检测肿瘤标志物电致化学发光免疫传感器的制备及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种肿瘤标志物电致化学发光检测的传感器。该传感器的制备,包括以下步骤：在导电玻璃上用电聚合的方法合成聚苯胺；并按照现有方法制备出g-C3N4、银金核壳纳米球和氧化锌或氧化铜或二氧化锰；将g-C3N4用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺混合液做为连接剂连接到聚苯胺上，将一抗修饰在上述制备好的导电玻璃电极上；氧化锌表面覆盖银金核壳纳米球，将二抗修饰在包覆在氧化锌表面的银金纳米球上；利用电致化学发光检测。本发明的传感器特异性强，灵敏度高，操作简单，线性范围宽，检测限低。
【专利说明】检测肿瘤标志物电致化学发光免疫传感器的制备及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫标记物检测【技术领域】，更具体的说是一种电致化学发光免疫传感 器的制备，本发明还涉及采用所述的电致化学发光传感器检测肿瘤标志物的方法。
【背景技术】
[0002] -直以来，恶性肿瘤也就是癌症，是人类健康和生命安全的一个严重威胁。癌症细 胞，是指一些拥有分裂潜能的细胞在致癌因素的作用下发生了恶性转化和克隆性增生而产 生的一种新生物。并且癌细胞除了自身的生长失控外，还会侵入周围正常组织甚至可以经 由体内的循环系统或者淋巴系统转移到身体的其他部分，从而引起身体病变甚至死亡。所 以，癌症早期的诊断和及早的治疗具有重要的意义。但是癌症早期的抗原含量较低很难被 发现，低含量的抗原的测定成为了分析人员的重要追求。
[0003] 近年来，免疫分析是临床检验中一项重要的肿瘤疾病的诊治手段。免疫分析法是 利用抗体与抗原特异性结合反应检测各种物质，如药物、激素、蛋白质、微生物等的高选择 性生物化学方法。生物免疫分析技术具有灵敏性高、操作简单、成本低、特异性高、干扰小、 安全无毒和重现性好等特点。并可对大量样品进行常规分析，用于样品的定性筛选、定量测 定、确定样品中待测组分的含量。当前免疫分析检测方法几乎用在了所有的常用药品上，大 部分运用于药品残留的检测，随着分析技术的日趋完善，单克隆抗体、重组单链抗体，以及 免疫传感器和芯片技术的不断发展，该技术在食品安全、快速分析检测领域将发挥越来越 重要的作用。
[0004] 免疫分析包括非标记性免疫分析和标记性免疫分析。非标记免疫包括免疫扩散和 免疫电泳，是可溶性的抗原和相对应的抗体在溶液或凝胶中进行接触，从而形成一种不溶 性抗原-抗体复合物进行分离的技术。标记性免疫分析技术是采用光电物质、同位素或酶 等示踪物质来标记抗体或抗原进行抗原-抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物信号的 测定，从而达到对免疫反应进行监测的目的。标记性免疫分析技术包括放射免疫分析、酶联 免疫吸收分析、毛细管电泳化学发光免疫分析、高效液相色谱化学发光免疫分析、微流控芯 片化学发光免疫分析、电化学免疫分析、电致发光免疫分析、荧光免疫技术、胶体金免疫技 术和铁蛋白免疫技术等。但是这些免疫分析方法一般耗时较长并且拥有繁琐的加样、温育、 洗涤等操作过程，而且操作人员和免疫物质的接触较多，可能对操作的人员的身体健康造 成危害。而且有些测定速度快、灵敏度高、检测限低的检测手段需要仪器昂贵，不能在发展 中国家普及。
[0005] 基于以上技术，我们需要找一种廉价简单的操作方法，实现高灵敏度检测。导电玻 璃是一种相对较廉价的材料，我们将传感器建立在导电玻璃上，可以成为一种便携式的免 疫分析玻璃芯片，然后结合复合纳米材料的优点，可以实现对肿瘤标志物的高灵敏度低含 量检测。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供了一种灵敏度高、检测速度快、试剂用量少，检测 肿瘤标志物的电致化学发光传感器。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的：一种检测肿瘤标志物 的电致化学发光传感器的制备方法，其包括以下步骤： (1) 将导电玻璃切割成所需要的大小，并进行预处理； (2) 利用已有方法在ΙΤ0导电玻璃方形区域内聚合上聚苯胺，并合成g-C3N4、银金核壳 纳米球及金属氧化物，氧化物包括氧化锌、氧化铜、二氧化锰； (3) 羧基化g-C3N4，用连接剂1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基 丁二酰亚胺混合液将其固定在聚苯胺上，用于固定一抗； (4) 将银金核壳纳米球修饰在金属氧化物上，然后将二抗修饰在银金核壳纳米球上； (5 )将制作好的电致化学发光传感器结合电致化学发光仪对肿瘤标志物进行检测。
[0008] 本发明所述聚苯胺/ g_C3N4及金属氧化物/银金合金的制备包括以下步骤： (1) 将导电玻璃先被切成4 cmXl cm的长条，用乙醇、丙酮和二次水依次进行15 min 超声波洗漆，通过Adobe Illustrator制作用于凡士林印刷模板的模具，将凡士林涂在ΙΤ0 导电玻璃上的特定区域； (2) 聚苯胺的制备：聚苯胺的制备是通过电聚合制备的，由导电玻璃作工作电极、钼 电极作对电极，Ag/AgCl电极作参比电极组成的三电极体系中进行的，电解液由4. 00 mL 3 Μ的硝酸和0. 40 mL苯胺组成，在工作电极上所施加的电压以0. 1 V · ?Γ1的扫描速度 在-0. 2-1. 2 V之间循环，由此制得聚苯胺； (3) g-C3N4的制备：称取10 g三聚氰胺于坩埚中，在550 °C高温炉中灼烧4 h ; (4) 将（3)得到的g-C3N4置于盛有硝酸溶液的三口瓶中，冷凝回流24 h，然后离心洗涤 4次，最后溶于10 mL _次水中备用； (5) 在（2)制备的聚苯胺表面滴加连接剂溶液，然后取10 μ L (4)制备的g-C3N4滴加 到表面，用水洗掉未反应的g-C3N 4，室温下瞭干备用； (6) 银纳米球的制备：a溶液包括3mL乙二醇、90 mM硝酸银，b溶液包括3 mL乙二醇、 147 mM聚乙烯吡咯烷酮、0. 22 mM氯化钠；取一个三口瓶加入5mL乙二醇，加热至153°C，然 后将a、b两溶液同时逐滴缓慢的加入到三口瓶中，经过一系列的反应最后颜色变为黄色， 用丙酮和水分别离心洗涤，收集沉淀； (7) 将（6)制备好的银纳米球加入到3 mL含有聚乙烯吡咯烷酮的水中，加热到100 °C 并保持10 min，然后加入100 yL 1 %的氯金酸溶液，加热10 min至颜色稳定，然后用饱和 氯化钠清洗里面的氯化银，最后用水离心洗涤聚乙烯吡咯烷酮和氯化钠，将得到的银金核 壳纳米球分散到二次水中； (8) 本发明所涉及的金属氧化物包括氧化锌、氧化铜、二氧化锰，在不同的条件下制备 得到这三种金属氧化物； (9 )将（8 )得到的金属氧化物加入到（7 )的悬浮液中，搅拌反应24 h，二次水离心洗涤， 分散到1 mL二次水中，由此得到金属氧化物/银金核壳纳米球的悬浮液； (10)将二抗加入到（9)制备的悬浮液中反应30 min，最后用BSA封闭活性位点，由此 得到金属氧化物/银金核壳纳米球修饰二抗的复合粒子，将制备好的溶液保存在4 °C的冰 箱中待用； (11)在（5)制备好的电极上依次修饰上一抗、抗原、（10)得到的二抗复合粒子，在含有 硝酸的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光的检测。
[0009] 本发明中使用的洗涤溶液为pH 7. 4磷酸盐缓冲溶液。
[0010] 本发明所述肿瘤标志物为癌胚抗原、CA 125、前列腺蛋白抗原、人绒毛膜促性腺激 素、癌胚铁蛋白、胰癌胚抗原、细胞角蛋白、甲胎蛋白、酸性磷酸酶、儿茶酚胺类物质。
[0011] 本发明的有益效果： (1) 本发明利用电致化学发光的方法进行测定操作快速简单，反应及结果均由仪器自 动完成和记录，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性，便于现场检测； (2) 利用电聚合合成聚苯胺，起到连接导电玻璃和g-C3N4的作用，并且首次合成聚苯胺 /g_C 3N4可以增强导电性，减小阻抗，利于光电信号的传递； (3) 利用g-C3N4作为发光物质，具有较好的生物相容性，降低了发光物质对生物分析的 影响； (4) 利用金属氧化物/银金核壳纳米球来修饰二抗，可以提高二抗的含量，起到放大信 号的作用，增强灵敏性。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细描述。
[0013] 【图1】电极的制备及传感器的修饰过程。
【具体实施方式】
[0014] 一种检测检测免疫标记物的电致化学发光传感器的制备方法，其包括以下步骤： (1) 将导电玻璃切割成所需要的大小，并进行预处理； (2) 利用已有方法在ΙΤ0方形区域内聚合上聚苯胺，并合成g_C3N4、银金核壳纳米球及 金属氧化物，金属氧化物包括氧化锌、氧化铜、二氧化锰； (3) 羧基化g_C3N4，用连接剂将其固定在聚苯胺上，用于固定一抗； (4) 将银金核壳纳米球修饰在金属氧化物上，然后将二抗修饰在银金核壳纳米球上； (5 )将制作好的电致化学发光传感器结合电致化学发光仪对肿瘤标志物进行检测。
[0015] 本发明所述聚苯胺/g-C3N4、金属氧化物/银金和科纳米微球及传感器的制备包括 以下步骤： (1) 将导电玻璃先被切成4 cmXl cm的长条，用乙醇、丙酮和二次水依次进行15 min 超声波洗漆，通过Adobe Illustrator制作用于凡士林印刷模板的模具，将凡士林涂在ΙΤ0 导电玻璃上的特定区域； (2) 聚苯胺的制备：聚苯胺的制备是通过电聚合制备的，由导电玻璃作工作电极、钼 电极作对电极，Ag/AgCl电极作参比电极组成的三电极体系中进行的，电解液由4. 00 mL 3 Μ的硝酸和0. 40 mL苯胺组成，在工作电极上所施加的电压以0. 1 V · ?Γ1的扫描速度 在-0. 2-1. 2 V之间循环，由此制得聚苯胺； (3) g-C3N4的制备：称取10 g三聚氰胺于坩埚中，在550 °C高温炉中灼烧4 h ; (4) 将（3)得到的g-C3N4置于盛有硝酸溶液的三口瓶中，冷凝回流24 h，然后离心洗涤 4次，最后溶于10 mL _次水中备用； (5) 在（2)制备的聚苯胺表面滴加连接剂溶液，然后取10 μ L (4)制备的g-C3N4滴加 到表面，用水洗掉未反应的g-C3N 4，室温下瞭干备用； (6) 银纳米球的制备：a溶液包括3mL乙二醇、90 mM硝酸银，b溶液包括3 mL乙二醇、 147 mM聚乙烯吡咯烷酮、0. 22 mM氯化钠；取一个三口瓶加入5mL乙二醇，加热至153°C，然 后将a、b两溶液同时逐滴缓慢的加入到三口瓶中，经过一系列的反应最后颜色变为黄色， 用丙酮和水分别离心洗涤，收集沉淀； (7) 将（6)制备好的银纳米球加入到3 mL含有聚乙烯吡咯烷酮的水中，加热到100 °C 并保持10 min，然后加入100 yL 1 %的氯金酸溶液，加热10 min至颜色稳定，然后用饱 和氯化钠清洗里面的氯化银，最后用水离心洗涤聚乙烯吡咯烷酮和氯化钠，将得到的银金 核壳纳米球分散到二次水中； (8) 本发明所涉及的金属氧化物包括氧化锌、氧化铜、二氧化锰，在不同的条件下制备 得到这三种金属氧化物； (9) 将（8)得到的金属氧化物加入到（7)的悬浮液中，搅拌反应24 h，二次水离心洗涤， 分散到1 mL二次水中，由此得到金属氧化物/银金核壳纳米球的悬浮液； (10) 将二抗加入到（9)制备的悬浮液中反应30 min，最后用BSA封闭活性位点，由此 得到金属氧化物/银金核壳纳米球修饰二抗的复合粒子，将制备好的溶液保存在4 °C的冰 箱中待用； (11) 在（5)制备好的电极上依次修饰上一抗、抗原、（10)得到的二抗复合粒子，在含有 硝酸的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光的检测。
[0016] 本发明中使用的洗涤溶液为pH 7. 4磷酸盐缓冲溶液。
[0017] 实施例1 (胚胎抗原类，如甲胎蛋白，AFP) (1) 选择临床发病较高的AFP进行测定； (2) 将导电玻璃先被切成4 cmXl cm的长条，用乙醇、丙酮和二次水依次进行15 min 超声波洗漆，通过Adobe Illustrator制作用于凡士林印刷模板的模具，将凡士林涂在ΙΤ0 导电玻璃上的特定区域； (3) 聚苯胺的制备：聚苯胺的制备是通过电聚合制备的，由导电玻璃作工作电极、钼 电极作对电极，Ag/AgCl电极作参比电极组成的三电极体系中进行的，电解液由4. 00 mL 3 Μ的硝酸和0. 40 mL苯胺组成，在工作电极上所施加的电压以0. 1 V · ?Γ1的扫描速度 在-0. 2-1. 2 V之间循环，由此制得聚苯胺； (4) g-C3N4的制备：称取10 g三聚氰胺于坩埚中，在550 °C高温炉中灼烧4 h ; (5) 将（3)得到的g-C3N4置于盛有硝酸溶液的三口瓶中，冷凝回流24 h，然后离心洗涤 4次，最后溶于10 mL _次水中备用； (6) 在（3)制备的聚苯胺表面滴加连接剂溶液，然后取10 μ L (5)制备的g-C3N4滴加 到表面，用水洗掉未反应的g-C3N 4，室温下瞭干备用； (7) 银纳米球的制备：a溶液包括3 mL乙二醇、90 mM硝酸银，b溶液包括3 mL乙二醇、 147 mM聚乙烯吡咯烷酮、0. 22 mM氯化钠；取一个三口瓶加入5 mL乙二醇，加热至153°C， 然后将a、b两溶液同时逐滴缓慢的加入到三口瓶中，经过一系列的反应最后颜色变为黄 色，用丙酮和水分别离心洗涤，收集沉淀； (8) 将（7)制备好的银纳米球加入到3 mL含有聚乙烯吡咯烷酮的水中，加热到100 °C 并保持10 min，然后加入100 yL 1 %的氯金酸溶液，加热10 min至颜色稳定，然后用饱 和氯化钠清洗里面的氯化银，最后用水离心洗涤聚乙烯吡咯烷酮和氯化钠，将得到的银金 核壳纳米球分散到二次水中； (9) 氧化锌的制备：以醋酸锌为原料，柠檬酸三铵为改性剂，配制一定浓度的醋酸锌溶 液，搅拌均匀后，置于恒温水欲中，再搅拌加热的条件下，均匀的加入无水乙醇，2 h后，醋酸 锌完全溶解，生成氢金属氧化物沉淀，然后加入适量的胶溶剂氨水，氢金属氧化物沉淀消失 形成溶胶，静置变成氢金属氧化物湿凝胶，于马弗炉中煅烧得到金属氧化物粉末； (10) 将（9)得到的氧化锌加入到（8)的悬浮液中，搅拌反应24 h，二次水离心洗涤，分 散到1 mL二次水中，由此得到金属氧化物/银金核壳纳米球的悬浮液； (11) 将AFP的二抗加入到（9)制备的悬浮液中反应30 min，最后用BSA封闭活性位点， 由此得到金属氧化物/银金核壳纳米球修饰二抗的复合粒子，将制备好的溶液保存在4°C 的冰箱中待用； (12) 在（6)制备好的电极上依次修饰上AFP的一抗、抗原、（11)得到的二抗复合粒子， 在含有硝酸的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光的检测。
[0018] AFP电致化学发光传感器对人体、动物血清样品中的AFP进行检测，结果见表1。利 用现有的方法，制备AFP电化学免疫传感器，连接电化学工作站，对人体、动物血清样品提 取液中的AFP进行实际检测，结果见表1。
[0019] 表1本发明AFP电致化学发光免疫传感器与AFP电化学免疫传感器检测效果对比
【权利要求】
1. 一种检测肿瘤标志物的电致化学发光传感器的制备方法，其包括以下步骤： (1) 将导电玻璃切割成所需要的大小，并进行预处理； (2) 利用已有方法在导电玻璃方形区域内聚合上聚苯胺，并合成g-C3N4、银金核壳纳米 球及金属氧化物； (3) 羧基化g-C3N4，用连接剂1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基 丁二酰亚胺混合液将其固定在聚苯胺上，用于固定一抗； (4) 将银金核壳纳米球修饰在金属氧化物上，然后将二抗修饰在银金核壳纳米球上； (5 )将制作好的电致化学发光传感器结合电致化学发光仪对肿瘤标志物进行检测。
2. 本发明所述聚苯胺/g_C3N4、金属氧化物/银金核壳纳米球及传感器的制备包括以下 步骤： (1) 将导电玻璃先被切成4 cmXl cm的长条，用乙醇、丙酮和二次水依次进行15 min 超声波洗漆，通过Adobe Illustrator制作用于凡士林印刷模板的模具，将凡士林涂在ITO 导电玻璃上的特定区域； (2) 聚苯胺的制备：聚苯胺的制备是通过电聚合制备的，由导电玻璃作工作电极、钼 电极作对电极，Ag/AgCl电极作参比电极组成的三电极体系中进行的，电解液由4. 00 mL 3 Μ的硝酸和0. 40 mL苯胺组成，在工作电极上所施加的电压以0. 1 V · ?Γ1的扫描速度 在-0. 2-1. 2 V之间循环，由此制得聚苯胺； (3) g-C3N4的制备：称取10 g三聚氰胺于坩埚中，在550 °C高温炉中灼烧4 h ; (4) 将（3)得到的g-C3N4置于盛有硝酸溶液的三口瓶中，冷凝回流24 h，然后离心洗涤 4次，最后溶于10 mL _次水中备用； (5) 在（2)制备的聚苯胺表面滴加连接剂溶液，然后取10 μ L (4)制备的g-C3N4滴加 到表面，用水洗掉未反应的g-C3N 4，室温下瞭干备用； (6) 银纳米球的制备：a溶液包括3mL乙二醇、90 mM硝酸银，b溶液包括3 mL乙二醇、 147 mM聚乙烯吡咯烷酮、0. 22 mM氯化钠；取一个三口瓶加入5mL乙二醇，加热至153°C，然 后将a、b两溶液同时逐滴缓慢的加入到三口瓶中，经过一系列的反应最后颜色变为黄色， 用丙酮和水分别离心洗涤，收集沉淀； (7) 将（6)制备好的银纳米球加入到3 mL含有聚乙烯吡咯烷酮的水中，加热到100 °C 并保持10 min，然后加入100 yL 1 %的氯金酸溶液，加热10 min至颜色稳定，然后用饱 和氯化钠清洗里面的氯化银，最后用水离心洗涤聚乙烯吡咯烷酮和氯化钠，将得到的银金 核壳纳米球分散到二次水中； (8) 本发明所涉及的金属氧化物包括氧化锌、氧化铜、二氧化锰，在不同的条件下制备 得到这三种金属氧化物； (9) 将（8)得到的金属氧化物加入到（7)的悬浮液中，搅拌反应24 h，二次水离心洗涤， 分散到1 mL二次水中，由此得到金属氧化物/银金核壳纳米球的悬浮液； (10) 将二抗加入到（9)制备的悬浮液中反应30 min，最后用牛血清白蛋白封闭活性位 点，由此得到金属氧化物/银金核壳纳米球修饰二抗的复合粒子，将制备好的溶液保存在4 °〇的冰箱中待用； (11) 在（5)制备好的电极上依次修饰上一抗、抗原、（10)得到的二抗复合粒子，在含有 硝酸的磷酸盐缓冲溶液中进行电致化学发光的检测。
【文档编号】G01N27/26GK104297479SQ201410492036
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】颜梅, 王秀, 于京华, 申蕾, 邓文平, 葛慎光, 张彦, 刘海云, 杨春蕾 申请人:济南大学