一种Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒单克隆抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒的单克隆抗体及其应用，属于免疫学领域。本发明将Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒免疫接种小鼠后，将鼠脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，筛选产生抗Sabin株脊髓灰质炎Ⅱ型病毒的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9232，其分泌的单克隆抗体效价高，中和活性强，能在体外有效阻断Ⅱ型脊髓灰质炎病毒的感染；同时抗体可以特异性的区分Ⅱ型与Ⅰ、Ⅲ型脊灰病毒以及其他多种肠道病毒，可用于制备脊髓灰质炎病毒Ⅱ型以及脊髓灰质炎灭活疫苗中的Ⅱ型抗原含量检测试剂盒和抗体检测试剂盒，也可以用于Ⅱ型脊髓灰质炎病毒的鉴别检测，具有广泛的应用前景。
CGMCC No9232
20140526
【专利说明】一种Sab i η株脊髓灰质炎II型病毒单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学领域与疫苗学领域，具体地，涉及一种抗Sabin株脊髓灰质炎 II型病毒的中和性单克隆抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞株以及抗体的应用。
【背景技术】
[0002] 脊髓灰质炎疾病早在公元前1580-1350时期就存在于人类社会中，最早的证据来 源于古埃及石壁画中一个呈站立姿态的人物，具有明显的脊髓灰质炎疾病症状：腿部弯曲 萎缩，脚面畸形。然而，直到1789年，英国人Michael Underwood才首次描述了脊髓灰质炎 疾病的临床症状，称之为"下肢衰弱"。半个世纪后，德国人的研究表明脊髓灰质炎疾病可 能具备传染性。1894年在美国爆发了有记载以来最大规模的婴儿瘫痪灾难，后来被证实罹 患的是脊髓灰质炎疾病。1908年澳大利亚医生Karl Landsteiner和Erwin Popper首次 提出了假说，认为脊髓灰质炎疾病是由一种病毒引起的。随后在美国流行的疫情更加速了 人们对疾病传播的研究。直到1931年Macfarlane Burnet和Jean MacNamara首次解释 了三种脊髓灰质炎病毒（后称脊灰病毒），即I、II和III型。上述三种病毒导致脊髓灰质炎 (poliomyelitis)疾病，该疾病是一种传播广泛、侵犯中枢神经系统的传染病。感染脊灰病 毒的患者中有90%没有临床症状或只有很轻的临床症状。这些症状包括发烧、头疼、呕吐、 疲劳、脖颈僵直、四肢疼痛等。在每200名受感染的患者中会有一位产生不可逆的瘫痪，部 位主要集中在腿部。更为严重的瘫痪症状可以延伸到患者的躯干，包括胸部和腹部肌肉的 麻痹，最为严重的症状是当脊灰病毒侵染脑部细胞后造成中枢呼吸系统的破坏，导致吞咽 和说话的困难。有5-10%的患者因为呼吸肌麻痹导致死亡。脊髓灰质炎疫苗（包含I、II、 III型的脊髓灰质炎病毒）是预防脊髓灰质炎疾病的有效手段，脊髓灰质炎疫苗包括脊髓灰 质炎减毒活疫苗和脊髓灰质炎灭活疫苗，前者为口服疫苗，后者为注射用疫苗。
[0003] 自1988年实施消灭脊髓灰质炎（脊灰）战略以来，我国通过接种口服脊髓灰质炎 减毒活疫苗（OPV)消灭了本土野毒株引起的脊髓灰质炎。但是仍存在OPV引起的疫苗相关 麻痹病例（VAPP)和疫苗衍生株（VDPV)，脊髓灰质炎灭活疫苗（IPV)基本可避免OPV上述缺 点。WHO指出当全球证实消除脊灰后，将停止使用0PV，届时可能需要脊髓灰质炎灭活疫苗 (IPV)来长期保持脊灰免疫水平。相对于野毒株IPV，Sabin株IPV在制造和使用过程中更 安全，对它的研究受到了 WHO的高度重视。目前生产脊髓灰质炎减毒株灭活疫苗的国家有 中国、日本及荷兰。
[0004] 如上所述，根据抗原决定簇不同脊髓灰质炎病毒可分为I、ΙΙ、ΠΙ型三个血清型， 任何一型病毒造成的疾病都称为脊髓灰质炎。I型易引起瘫痪，也最容易引起流行。三个 型别的病毒间中和试验无交叉反应。每种脊髓灰质炎病毒均有两种抗原，D(致密）抗原和 C(无核心）抗原。前者存在于成熟的、有感染性的病毒颗粒中，是脊髓灰质炎病毒的中和抗 原，具有型特异性。C抗原存在于经过56°C灭活，或者未成熟的空心病毒颗粒中，是一种耐 热的抗原成份，与三个型别的脊髓灰质炎病毒的抗血清均呈补体结合阳性反应。D抗原含量 反应完整的病毒抗原颗粒的多少，是体外测定IPV效力的关键指标，与疫苗在人体内的免 疫效力有较好的一致性。脊髓灰质炎病毒抗体是指动物或人体抗脊髓灰质炎各型别病毒产 生的IgG、IgM等类型抗体的总称，广泛应用于脊髓灰质炎病毒鉴定、脊髓灰质炎疫苗以及 各型别抗原的定性和定量检测中。
[0005] 由于目前脊髓灰质炎II型病毒抗原检测普遍采用的多抗包被--多抗夹心的检 测体系，该体系对于I、ΠΙ型存在较大的交叉反应，尤其在用于三型混合疫苗Sabin株IPV 的II型抗原检测时，由于交叉反应导致检测结果不能真实反应II型抗原的含量以及疫苗II 型的免疫原性，同时WHO也推荐采用多抗与单抗匹配的方式检测三价脊灰疫苗中的各型抗 原含量；目前国际上尚缺乏Sabin株IPV D抗原检测的标准化的试剂，制备特异性好，具有 中和活性的单克隆抗体，可为Sabin株IPV体外效力检测方法的标准化奠定基础。因此，有 必要制备一种型特异的脊灰II型单克隆抗体，用于II型脊灰抗原、抗体的检测与病毒的鉴 别。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种Sabin株脊髓灰质炎II型病毒的中和性单克隆抗体， 用于II型脊灰病毒抗原含量的检测。本发明的另一目的在于提供上述单克隆抗体的应用。
[0007] 为了达到上述目的，本发明首先提供一种分泌Sabin株脊髓灰质炎II型病毒的中 和性单克隆抗体杂交瘤细胞株SVASIPV- II，于2014年5月26日在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为Sabin株脊髓灰质炎II型单抗杂交瘤细胞 株，其保藏编号为CGMCC No. 9232。
[0008] 本发明提供了保藏编号为CGMCC No. 9232是杂交瘤细胞株在制备预防或治疗脊髓 灰质炎药物中的应用。
[0009] 本发明还提供了由上述杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。
[0010] 具体而言，本发明采用小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤技术制备Sabin株脊髓灰质炎II型 病毒的中和性单克隆抗体，通过以下技术方案实现：通过将免疫脊髓灰质炎病毒原液的小 鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，分离出能够分泌脊髓灰质炎抗体的单克隆杂交瘤细胞，接种 小鼠腹腔，制备含有特异性脊髓灰质炎II型病毒抗体的腹水，经过后期处理并验证，得到特 异性好、抗体水平高且能长期保存的Sabin株脊髓灰质炎II型病毒单克隆抗体。
[0011] 进一步，本发明提供了一种Sabin株脊髓灰质炎II型病毒单克隆抗体，其由保藏 编号为CGMCC No. 9232的杂交瘤细胞株分泌获得。
[0012] 进一步，本发明提供了一种使用Sabin株脊髓灰质炎II型病毒直接免疫动物制备 多克隆抗体和单克隆抗体制备的全新模式，收获液的免疫效果优于常规的疫苗原液添加佐 剂的免疫效果，可以为其他病毒制备抗体提供参考，因此采用Sabin株脊髓灰质炎II型病 毒收获液免疫小鼠制备杂交瘤细胞。
[0013] 所述脊髓灰质炎病毒Sabin株II型病毒收获液的制备方法为：取II型病毒制备的 工作种子批毒种按MOI = 10?0. 05接种Vero或其他原代、传代细胞，接种病毒时的细胞 浓度为〇. 1-10X IO6细胞/ml，病毒培养后收获细胞上清，即为Sabin株脊髓灰质炎病毒II 型病毒收获液。
[0014] 更进一步地，本发明提供了上述单克隆抗体在制备检测脊髓灰质炎II型病毒抗原 试剂盒中的应用。
[0015] 本发明提供了上述的单克隆抗体在制备检测脊髓灰质炎II型病毒抗体试剂盒中 的应用。
[0016] 本发明提供了一种用于检测脊髓灰质炎II型病毒抗原或抗体的试剂盒，含有上述 单克隆抗体。
[0017] 对本发明的单克隆抗体，经生物标记或化学标记后获得的单克隆抗体也属于本发 明的保护范围。
[0018] 进一步地，经酶标记的上述单克隆抗体属于本发明的保护范围。
[0019] 所述的酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
[0020] 该单克隆抗体不进行生物标记或化学标记，而添加第二抗体；即采用一种物种的 抗脊灰抗体包被酶标板，添加脊髓灰质炎II型病毒抗原后，加入本发明单抗，然后加入抗属 二抗HRP，用于检测或制备检测试剂。
[0021] 本发明提供了一种可以用于脊髓灰质炎治疗性抗体的改造的细胞株，以及包含于 细胞株的保护性抗体的基因信息。
[0022] 本发明提供的Sabin株脊髓灰质炎II型病毒单克隆抗体具有如下有益效果：
[0023] 1、本发明的单克隆抗体具有较高的效价即反应性，间接法效价最高可达106。
[0024] 2、本发明的单克隆抗体具有较高的中和效价，可以有效反映脊髓灰质炎II型病毒 有效抗原表位，用于抗原含量检测优于多抗--多抗的检测体系；同时该单抗反映的中和 表位即有效抗体，可用于抗脊髓灰质炎IgG抗体竞争法检测，用于疫苗免疫效果的评价及 流行病学调查，更加有效的评价疫苗的免疫效果及地区的过往发病史。
[0025] 3、本发明的脊髓灰质炎II型单克隆抗体可以特异性的区分脊髓灰质炎II型病毒 和I、111型病毒，不与其反应，是能够与sabin株脊髓灰质炎II型病毒特异性结合的单抗。
[0026] 4、本发明的单克隆抗体与甲肝病毒、肠道病毒71型病毒、柯萨奇A16病毒等无交 叉反应，均有较好的病毒特异性。
[0027] 5、单克隆抗体可广泛应用于脊髓灰质炎病毒的检测、鉴别、筛查与疫苗生产的抗 原检测以及流行病调查中；同时检测的是抗原决定簇，可以更加有效的反应疫苗的有效组 分，对疫苗的工艺研究与生产具有重要意义。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0029] 本发明选用的Sabin株脊髓灰质炎II型病毒来自荷兰Intravacc，代次S0+2代，但 毒株不限于本来源与本代次的毒株。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技 术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。
[0030] 实施例1免疫原制备与动物免疫
[0031] (1)取Vero细胞工作细胞库复苏后于36. 5±0. 5 °C培养，至细胞浓度为 0. I-IOXlO6细胞/ml时，接种病毒。
[0032] (2)取Intravacc来源的sabin株脊髓灰质炎II型病毒制备的工作种子批毒种按 MOI = 10 ?0· 05 接种 Vero 细胞，置 32. 5±0· 5°C培养。
[0033] (3)病毒培养2?4天，收获细胞上清，即为脊髓灰质炎病毒Sabin株II型病毒收 获液。
[0034] (4) II型收获液澄清后用超滤膜包浓缩5倍以上。
[0035] (5)然后进行分子筛层析和离子交换层析，监测波长为280nm，分别收集洗脱液和 流穿液，即得纯化液，甲醛灭活后即得II型疫苗原液。
[0036] (6)将疫苗原液与弗氏佐剂（0天免疫为弗氏完全佐剂，14天、28天免疫为弗氏不 完全佐剂）等体积混合乳化后于0天、14天、28天背部皮下多点免疫BALB/c小鼠，0. 2ml/ 只。II型收获液于〇天、14天、28天背部皮下多点免疫BALB/c小鼠，0. 2ml/只。
[0037] (7)末次免疫一周后采血检测抗体效价，血清稀释IO4时收获液免疫小鼠血清的间 接ELISA的OD值为1. 816,原液加佐剂免疫小鼠血清的间接ELISA的OD值为0. 193,收获 液免疫小鼠血清效价高于疫苗原液加佐剂免疫小鼠，确定采用收获液免疫小鼠进行细胞融 合筛选单抗。于末次免疫二周后采用收获液腹腔冲击选定的小鼠，3天后取小鼠脾脏，进行 细胞融合。
[0038] 实施例2细胞融合及建株
[0039] (1)细胞融合前复苏培养SP2/0细胞株，融合前3天扩大培养，融合前1天去除 RPMI 1640细胞培养液（Gibco)，重新添加培养液，准备SP2/0细胞。
[0040] (2)处死免疫小鼠，按常规方法制备小鼠脾细胞悬液。
[0041] (3)根据脾细胞与SP2/0细胞计数结果分别加入适量不完全MDM培养液 (Gibco)，SP2/0细胞晃动混匀，脾细胞用移液管吹打均匀。然后将脾细胞与SP2/0细胞按 1:2?10:1混合于50ml离心管中，混匀。
[0042] (4)加不完全MDM培养液至50ml，离心5-10分钟，倒净上清。轻击融合管底，使 沉淀细胞松散均匀，离心管置37°C水浴，准备融合。
[0043] (5)将37 °C预热的50%的PEG4000lml，用滴管缓慢滴入混合细胞管，边滴边转动 离心管，使细胞保存在混匀状态。
[0044] (6)静置90s后立即缓慢加入15ml无血清的MDM培养基（Gibco) (37°C )，然后离 心5-10分钟，弃去上清。
[0045] (7)加入頂DM完全培养液（Gibco)，混匀，将混悬液分别加至96孔细胞培养板中， 100μ 1/孔，于37°C，5% (：02培养箱内培养。
[0046] (8)第 2 天细胞板加 HAT 培养液（MDM 含 1*HAT (Sigma)) 100 μ 1/ 孔。
[0047] (9)每2-3天换一次HAT培养液，观察是否出现杂交瘤，两周后换HT培养基（IMDM 含1*的HT (Sigma))，观察融合细胞生长状况。
[0048] (10)细胞融合后第七天开始观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10 以上时吸出上清进行抗体ELISA检测。将阳性孔细胞转入24孔板扩大培养，及时做亚克隆。
[0049] (11)经3次亚克隆得到稳定分泌抗体的细胞系，命名为SVA SIPV- II，冻存细胞。 将杂交瘤细胞株进行保藏，保藏号CGMCC NO. 9232,分类命名为：Sabin株脊髓灰质炎II型 单抗杂交瘤细胞株；保藏时间：2014年5月26日；保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理 中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，地址北京 市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
[0050] 实施例3单抗细胞株腹水制备与抗体效价检测
[0051] 按常规方法将冻存的实施例2获得的杂交瘤细胞进行复苏，培养，待细胞覆盖 25ml的细胞培养瓶瓶底50%以上时即可按照常规方法腹腔接种BALB/c小鼠，定期收集腹 水 SIPV- II。
[0052] 将脊髓灰质炎II型疫苗原液采用0. OlM PBSl: 20稀释，100 μ 1/孔包被酶标板， 2-8°C过夜，检测脊髓灰质炎II型腹水SIPV- II的抗体效价，抗体效价最高达为106,结果见 表1。
[0053] 表1抗体效价检测结果
[0054]
【权利要求】
1. 一种Sabin株脊髓灰质炎II型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9232。
2. 由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
3. 权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测脊髓灰质炎II型病毒抗原试剂盒中的应 用。
4. 权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测脊髓灰质炎II型病毒抗体试剂盒中的应 用。
5. -种用于检测脊髓灰质炎II型病毒抗原的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所 述的单克隆抗体。
6. -种用于检测脊髓灰质炎II型病毒抗体的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所 述的单克隆抗体。
7. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，为经生物标记或化学标记的单克 隆抗体。
8. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，为酶标记的单克隆抗体。
9. 权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备预防或治疗脊髓灰质炎药物中的应用。
10. -种制备权利要求1所述杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，采用Sabin株脊髓灰 质炎病毒II型病毒收获液免疫小鼠，所述Sabin株脊髓灰质炎病毒II型病毒收获液的制备 方法为：取II型病毒制备的工作种子批毒种按M0I = 10?0. 05接种Vero或其他原代、传 代细胞，接种病毒时的细胞浓度为〇. 1-10X 106细胞/ml，病毒培养后收获细胞上清，即为 Sabin株脊髓灰质炎病毒II型病毒收获液。
【文档编号】G01N33/577GK104371979SQ201410549830
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】王欣, 江志华, 程会欣, 童钦, 金亚明, 阴彦辉, 蔡芳, 高强, 尹卫东 申请人:北京科兴生物制品有限公司