赤点石斑鱼成鱼染色体的制备方法
【专利摘要】一种赤点石斑鱼成鱼染色体的制备方法，属于细胞生物学领域，它包括材料前期处理、制备肾细胞悬液、低渗处理、固定、滴片和染色；所述的材料前期处理为采用植物血细胞凝集素体内注射法，按15μg/g鱼体重的剂量，向实验鱼的胸鳍基部注射PHA，24h后按鱼体重2μg/g鱼体重的剂量注射秋水仙素溶液，在2.5-3h后，取出头肾。本发明采用一次注射植物血细胞凝集素的地方法，同时增加注射浓度，在经过24h后就能获得良好的效果，节省了时间。本发明由于赤点石斑鱼的组织细胞特性，按现有技术进行低渗处理时很难得到完整的细胞，因此本发明创造性的改变现有技术，获得了清晰的染色体图片。
【专利说明】赤点石斑鱼成鱼染色体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞生物学领域，具体地涉及一种赤点石斑成鱼染色体的制备方法。
【背景技术】
[0002]染色体标本的制备操作简单、价格低廉、实验场地要求低的特点，一直是传统的生物遗传学研宄技术，染色体标本制备包括:前处理、低渗处理、固定、解离、滴片、染色以及洗片等步骤，在生物遗传学的许多领域得到了广泛应用。但是由于赤点石斑鱼自身的组织特性，按照常规的染色体制备方法，获取困难、成本较高、制作染色体标本效果差、时间长。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种赤点石斑鱼成鱼染色体的制备方法，本发明在常规的染色体制备方法的基础上进行了改进，改变了低渗处理时间及前处理方法，获得了比较理想的染色体图片，同时制备时间缩短。
[0004]本发明是通过如下技术方案来实现的:
[0005]一种赤点石斑鱼成鱼染色体的制备方法，其特征在于它包括材料前期处理、制备肾细胞悬液、低渗处理、固定、滴片和染色；
[0006]所述的材料前期处理为采用植物血细胞凝集素体内注射法，按15 μ g/g鱼体重的剂量，向实验鱼的胸鳍基部注射PHA，24h后按鱼体重2 μ g/g鱼体重的剂量注射秋水仙素溶液，在2.5-3h后，取出头肾；
[0007]所述的低渗处理为将细胞悬液用2200r/min的速度离心5min，弃上清，留底部0.8-lml沉淀，加入7-8mL的0.75g/L的KCl低渗液，30°C下处理25min，低渗后用四层纱布重新过滤一遍。
[0008]本发明还提供一种赤点石斑鱼成鱼染色体的制备方法，它包括材料前期处理、制备肾细胞悬液、低渗处理、固定、滴片和染色，具体步骤如下:
[0009](I)材料前期处理
[0010]所述的材料前期处理为采用植物血细胞凝集素体内注射法，按15 μ g/g鱼体重的剂量，向实验鱼的胸鳍基部注射PHA，24h后按鱼体重2 μ g/g鱼体重的剂量注射秋水仙素溶液，在2.5-3h后，取出头肾；
[0011](2)制备肾细胞悬液
[0012]将头肾组织于0.8% (重量百分比)的生理盐水中清洗，除去血块及其它组织，然后置于盛有0.8% (重量百分比)生理盐水的培养皿中，充分剪碎，再用四层医用纱布滤入离心管内，加入0.8% (重量百分比)生理盐水，用吸管吹打数分钟，静置片刻，制成细胞悬液；
[0013](3)低渗处理
[0014]将细胞悬液用2200r/min的速度离心5min，弃上清，留底部0.8-lml沉淀，加入7-8mL的0.75g/L的KCl低渗液，30°C下处理25min，低渗后用四层纱布重新过滤一遍；
[0015](4)固定
[0016]低渗处理过滤后的滤液2200r/min离心5min，去上清，留底部0.8-lml沉淀，加入7mL卡诺固定液，所述卡诺固定液的成分为甲醇和冰醋酸，甲醇和冰醋酸的体积比为3: 1，用吸管慢慢吹打沉淀至充分混勾，固定30min后2200r/min离心5min，弃上清，留底部0.8-lml沉淀，加7mL固定液，固定，离心，再重复上述步骤两次；
[0017](5)滴片
[0018]第3次固定后弃上清，加步骤(4)所述的卡诺固定液至1.8-2mL，轻轻弹打离心管底部，采用热滴片法进行滴片，所述的热滴片法:将清洁干净的玻片放在50°C的培养箱中预热30min以上，每次取出2张玻片进行滴片，于0.8-lm的高处滴到载玻片上，每片滴1_2滴，自然风干；
[0019](6)染色
[0020]待玻片完全干燥后，用10% (体积比)的Giemsa染液染色30min，后用蒸馏水冲洗干净后晾干，显微镜下观察并拍照。
[0021]本发明与现有技术相比的有益效果:
[0022]本发明采用一次注射植物血细胞凝集素的地方法，同时增加注射浓度，在经过24h后就能获得良好的效果，节省了时间。
[0023]本发明由于赤点石斑鱼的组织细胞特性，按现有技术进行低渗处理时很难得到完整的细胞，因此本发明创造性的改变现有技术一般在37°C条件下低渗处理30-40min的方法，得到本发明的关键技术特征即在30°C条件下低渗处理25min，获得了清晰的染色体图片。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1本发明方法处理后得到的染色体图片
[0025]图2 37 °C低渗处理35min后得到的染色体图片
[0026]图3 37 °C低渗处理40min后得到的染色体图片
【具体实施方式】
[0027]一种赤点石斑鱼成鱼染色体的制备方法，它包括材料前期处理、制备肾细胞悬液、低渗处理、固定、滴片和染色，具体步骤如下:
[0028](I)材料前期处理
[0029]所述的材料前期处理采用植物血细胞凝集素体内注射法，按15 μ g/g鱼体重的剂量，向实验鱼的胸鳍基部注射PHA，24h后按2 μ g/g鱼体重的剂量注射秋水仙素溶液，约3h后断尾失血20min，取出头肾；
[0030](2)制备肾细胞悬液
[0031]将头肾组织于0.8% (重量百分比)的生理盐水中清洗，除去血块及其它组织，然后置于盛有0.8% (重量百分比)生理盐水的培养皿中，充分剪碎，再用四层医用纱布滤入1ml离心管内，加入0.8% (重量百分比)的生理盐水，用吸管吹打数分钟，静置片刻，制成8ml细胞悬液；
[0032](3)低渗处理
[0033]将细胞悬液用2200r/min的速度离心5min，弃上清，留底部0.8-lml沉淀，加入7-8mL的0.75g/L的KCl低渗液，30°C下处理25min，低渗后用四层纱布重新过滤一遍；
[0034](4)固定
[0035]低渗处理过滤后的滤液2200r/min离心5min，去上清，留底部0.8-lml沉淀，加入7mL卡诺固定液，所述卡诺固定液的成分为甲醇和冰醋酸，甲醇和冰醋酸的体积比为3: 1，用吸管慢慢吹打沉淀至充分混勾，固定30min后以2200r/min离心5min，弃上清，留底部0.8-lml沉淀，加7mL固定液，固定，离心，再重复上述步骤两次；
[0036](5)滴片
[0037]第3次固定后弃上清，加卡诺固定液至1.8_2mL，滴片前轻轻弹打离心管底部，分别采用热滴片法进行滴片，所述的热滴片法:将清洁干净的玻片放在50°C的培养箱中预热30min以上，每次取出2张玻片进行滴片，于Im的高处滴到载玻片上，每片滴I_2滴，自然风干；
[0038](6)染色
[0039]待玻片完全干燥后用10% (体积比)的Giemsa染液染色30min，后用蒸馏水冲洗干净后晾干，显微镜下观察并拍照如图1所示。所述的Giemsa染液液为吉姆萨原液:稀释液(磷酸缓冲液)=1:9配成。
[0040]在进行本实施例的同时，本发明前期按照现有技术进行低渗处理，处理条件为0.75g/L的KCl低渗液，37°C下分别处理35、40min，其他操作步骤同本发明实施例，结果如图2、3所示。
【权利要求】
1.一种赤点石斑鱼成鱼染色体的制备方法，其特征在于它包括材料前期处理、制备肾细胞悬液、低渗处理、固定、滴片和染色； 所述的材料前期处理为采用植物血细胞凝集素体内注射法，按15 V 士鱼体重的剂量，向实验鱼的胸鳍基部注射？撤，2处后按2 1^/8鱼体重的剂量注射秋水仙素溶液，在2.5-31！后，取出头肾； 所述的低渗处理为将细胞悬液用220017^111的速度离心5111111，弃上清，留底部0.8-11111沉淀，加入7-84的0.75^/1的低渗液，301:下处理25-11,低渗后用四层纱布重新过滤一遍。
2.根据权利要求1所述的一种赤点石斑鱼成鱼染色体的制备方法，其特征在于它包括材料前期处理、制备肾细胞悬液、低渗处理、固定、滴片和染色，具体步骤如下: (1)材料前期处理 所述的材料前期处理为采用植物血细胞凝集素体内注射法，按15 V 士鱼体重的剂量，向实验鱼的胸鳍基部注射？撤，2处后按2 1^/8鱼体重的剂量注射秋水仙素溶液，在.2.5-31！后，取出头肾； (2)制备肾细胞悬液 将头肾组织于0.8% (重量百分比)的生理盐水中清洗，除去血块及其它组织，然后置于盛有0.8% (重量百分比)生理盐水的培养皿中，充分剪碎，再用四层医用纱布滤入离心管内，加入0.8% (重量百分比)生理盐水，用吸管吹打数分钟，静置片刻，制成细胞悬液； (3)低渗处理 将细胞悬液用220017^111的速度离心5111111，弃上清，留底部0.8-11111沉淀，加入7-81111的0.75^/1的1((:1低渗液，301:下处理25-11,低渗后用四层纱布重新过滤一遍； (4)固定 低渗处理过滤后的滤液220017111111离心5111111，去上清，留底部0.8~11111沉淀，加入71111卡诺固定液，所述卡诺固定液的成分为甲醇和冰醋酸，甲醇和冰醋酸的体积比为3: 1，用吸管慢慢吹打沉淀至充分混勾，固定30111111后220017111111离心5111111，弃上清，留底部.0.8-11111沉淀，加71111固定液，固定，离心，再重复上述步骤两次； (5)滴片 第3次固定后弃上清，加步骤(4)所述的卡诺固定液至1.8-201，轻轻弹打离心管底部，采用热滴片法进行滴片，所述的热滴片法:将清洁干净的玻片放在501:的培养箱中预热30-11以上，每次取出2张玻片进行滴片，于0.8-1111的高处滴到载玻片上，每片滴1-2滴，自然风干； (6)染色 待玻片完全干燥后，用10% (体积比)的以6！11%染液染色30-11，后用蒸馏水冲洗干净后晾干，显微镜下观察并拍照。
【文档编号】G01N1/30GK104483178SQ201410682981
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】陈超, 刘莉, 孔祥迪, 李炎璐, 李娟 , 徐万土, 陈建国, 于欢欢 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所, 上海海洋大学, 象山港湾水产苗种有限公司