同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分含量的hplc方法

同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分含量的hplc方法
【专利摘要】本发明涉及一种同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分含量的HPLC方法，该方法以微乳液作为流动相的高效液相色谱法，微乳流动相中水相的比例一般都在90%以上，与目前常规高效液相色谱法中流动相相比大大减少了有机溶剂的使用，大大降低了对身体的危害、环境的污染和分析的时间和成本。通过对微乳色谱条件的优化，在等度洗脱条件下，大花罗布麻叶中6种黄酮类成分同时得到了有效的分离，建立了一种绿色环保、准确可靠、稳定的快速检测方法。克服了现有大花罗布麻叶黄酮类成分测定中的缺陷。
【专利说明】同时测定大花罗布麻叶中6种黄鋼类成分含量的HPLC方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种利用HPLC同时测定大花罗布麻叶中6种 黄丽类成分的方法。

【背景技术】
[0002] 大花罗布麻任oacynum hedersonni (Hook. F. ) Woodson)是夹竹桃科白麻属植物， 学名大叶白麻，药用部位是叶，主要分布在我国新疆地区，是生长在盐碱、沙荒地区及戈壁 滩上的多年生宿根植物资源，其独特的生长环境使其具有十分特异的药用保健功效。新疆 大花罗布麻入药已有千年历史，其部分药理作用很早就被人们发现并用于临床，据《本草纲 目》、《救荒本草》记载，其罗布麻叶有清热利尿、平肝、安神等功效，临床用于治疗高血压、冠 也病、颈椎病、肾炎浮肿、神经衰弱、更年期综合征等疾病，1977年正式录入《中华人民共和 国药典》。现代药理学研究证明黄丽类物质为大花罗布麻叶最主要的有效成分，大花罗布麻 叶中黄丽类物质主要是搬皮素-3-0-槐糖巧、罗布麻甲素、搬皮素、金丝桃巧、紫云英巧和 H叶豆巧等6种黄丽类成分。随着大花罗布麻叶在临床上广泛应用，非常有必要对其中黄 丽类成分进行含量测定及分析，该有助于大花罗布麻叶的质量控制，亦为今后对大花罗布 麻的进一步研究奠定基础。目前国内外对大花罗布麻叶黄丽类成分的检测方法主要是分光 光度法和高效液相色谱法（HPLC)。
[0003] 分光光度法测定的是大花罗布麻叶总黄丽的含量，但该只能粗略反映大花罗布麻 叶中含黄丽类成分的总量，不能反映大花罗布麻叶各黄丽类成分的情况，无法用来评价大 花罗布麻叶质量的真实性、优良性和稳定性。近年来，随着中药物质基础、药理活性研究的 深入和现代分离技术的提高，中药质量水平有了明显的提高。在认识到中药药效是多祀点、 多成分的协同作用特点后，多指标成分定量成为中药含量测定的发展趋势。而目前有关高 效液相色谱法测定大花罗布麻叶黄丽成分的文献中，只有对大花罗布麻叶黄丽类物质中的 个别成分进行了测定，而没有同时对搬皮素-3-0-槐糖巧、罗布麻甲素、搬皮素、金丝桃巧、 紫云英巧和H叶豆巧等多种黄丽类成分进行测定，因而无法全面的反映大花罗布麻叶黄丽 类成分，进而也就无法反映大花罗布麻叶的质量情况。同时还由于各黄丽类成分之间物理 化学性质的较大差异，现有的HPLC分离方法均存在分离选择性小，分离度差和分离时间长 的缺点。另外，目前的HPLC分离方法中流动相含有高比例的甲醇或己膳，该对身体及环境 也是十分有害的。因而，建立一种绿色环保高效的分析测定大花罗布麻叶中多种黄丽类成 分的方法具有重要意义。
[0004] 微乳液相色谱（microemulsion liquid C虹omatography, MELC)法是W微乳为流 动相的高效液相色谱法。微乳流动相通常是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂组 成，是一种透明或半透明的，低粘度的，各向同性且热力学稳定的水油混合系统，粒径小于 lOOnm。MELC法与常规HPLC法相比，具有不使用或极少使用有机溶剂、分离效率高和分离速 度快的优势，可用于复杂样品的分离，复杂样品经过简单的稀释后便可W直接进样分析，无 需预处理。在低紫外波长（200nm)检测方面有明显的优势。
[0005] 本发明建立了一种W微乳液作为流动相的高效液相色谱法（即微乳液相色谱 (MELC))对大花罗布麻叶中搬皮素-3-0-槐糖巧、罗布麻甲素、搬皮素、金丝桃巧、紫云英巧 和H叶豆巧等6种黄丽类成分同时进行含量测定，并应用该方法分别对6批样品进行分析， 进而比较不同批次大花罗布麻叶药材在化学成分组成和含量上的异同，为临床上大花罗布 麻叶药材的应用提供更好的理论指导。


【发明内容】

[0006] 本发明目的在于，提供一种同时测定大花罗布麻叶中6种黄丽类成分含量的HPLC 方法，该方法W微乳液作为流动相的高效液相色谱法，微乳流动相中水相的比例一般都在 90% W上，与目前常规高效液相色谱法中流动相相比大大减少了有机溶剂的使用，大大降 低了对身体的危害、环境的污染和分析的时间和成本。通过对微乳色谱条件的优化，在等度 洗脱条件下，大花罗布麻叶中6种黄丽类成分同时得到了有效的分离，建立了一种绿色环 保、准确可靠、稳定的快速检测方法。克服了现有大花罗布麻叶黄丽类成分测定中的缺陷。
[0007] 本发明所述的一种同时测定大花罗布麻叶中6种黄丽类成分含量的HPLC方法，按 下列步骤进行：
[0008] a、样品溶液制备；称取真空干燥至恒重的大花罗布麻叶粉末0. 5g，精密称定，过 3号筛，加入40mL浓度为70 %己醇，浸泡比，超声处理30min，放冷，滤过，准确移取续滤液 2mL，置10血容量瓶中，W浓度为70 %己醇定容，摇匀后，用0. 45 y m滤膜过滤，取续滤液，即 得样品溶液；
[0009] b、对照品溶液制备；分别称取真空干燥至恒重的搬皮素-3-0-槐糖巧、罗布麻甲 素、搬皮素、金丝桃巧、紫云英巧和H叶豆巧对照品适量，精密称定，加入浓度为70%己醇超 声溶解，制成2mg/ml的混合对照品溶液，作为胆备液，密封，温度4°C保存；
[0010] C、微乳流动相配制；将体积分数2. 0 %表面活性剂Genapo 1 X-080，体积分 数3. 0%助表面活性剂正下醇，体积分数0. 6%油相己酸己醋，体积分数0. 2 %H己胺和 94.2%水溶液混合，用2〇1111电口〇4调节抑=5.0，超声3〇111111，经0.4511111滤膜过滤，超声 30min，即得透明稳定的微乳溶液，静置过夜，备用；
[0011] d、色谱条件：色谱柱为 Zorbax SB-Cig4. 6mmX 150mm，5 Ji m 柱，流速 0. 8血/min, 检测波长 360nm，柱温3(rC，流动相为2.0%GenapolX-080-3.0%正下醇-0.6%己酸己 醋-0. 2%H己胺-94. 2%水溶液，用20mM H3PO4调节抑=5.0,进样量IOyL,采用外标法 定量，色谱图记录与处理由工作站完成，理论培板数按罗布麻甲素峰计算不低于8000。
[0012] 本发明采用微乳液相色谱法，同时测定了大花罗布麻叶中的6中黄丽类成分的含 量，结果该6种黄丽成分在15min内达到基线分离，在l-500mg/L范围内，6个黄丽成分的线 性相关系数r 2 > 0.9996,回收率98. 9-100. 8%。本方法可应用于大花罗布麻叶中6种主 要黄丽成分的质量分析。
[0013] 本发明所述的同时测定大花罗布麻叶中6种黄丽类成分含量的HPLC方法，该方法 的优点在于，在微乳液相色谱中，6种主要黄丽成分分离效率高（完全分离），分离速度快 (分离时间仅为常规HPLC方法的1/3)，该是由于溶质在固定相、微乳液滴和水相之间进行 分配，有利于提高色谱的分离能力，与常规HPLC相比，微乳液相色谱对化合物的溶解能力 较强，尤其适用于极性或溶解度差异较大的复杂样品分离，等度洗脱即可达到基线分离，且 有机溶剂用量极少，分析成本低，有经济和环保方面的显著优势。
[0014] 本发明所述的同时测定大花罗布麻叶中6种黄丽类成分含量的HPLC方法，该方法 的创新点在于使用了微乳为流动相的高效液相色谱法（HPLC)，与常规HPLC法相比，具有不 使用或极少使用有机溶剂、分离效率高和分离速度快的优势，可用于复杂样品的分离，复杂 样品经过简单的稀释后便可W直接进样分析，无需预处理。不仅绿色环保，分析时间大大缩 短。专利申请号201010120856是常规的HPLC方法，不仅流动相大量使用了甲醇和己膳等 有毒有机溶剂，而且分析时间长达70分钟W上。而本发明流动相中没有使用任何有毒有机 溶剂，其中绝大部分是水巧4. 2%)，并且分析时间只有10分钟左右。该大大提高了分析效 率。同时根据HPLC方法的原理，简单的说，就是样品溶解在流动相中，随流动相进入色谱 柱，经过固定相（填料）时，会受到固定相的吸附。样品中不同组分受到的吸附不同，于是 流出色谱柱的时间顺序就不同。

【专利附图】

【附图说明】
[0015] 图1为本发明建立MELC方法的对照品溶液高效液相色谱图；
[0016] 图2为本发明建立MELC方法的样品溶液高效液相色谱图；
[0017] 图3为本发明建立MELC法（A)与常规HPLC法做比较的高效液相色谱图。

【具体实施方式】
[0018] 一、实验部分 [001引仪器与试剂：
[0020] Agilent 1100高效液相色谱仪、四元梯度粟、DAD检测器、Agilent色谱工作站 (Agilent公司）；FZ102植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；DGSY电热恒温水浴锅 (北京长源实验设备厂）；TCL-16G台式高速离也机（上海医用分析仪器厂）；SK5200L肥超 声处理器（上海科导超声仪器有限公司）；RE-3000C旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； P服-3C精密抑计（上海精密仪器仪表有限公司）；
[0021] 搬皮素-3-0-槐糖巧、罗布麻甲素、搬皮素、金丝桃巧、紫云英巧和H叶豆巧对照 品均购自Sigma公司（纯度大于98%);大花罗布麻叶药材由新疆本草堂中药饮片有限 公司提供，经新疆中药民族药研究所鉴定为大花罗布麻（Poacynum hedersonni化ook. F.) Woodson);月桂醇聚氧己帰離（Genapol X-080,分析纯，Sigma公司），己酸己醋、庚焼、甲 苯、正辛醇、正丙醇和正己焼（分析纯，Merck公司），磯酸、H己胺（分析纯，北京化学试剂 公司），己膳（色谱纯，Fisher公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯；
[00过液相色谱条件：
[0023] 色谱柱；Zorbax SB-Cis (4. 6mmX 150mm，5 y m)柱；
[0024] 流动相；2. 0 % Genapol X-080-3. 0 % 正了醇-0. 6 % 己酸己醋-0. 2 % H 己 胺-94.2%水溶液（用2〇1111畔〇4调节抑5.0);
[00巧]流速；0. 8血/min ;
[0026] 检测波长；360nm ;
[0027] 柱温；3(TC ;
[0028]进样体积；IOii L ;
[0029] 色谱分离结果见图1，由图I可知，6种黄丽类成分能良好的分离；
[0030] 对照品溶液的制备：
[0031] 分别称取真空干燥至恒重的搬皮素-3-0-槐糖巧、罗布麻甲素、搬皮素、金丝桃 巧、紫云英巧和H叶豆巧对照品适量，精密称定，加入浓度为70%己醇超声溶解，制成2mg/ ml的混合对照品溶液，作为胆备液，密封4°C保存；
[00础样品溶液制备：
[0033] 称取真空干燥至恒重的大花罗布麻叶粉末（过3号筛）0. 5g，精密称定，加40mL浓 度为70%己醇，浸泡比，超声处理30min，放冷，滤过，准确移取续滤液2mU置IOmL容量瓶 中，W浓度为70 %己醇定容，摇匀后，用0. 45 y m滤膜过滤，取续滤液，即得。
[0034] 二、结果与讨论 [00巧]色谱条件的优化
[0036] 表面活性剂的选择：
[0037] 考察了 SDS、化ij35、Genapol X-080、TritonX-114等表面活性剂对管花肉巧蓉中 6种黄丽类成分的分离效果，结果表明，在流动相中加入Genapol X-080,可使6种成分的保 留因子达到合适的范围（=2?8)，同时色谱基线平稳。当在流动相中加入SDS时，由于 SDS为离子型表面活性剂，其对化学结构非常相似的亲水性化合物分离度差，6种黄丽类成 分几乎分离不开；而在流动相中加入化i j35、TritonX-114等非离子型表面活性剂时，由于 化i j35、TritonX-114在210nm处存在吸收，色谱基线也不稳定，会干扰测定。而非离子型表 面活性剂Genapol X-080在210nm处无吸收，色谱基线稳定，故选择Genapol X-080作为最 佳表面活性剂。按一定比例配制分别含0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%和2. 5%Genapol X-080 的微乳流动相，考察Genapol X-080的含量对大花罗布麻叶中6种黄丽类成分的分离选择 性的影响。结果显示；随着Genapol X-080含量的增加，大花罗布麻叶中6种黄丽类成分的 保留因子明显减少，当Genapol X-080含量为2. 0%时，6种黄丽类成分的保留因子达到合 适的范围，分离效果最好，故选择Genapol X-080含量为2. 0%。
[0038] 助表面活性剂的选择：
[0039] 分别选择正下醇、正戊醇、正丙醇、异丙醇为助表面活性剂，考察其对色谱行为的 影响。结果显示，W正下醇为助表面活性剂时，6种黄丽类类成分的保留时间均减少，改变 正下醇的含量1. 0-5. 0%，考察其对6种黄丽类类成分分离效果的影响。结果显示；正下醇 含量在3. 0% W前，随着正下醇含量的增加，6种苯己醇巧类成分的保留时间都随着有所缩 短，当高于3. 0%时，保留时间又相应延长，故确定助表面活性剂正下醇含量为3. 0%时分 离效果最为理想。
[0040] 油相的选择：
[0041] 考察了正庚焼、甲苯、己酸己醋、正辛焼作为油相对分离的影响。结果表明；油相对 6种黄丽类成分的洗脱能力最强的为己酸己醋，且己酸己醋作为油相时各组分分离度最好， 而正辛焼、正庚焼和甲苯不能使被测成分达到基线分离，故选择己酸己醋为油相。改变油相 己酸己醋的含量，可W改变物质的分离度。考察己酸己醋含量在0. 2% -1. 0%范围变化时 对分离效果的影响，发现随着己酸己醋含量的增加，6种黄丽类成分的分离度相应提高。当 己酸己醋的含量为0. 6%时，分离效果最理想，故确定油相己酸己醋的含量为0. 6%。
[004引添加剂和抑值对分离的影响：
[0043] 因为黄丽类成分多带有轻基，因此H己胺浓度对黄丽类成分的保留时间有较大影 响。考察H己胺浓度为0%、0. 1%、0.2%、0.3%、0.4%时，对6种黄丽类成分分离效果的 影响。结果表明：H己胺浓度为0. 3%时6种黄丽类成分的保留时间均缩短，最后选择H己 胺浓度为0. 2%。在最优微乳流动相的基础上，改变抑值（用20mM畔〇4调节），范围在 3. 0-7.0,对6种黄丽类成分的保留时间和分离度有影响，随着抑的增加，6种黄丽类成分的 保留时间有所缩短，但当抑=5. 0时，6种黄丽类成分分离得最好，因此，选择抑=5. 0 (用 20mM H3PO4 调节）。
[0044] 柱温对分离的影响：
[0045] 采用Genapol X-080-正下醇-己酸己醋-H己胺-水溶液微乳流动相，分别在温 度201：、251：、301：、351：和401：的条件下考察柱温对微乳液相色谱分离选择性的影响。结 果表明：随着柱温升高，各组分的保留因子减小，当柱温低于3(TC时，各组分的峰宽较大， 柱效较低；当柱温等于或高于3(TC时，各组分的峰形较好，柱效明显提高。考虑到样品和色 谱柱对温度的耐受性，最终选择柱温为3(TC。
[004引 方法验证：
[0047] 方法的标准曲线、检出限和定量限：
[0048] 取对照品储备液，用微乳流动相稀释成一系列浓度的标准溶液，按"实验部分2 中"的色谱条件进行测定，W峰面积Y对浓度X (mg/L)作行线性回归，得出6种黄丽类成分 的线性回归方程、定量限（LO曲和检出限（LOD)见表1 :
[0049] 表IMELC法测定6种黄丽类成分标准品的标准曲线，定量限和检出限
[0050]

【权利要求】
1. 一种同时测定大花罗布麻叶中6种黄酮类成分含量的HPLC方法，其特征在于按下列 步骤进行： a、 样品溶液制备：称取真空干燥至恒重的大花罗布麻叶粉末0. 5g，精密称定，过3号 筛，加入40 mL浓度为70%乙醇，浸泡1 h，超声处理30 min，放冷，滤过，准确移取续滤液 2mL，置10 mL容量瓶中，以浓度为70%乙醇定容，摇匀后，用0.45 μ m滤膜过滤，取续滤 液，即得样品溶液； b、 对照品溶液制备：称取真空干燥至恒重的槲皮素-3-0-槐糖苷、罗布麻甲素、槲皮 素、金丝桃苷、紫云英苷和三叶豆苷对照品适量，分别加入浓度为70%乙醇超声溶解后，转 移至25 mL容量瓶中，定容，摇匀，作为对照品贮备液，密封，温度4°C保存； c、 微乳流动相配制：将体积分数2. 0 %表面活性剂Genapol X-080,体积分数3. 0%助 表面活性剂正丁醇，体积分数0.6%油相乙酸乙酯，体积分数0.2%三乙胺和94. 2%水溶液 混合，用20mM Η3Ρ04调节pH =5. 0,超声30 min，经0. 45μπι滤膜过滤，超声30 min，即得 透明稳定的微乳溶液，静置过夜，备用； d、 色谱条件：色谱柱为 Zorbax SB_C18 4. 6mmX 150mm，5 μ m 柱，流速 0· 8 mL/min，检测波长 360 nm，柱温 30°C，流动相为 2· 0% Genapol X-080-3. 0% 正丁 醇-(λ 6%乙酸乙酯-0.2%三乙胺-94. 2%水溶液，用20mM Η3Ρ04调节pH =5.0,进样量 10 μ L，采用外标法定量，色谱图记录与处理由工作站完成，理论塔板数按罗布麻甲素峰计 算不低于8000。
【文档编号】G01N30/02GK104237416SQ201410510844
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月27日 优先权日:2014年9月27日
【发明者】周军, 张琼, 孙江兵, 雷权, 曾平 申请人:中国人民解放军兰州军区乌鲁木齐总医院