术。成像可以相对 较慢（达300细胞/秒），但是更慢的流动可以允许保持高灵敏度的长探询时间并实现良好 的空间分辨率（达0. 5微米）。
[0086] 图23示出了根据本发明的示例性实施例的由成像器成像的声学再定位颗粒。它 显示了从声学再定向流2305捕获的血细胞2303的照片，其中为了血细胞2303的焦内图像 捕获而减慢光室2307中的流。为创建图像，例如内径410iim的线驱动毛细管可以用光室 (其例如可以是具有内部圆柱形通道的硼硅玻璃立方体，所述内部圆柱形通道具有与线驱 动毛细管的内径相同的直径）截断。激发频率为大约2. 1MHz并且声学装置的功耗为125 毫瓦。线驱动毛细管可以在超过5ml/min的容积流速下产生5ym乳胶颗粒和血细胞的精 细聚焦。线驱动毛细管可以附连到方形横截面石英光室。光室的内腔可以在横截面上为圆 形，并且可以具有与线驱动毛细管相同的内径以延长流体柱的共振条件并且由此将声学聚 焦力延伸到光室中。
[0087] 图24示出了根据本发明的示例性实施例的颗粒的声学融合。包含第一颗粒类型 的第一样本2401被泵送通过由PZT换能器2404驱动的第一声学聚焦器2402并且所述颗 粒被声学聚焦成线2408。包含第二颗粒类型的第二样本2403类似地被泵送并且聚焦成由 PZT换能器2407驱动的第二声学聚焦器2405中的线2409。样本流动到由PZT换能器2411 驱动的第三声学聚焦器2410中使得颗粒的线被聚焦以形成颗粒可以相互作用的单线。在 下游，颗粒穿过使用融合颗粒2412的电极2413产生的电场，可能形成一个或多个罕见事件 颗粒。
[0088] 图25示出了根据本发明的示例性实施例的颗粒的声学聚焦和分离。可能包括一 个或多个罕见事件颗粒的颗粒2503移动到第一声学聚焦器2505,所述第一声学聚焦器用 第一换能器2507将它们聚焦成单行线2509。线2509随后可以被给馈入基于尺寸和声学性 质中的一个或多个进行分离和收集的声学分离器2513中，所述声学分离器配备有第二换 能器2512和多个出口 2519a、2519b和2519c。当进入声学分离器2513中时可以通过拉走 流体或以另外方式例如通过侧向通道2511去除流体而调节线2509的位置。
[0089] 根据本发明的示例性实施例，通过使用能够控制颗粒速度并且允许长通过时间的 声学流式细胞计数器执行这样的测定，如本文中所述，可以减小对单个患者的血液进行测 定的临床免疫表型板中的测定量，这可以增加一次测定的标记物的数量。可以一次执行例 如4、6或更多抗体的更大无补偿板。例如，在AIDS进展监测中用于T细胞的CD4阳性枚举 的anti-⑶45、⑶4和⑶8抗体的板中，例如可以加入或代用⑶3以有助于识别T细胞。可 以使用蓝色（例如488nm)和红色（例如635nm)激光细胞计数器进行测定，每个抗体具有 不同的荧色物（例如FITC、PE、PE-Cy5和APC)。例如可以使用用于白血病/淋巴瘤分类 的许多四抗体测定组合，例如可以包括（1)⑶3、⑶14、HLADr和⑶45 ; (2)⑶7、⑶13、⑶2和 CD19 ;(3)CD5、Lambda、CD19 和Kappa; (4)CD20、CDllc、CD22 和CD25 ; (5)CD5、CD19、CD10 和CD34;以及（6)CD15、CD56、CD19 和CD34。此外，在Sutherland等人的"Enumerationof CD34+HematopoieticStemandProgenitorCells，'，CurrentProtocolsinCytometry, 6. 4. 1-6. 4. 23(2003)中描述的方案可以有利地用于本文中所述的本发明的示例性实施例 中的一个或多个，上述文献通过引用完整地被合并于本文中。
[0090] 也可以使用用于白血病/淋巴瘤分类的许多六抗体测定组合，包括表1中所示的 例子（左列指示测定编号并且顶栏指示用于每个抗体的荧色物；从左到右在其相应的荧色 物标记物之下列出了每个抗体的特异性）。通过用长寿命试剂和窄带试剂代替荧色物，最小 补偿抗体板是可能的。在表2中显示了可以实现不需要补偿控制的最小补偿结果的标记物 的更多几个例子。测定例如可以使用405nm和635nm脉冲二极管激光器。
[0091]表1

【权利要求】
1. 一种使用流式细胞计数器检测罕见事件的方法，所述流式细胞计数器包括： 包括样本通道的毛细管； 耦合至所述毛细管的至少一个振动产生换能器，所述至少一个振动产生换能器被配置 成产生声信号，所述声信号引起所述样本通道内的声辐射压力以声学集中在所述样本通道 中的流体样本流内流动的颗粒； 包括紫光激光器和蓝光激光器的探询源，所述紫光激光器和所述蓝光激光器被配置成 与经声学集中的颗粒中的至少一些相互作用以产生输出信号； 光学模块，用于收集来自所述探询源的输出信号； 检测器模块，用于检测所述光学模块的输出信号；以及 数据采集模块，用于处理所述检测器模块的输出， 其中所述光学模块包括收集来自所述探询源的输出信号的收集透镜，并且其中所述收 集透镜的输出用空间滤光针孔装置分成两个光束，其中第一光束是来自所述紫光激光器的 输出而第二光束是来自所述蓝光激光器的输出， 所述方法包括： 使包括颗粒的样本流体流入通道； 通过将声辐射压力施加到包含在所述通道内的第一区域而将样本流体中的颗粒的至 少一些声学聚焦在所述第一区域中； 通过使鞘液围绕所述样本流体流动而将包括所述至少一些经声学聚焦的颗粒的样本 流体流体动力学地聚焦在第一区域下游的第二区域中； 调节所述鞘液与所述样本流体的容积比以保持处于第二区域内或下游的探询区中的 大致恒定的总颗粒速度； 分析所述探询区中的经声学和流体动力学聚焦的颗粒的至少一些；以及 基于在所述探询区检测到的至少一个信号检测一个或多个罕见事件，所述一个或多个 罕见事件选自下列：一个或多个罕见荧光事件、一个或多个罕见细胞类型、以及一个或多个 死亡细胞。
2. 根据权利要求1所述的方法，包括使样本流体以至少200微升每分钟的样本流速流 动并且使鞘液以至多2200微升每分钟的鞘液流速流动，并且其中调节所述鞘液与所述样 本流体的容积比包括将所述鞘液与所述样本流体的容积比调节到大约11比1至大约1. 4 比1之间的比率。
3. 根据权利要求1所述的方法，包括使样本流体以至少500微升每分钟的样本流速流 动并且使鞘液以至多1900微升每分钟的鞘液流速流动，并且其中调节所述鞘液与所述样 本流体的容积比包括将所述鞘液与所述样本流体的容积比调节到大约3. 8比1至大约1. 4 比1之间的比率。
4. 根据权利要求1所述的方法，包括保证所述经声学和流体动力学聚焦的颗粒通过所 述探询区的通过时间超过大约20微秒。
5. 根据权利要求1所述的方法，包括保证所述经声学和流体动力学聚焦的颗粒通过所 述探询区的通过时间超过大约40微秒。
【文档编号】G01N15/10GK104330346SQ201410492244
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2010年11月29日 优先权日:2009年12月4日
【发明者】G·卡达查克, M·D·沃德, J·A·布莱德弗德, A·T·G·帕克 申请人:生命技术公司