一种核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及免疫分析医学领域，特别涉及一种核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒及其制备方法，可用于临床膀胱癌的早期诊断及术后疗效监测。本发明的试剂盒包括：1）NMP22校准品；2）NMP22单克隆抗体预包被的固相载体；3）NMP22单克隆抗体的酶标记物；4）与所述酶作用的发光底物液；5）浓缩洗液。本发明的优点是简便、无创且能早期诊断膀胱癌。
【专利说明】一种核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种核基质蛋白22 (NMP22) 化学发光免疫检检测剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤，90%以上为移行细胞癌，其中80 %以上是无 浸润的浅表性癌，10%_20%发展为浸润性膀胱癌。膀胱移行细胞癌（transitional cell carcinoma of bladder)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，多发生于50-70岁之间。这种疾 病死亡率高，及早地发现、诊断对治疗和预后有重要作用。有资料表明在疾病早期诊断出的 患者的5年存活率大于90%，而在晚期诊断出的患者其5年存活率仅约为15%-30%。目前对 膀胱癌诊断和术后复查主要靠膀胱镜和尿细胞学检查，前者虽准确，但是一种侵入性检查， 操作复杂、费时费力、费用高额，且给病人带来很大痛苦，使得很多病人对此方法有抵触情 绪，同时难以发现原位癌或扁平癌；尿细胞学检查虽无创，且特异性较好，但敏感性低，对于 分期较低、分化较好的肿瘤，其敏感性仅为30%或更低，而且受诊断医师主观因素的影响较 大。膀胱镜和尿细胞学检查的局限性限制了对膀胱癌诊断的应用，故寻找一种简便、无创且 能早期诊断膀胱癌的检测方法及设备具有很大意义。
【发明内容】
[0003] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种简便、无创且能早期诊断膀胱癌的 使用化学发光免疫检测核基质蛋白22 (NMP22)试剂盒及其制备方法。
[0004] 本发明的目的之一是提供一种使用化学发光免疫检测核基质蛋白22试剂盒。
[0005] 核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒包括NMP22校准品、NMP22单克隆抗体预 包被的固相载体、NMP22单克隆抗体的酶标记物、与所述酶作用的化学发光底物液、以及浓 缩洗液。
[0006] 优选，所述的固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
[0007] 优选，所述的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
[0008] 优选，所述的发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。
[0009] 优选，所述的1，2_二氧乙烷类衍生物为（金刚烷)-1，2_二氧乙烷、3- (2< -螺旋 金刚烧）_4-甲氧基(3"-憐醜氧基）苯基 -1，2- _氧乙烧、CSF*D或CDP-Star。
[0010] 优选，所述的浓缩洗液为Tris-HCl或PBST洗涤液。
[0011] 本发明还提供一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤： 1) 配制核基质蛋白22的校准品； 2) 以酶标记核基质蛋白22单克隆抗体； 3) 以核基质蛋白22单克隆抗体包被固相载体； 4) 配制上述酶所作用的发光底物液； 5) 配制浓缩洗液； 6)分装所述核基质蛋白22的校准品、酶标记的核基质蛋白22单克隆抗体、酶作用的发 光底物液和浓缩洗液，并将各组分装成成品。
[0012] 优选，所述步骤3)包被固相载体包括以下步骤： 1) 包被 采用柠檬酸缓冲液与核基质蛋白22 (NMP22)单克隆抗体混合配制成包被液，并将所得 混合液负载于固相载体上； 2) 用生理盐水洗涤步骤1)所得载体； 3) 封闭 配制封闭液，pH为7. 0-7. 5,然后将所得的封闭液负载于步骤2)洗涤后的载体上。
[0013] 更优选，所述封闭液选用PBS缓冲液。
[0014] 或更优选，所述发光底物液包含 24g Tris、160g NaCl、4g KCl、15ml HCl、200ml 3- (2'-螺旋金刚烧)-4-甲氧基(3"-憐醜氧基)苯基 -1，2- _ 氧乙烧、lml Proclin 300、1000ml 双蒸水。
[0015] 优选，所述的固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
[0016] 优选，所述的酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
[0017] 优选，所述的发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。
[0018] 更优选，所述的1，2_二氧乙烷类衍生物为（金刚烷)-1，2_二氧乙烷、3- (2< -螺 旋金刚烧）_4-甲氧基(3"-憐醜氧基）苯基 _1，2- _氧乙烧、CSF*D或CDP-Star。
[0019] 优选，所述的浓缩洗液为Tris-HCl或PBST洗涤液。
[0020] 综上所述，本发明的有益效果为： 1、本发明所提供的使用化学发光免疫检测核基质蛋白22试剂盒，核基质蛋白22 (NMP22)是一种新的膀胱癌肿瘤标志物，能通过检测其在人体尿液或血液中的含量来进行 膀胱癌的早期诊断及术后复发情况，研究表明尿液或血液中NMP22诊断的灵敏度、特异度 和准确度均比较高，所以本发明可用于早期诊断膀胱癌及术后疗效监测。本发明所述试剂 盒，利用化学发光法检测NMP22,只需提供检测样品（尿液或血液）而不使用任何设备，具有 操作方便，而且患者无痛苦的优点。
[0021] 2、本发明采用了辣根过氧化物酶（HRP)和碱性磷酸酶(ALP)两个系统进行实验研 究，用HRP或ALP对抗体进行标记，然后加入待测抗原使之结合，HRP或ALP催化发光底物 液使之分解而产生发光信号。HRP作用的底物为1，2_二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米 诺，此类物质价格便宜，基本实现了国产化，是当前在临床应用最广的一类发光剂。ALP作用 的底物为1，2-二氧乙烷类衍生物（AMPH))，它是一种新型的化学发光剂，属于二氧杂环丁 烷类，性能十分稳定，5°C下保存的固体AMPH)几乎不分解。本发明通过使用化学发光增强 剂AMPPD，增强了化学发光强度，延长了发光时间。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明做进一步的描述，并不因此将本发明限制 在所述的实施例范围之中。
[0024] 实施例1-6为核基质蛋白22 (NMP22)化学发光免疫检检测剂盒的制备 实施例1 一、 酶标抗体制备 辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22 (NMP22)单克隆抗体采用改良过碘酸钠法制备，用 酶标记抗体稀释液以1 :6000工作浓度稀释酶标抗体； 1.辣根过氧化物酶标记核基质蛋白22 (NMP22)单克隆抗体的制备 将标记用的核基质蛋白22 (NMP22)单克隆抗体和辣根过氧化物酶用改良过碘酸钠法 结合在一起，完成用辣根过氧化物酶标记的酶标结合物。
[0025] 以标记10mg核基质蛋白22 (NMP22)单克隆抗体为例，其具体步骤如下： (1) 称取5mgHRP加 lml 0. lmol/L醋酸钠或水溶解，充分混匀； (2) 于上液中加入0. 2ml新配的0. lmol/L NaI04溶液，室温下避光搅拌30min ; (3) 将上述溶液装入透析袋中，对ImM pH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜。
[0026] (4)加 20ul 0· 2M ρΗ9· 5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9. 0-9. 5,然 后立即加入10mg核基质蛋白22 (NMP22)单克隆抗体在lml 0. 01M碳酸盐缓冲液中，室温 避光轻轻搅拌2h ; (5) 加 0. lml 新配的 4mg/mlNaBH4 液，混匀，再置 4°C，2h ; (6) 将上述液装入透析袋中，用0. 15M pH7. 4的PB缓冲液中透析，去除铵离子后， 10,000rpm离心30min去除沉淀，上清液即为所需的酶结合物，加入等量优质丙三醇，分装 后，-20°C保存。
[0027] 2.酶标抗体稀释液配方：
【权利要求】
1. 一种核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1) NMP22校准品；2) NMP22单克隆抗体预包被的固相载体；3) NMP22单克隆抗体的酶标记物； 4)与所述酶作用的发光底物液；5)浓缩洗液。
2. 如权利要求1所述的核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒，其特征在于，所述的 固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。
3. 如权利要求1所述的核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒，其特征在于，所述的 酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
4. 如权利要求1所述的核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒，其特征在于，所述的 发光底物液的发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。
5. 如权利要求4所述的核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒，其特征在于，所述 的1，2_二氧乙烷类衍生物为（金刚烷）-1，2_二氧乙烷、3- (2< -螺旋金刚烷）-4-甲氧 基-4- (3〃 -磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。
6. 如权利要求1所述的核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒，其特征在于，所述的 浓缩洗液为Tris-HCl或PBST洗涤液。
7. 如权利要求1所述的核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒的制备方法，其特征在 于，包括以下步骤： 配制核基质蛋白22的校准品； 以酶标记核基质蛋白22单克隆抗体； 以核基质蛋白22单克隆抗体包被固相载体； 配制上述酶所作用的发光底物液； 配制浓缩洗液； 分装所述核基质蛋白22的校准品、酶标记的核基质蛋白22单克隆抗体、酶作用的发光 底物液和浓缩洗液，并将各组分装成成品。
8. 如权利要求7所述的核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒的制备方法，其特征在 于，所述发光底物液包含Tris、NaCl、KC1、HC1、3- (2'-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4- (3 "-磷酰氧基）苯基-1，2-二氧乙烷、Proclin 300和双蒸水。
9. 如权利要求7所述的核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒的制备方法，其特征在 于，所述包被固相载体的步骤3)包括以下步骤： 1) 包被 采用柠檬酸缓冲液与核基质蛋白22 (NMP22)单克隆抗体混合配制成包被液，并将所得 包被液负载于固相载体上； 2) 用生理盐水洗涤步骤1)所得载体； 3) 封闭 配制封闭液，pH值为7-7. 5,然后将所得的封闭液负载于步骤2)洗涤后的载体上。
10. 如权利要求9所述的核基质蛋白22化学发光免疫检检测剂盒的制备方法，其特征 在于：所述封闭液为PBS缓冲液。
【文档编号】G01N33/574GK104267197SQ201410573982
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】张华 , 廖钟财 申请人:浙江东方基因生物制品有限公司