一种利用普朗尼克f127和甘薯茎筛选杀线虫剂的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂的方法，属于农药筛选方法领域。本发明以质量百分比为20～40％的普朗尼克F127溶液为基质，将待测药剂和线虫液加入到基质中，在室温下放置48～72h，然后插入甘薯茎，培养3～15d，取出甘薯茎，对侵入甘薯茎的线虫计数，计算防效。与浸渍法相比，本发明方法能够综合评价待测药剂对线虫的致死作用，以及对线虫的活动能力与侵入能力的抑制作用，筛选准确度高，可靠性强；其次，本发明方法所用的甘薯茎以及马铃薯腐烂茎线虫易于在室内扩繁，材料易得，适宜大量药剂筛选；此外，本发明方法以植物寄生线虫为测试对象，与常用的秀丽小杆线虫相比，其检测结果更准确、可靠。
【专利说明】一种利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农药筛选方法领域，具体涉及一种利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选 杀线虫剂的方法。
【背景技术】
[0002] 植物线虫是农业生产的主要病原物之一，每年给世界农业生产造成的经济损失约 1000亿美元。植物线虫的防治方法包括抗病品种、轮作、水淹、曝晒、生物防治等（Roland Ν·Ρ·等.PlantNematology，CABIPublishing. 2013·)，但化学防治依然是快速、经济有效 的防治方法，深受农民的青睐。
[0003] 传统的杀线虫剂筛选多以秀丽小杆线虫（Caenorhabditiselegans)为 测试对象，评价供试药剂对该线虫的毒力（OhbaK等.JournalofPesticide Science，1984, 9:91-96)。目前商品化的杀线虫剂均是以该筛选模式进行初筛获得的，在初 筛的基础上进一步以植物寄生线虫为测试对象，分别以浸渍法、盆栽法以及田间试验等进 行复筛与验证。
[0004] 杀线虫剂对线虫的作用方式有多种（KearnJ等·PesticideBiochemistry andPhysiology. 2014)，但由于线虫的抗逆性较强，对药剂多不敏感，一般情况下杀线 虫剂对线虫的致死作用较差，杀线虫剂主要通过抑制卵孵化、抑制线虫迀移、控制线虫 侵入、抑制线虫发育等复合作用来达到控制线虫的目的（邹雅新等.河北农业大学学 报，2011，34(5) :78-81)。浸渍法是筛选杀线虫剂的主要方法，也是我国测试杀线虫剂生物 活性的标准方法（NY/T1833. 1-2009)。但浸渍法仅能够测试药剂对线虫的致死作用，而无 法评价药剂对线虫卵的抑制作用、以及对线虫活动能力、侵入能力的作用，因此浸渍法会造 成对线虫具有活性物质的漏筛。
[0005] 普朗尼克F127(英文名称：PluronicF127,化学式为：（C3H60.C2H4O)X，又名嵌段 式聚醚、聚醚、环氧丙烷与环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯、聚乙二醇接枝聚丙二醇、泊 洛沙姆、聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物、泊洛沙姆407等）在医学、制药以及化妆领域均有广泛 的应用。20%?25%的普朗尼克F127在低温环境下呈液态，在常温下成半固态。由于该 基质透明，线虫可在该基质内自由活动，适宜用于线虫行为研宄（KoM.P.等.Journalof Nematology，1988, 20:478-485)。OhbaK等认为普朗尼克F127是适宜替代琼脂观察线虫 行为的基质（〇hbaK等.JournalofPesticideScience, 1984, 9:91-96);Congli等利用 该基质研宄番茄、拟南芥等植物对根结线虫的吸引活性（CongliW等，Nematology，2009,V ol.l1(3)，453-464;ΚοΜ·Ρ·等.JournalofNematology，1988, 20:478-485) 〇
[0006] 经检索，没有发现利用普朗尼克F127进行杀线虫剂筛选的研宄报道。
【发明内容】
[0007] 针对现有的筛选杀线虫剂方法中存在的容易造成漏筛的问题，本发明目的在于提 供一种利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂的方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0009] 一种利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂的方法，包括如下步骤：
[0010] (1)、按照质量百分比为20?40%的比例将普朗尼克F127放入蒸馏水中，置于 0?6°C低温下过夜溶解，得普朗尼克F127母液；
[0011] (2)、用蒸馏水将马铃薯腐烂莖线虫（Ditylenchusdestructorthorne)配制成 10?1000头/mL的液体，得线虫液；
[0012] (3)、依据待测药剂的极性用丙酮或水将待测药剂溶解，然后用水稀释为质量体积 比为1?20g/L的待测药剂溶液；
[0013](4)、用质量百分比为0. 1%的吐温80对步骤⑶所得的待测药剂溶液进行梯度稀 释，然后和步骤（2)所得的线虫液一起加入到步骤（1)所得的普朗尼克F127母液中，使普 朗尼克F127的终浓度为18?30% (质量百分比），使线虫液的含量为5?100条/mL;缓 慢振荡混匀，并倒入9cm培养皿中，室温下放置48?72h;
[0014] (5)、在培养皿中央插入长度为0. 5?2.Ocm的甘薯茎段，室温下培养3?15d，然 后将甘薯茎段取出，采用浅盘法分离其中的线虫，计数；以不添加药剂处理为对照；计算待 测药剂的防治效果，在待测药剂的防治效果大于20%时，即说明待测药剂在该测试浓度下 对线虫具有活性；
[0015] 防治效果（％) = (对照处理侵入线虫数量-药剂处理侵入线虫数量）/对照处理 侵入线虫数量X100%。
[0016] 上述方法步骤（1)中所述的低温优选为0?4°C。
[0017] 上述方法步骤（3)中所述的待测药剂是指化学药剂或生物代谢产物等。
[0018] 上述方法步骤（4)中所述的普朗尼克F127的质量百分比优选为23%。
[0019] 上述方法步骤（4)或（5)中所述的室温为20?30°C。
[0020] 上述方法步骤（4)中所述的放置时间优选为48h。
[0021] 上述方法步骤（5)中所述的甘薯茎段长度优选为I. 0cm。
[0022] 上述方法步骤（5)中所述的培养时间优选为5d。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果：（1)本发明方法所用的基质普 朗尼克F127具有在低温下呈液态、常温下呈固态的特性，可以模拟土壤环境进行杀线虫剂 的筛选，将线虫可在放有寄主的普朗尼克F127中有效完成迀移、侵入、发育等过程；与传统 的浸渍法相比，本发明方法能够综合评价待测药剂对线虫的致死作用，以及对线虫的活动 能力与侵入能力的抑制作用，筛选准确度高，可靠性强。（2)本发明方法所用的甘薯茎以及 马铃薯腐烂茎线虫易于在室内扩繁，材料易得，适宜大量药剂筛选。（3)本发明方法以植物 寄生线虫马铃薯腐烂茎线虫为测试对象，由于植物寄生线虫与腐生线虫在食性与生活史上 具有较大差异，因此，与以传统的秀丽小杆线虫（Caenorhabditiselegans)为测试对象相 比，其结果更准确、可靠。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂对比试验
[0025] (一）、试验设计：选用常规杀线虫剂80%涕灭威（山东华阳农药化工集团有限公 司）、95%阿维菌素（河北威远生化农药有限公司）、90%丁硫克百威（江苏嘉隆化工有限 公司）为供试化学药剂，以不添加药剂的处理作为对照。
[0026](二）、试验方法：
[0027] (1)、将35g普朗尼克F127放入IOOml蒸馏水中，置于4°C低温下过夜溶解，得普朗 尼克F127母液。
[0028] (2)、用蒸馏水将马铃薯腐烂莖线虫（Ditylenchusdestructor)配制成100头/mL 的液体，得线虫液。
[0029] (3)、将80%涕灭威、95%阿维菌素、90%丁硫克百威原药3种药剂分别用丙酮溶 解，然后用水稀释成重量体积比为l〇g/L的母液。
[0030] (4)、用质量百分比为0. 1%的吐温80分别将步骤（3)所得的涕灭威、阿维菌素、 丁硫克百威母液进行梯度稀释，然后和步骤（2)所得的线虫液一起分别加入到步骤（1)所 得的普朗尼克F127母液中，使普朗尼克F127的终浓度为为23% (质量百分比），使线虫含 量为50条/mL，使涕灭威、阿维菌素、丁硫克百威的浓度分别为320、160、80、40、20和IOug/ ml;以不添加药剂的处理作为对照；缓慢振荡混勾，并向每个9cm培养皿倒入20ml，室温下 放置48h;
[0031] (5)、在培养皿中央插入长度为LOcm的甘薯茎段，测试品种为冀薯98,25°C黑暗 培养箱内放置72h;然后将甘薯茎段取出，采用浅盘法分离其中的线虫，计数，根据药剂处 理与对照处理的侵入线虫数量计算不同药剂处理对线虫侵入的防治效果；防治效果的计算 公式为：
[0032] 防治效果（％) = (对照处理侵入线虫数量-药剂处理侵入线虫数量）/对照处理 线虫侵入量X100%
[0033] 浸渍法：将涕灭威、阿维菌素、丁硫克百威3种药剂用丙酮溶解，然后用水稀释成 重量百分比为l〇g/L的母液；再用质量百分比为0. 1 %的吐温80依次将各药剂稀释成320、 160、80、40、20和101^/1111，以不添加药剂的处理作为对照处理，加入到9〇11培养皿中，并添 加线虫液混匀，使得线虫数量为50条/mL。25°C黑暗恒温培养箱内放置5d，检查不同处理 的线虫数量，并依据药剂处理与对照处理的死亡率，计算防治效果。
[0034] 结果（见表1)采用冀薯98(感病品种）为线虫寄主，在所有药剂浓度处理中本发 明方法获得的防效均高于浸渍法；此外，两种方法均显示阿维菌素对线虫的毒力最高，在相 同浓度处理条件下其防效显著高于涕灭威和丁硫克百威。上述结果说明本发明方法所得筛 选结果比浸渍法所更灵敏，更准确。
[0035] 表1不同测试方法对不同药剂浓度防效的试验结果
[0036]
【权利要求】
1. 一种利用普朗尼克F127和甘薯茎筛选杀线虫剂的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 、按照质量百分比为20?40%的比例将普朗尼克F127放入蒸馏水中，置于0?6°C 低温下过夜溶解，得普朗尼克F127母液； (2) 、用蒸馏水将马铃薯腐烂莖线虫（Ditylenchus destructor thorne)配制成10? 1000头/mL的液体，得线虫液； (3) 、依据待测药剂的极性用丙酮或水将待测药剂溶解，然后用水稀释为质量体积比为 1?20g/L的待测药剂溶液； (4) 、用质量百分比为0. 1 %的吐温80对步骤（3)所得的待测药剂溶液进行梯度稀释， 然后和步骤（2)所得的线虫液一起加入到步骤（1)所得的普朗尼克F127母液中，使普朗尼 克F127的终浓度为18?30% (质量百分比），使线虫液的含量为5?100条/mL ;缓慢振 荡混匀，并倒入9cm培养皿中，室温下放置48?72h ; (5) 、在培养皿中央插入长度为0. 5?2. 0cm的甘薯茎段，室温下培养3?15d，然后将 甘薯茎段取出，采用浅盘法分离其中的线虫，计数；以不添加药剂处理为对照；计算待测药 剂的防治效果，在待测药剂的防治效果大于20%时，即说明待测药剂在该测试浓度下对线 虫具有活性； 防治效果（％) = (对照处理侵入线虫数量-药剂处理侵入线虫数量）/对照处理侵入 线虫数量X100%。
2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于其步骤（1)中所述的低温为0?4°C。
3. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于其步骤（3)中所述的待测药剂是指化学药 剂或生物代谢产物。
4. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于其步骤（4)中所述的普朗尼克F127的质量 百分比为23%。
5. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于其步骤（4)或（5)中所述的室温为20? 30。。。
6. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于其步骤（4)中所述的放置时间为48h。
7. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于其步骤（5)中所述的甘薯茎段长度为 1. 0cm〇
8. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于其步骤（5)中所述的培养时间为5d。
【文档编号】G01N33/00GK104483447SQ201410697113
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年11月26日 优先权日:2014年11月26日
【发明者】王容燕, 陈书龙, 李秀花, 高波, 马娟 申请人:河北省农林科学院植物保护研究所