专利名称：：一种混合共聚物载体系统组合物及其制备方法
技术领域：
：本发明属生物医药领域，具体涉及一种新型的非病毒基因给药载体-基于普朗尼克(Pluronic)修饰的阳离子树状高分子(Dendrimer)混合共聚物载体系统组合物及其制备方法。
背景技术：
：基因治疗技术已经成为目前国内外生物医药研究的热点领域之一，该技术应用的关键是需要一种安全、高效的基因给药载体系统。目前，基因给药载体主要分为病毒载体和非病毒载体。其中，病毒载体具有非常高的转染效率，而且是目前临床上应用最为广泛的一种基因给药载体，但是病毒载体本身具有很强的免疫原性，具有潜在的与宿主细胞整合的危险性，而且缺乏耙向性，这些缺点严重影响了该类产品的临床应用，如1999年美国重组腺病毒"JesseGelsinger"事件和2000年法国发生的逆转录病毒诱导白血病恶性事件等；因而，近年来非病毒基因给药载体的研究备受关注。目前现有技术公开的非病毒基因给药载体主要有阳离子脂质体(DalbyB，CatesS，etal.Methods,2004，33:95-103)，阳离子聚合物(Boussif0etal.ProcNatAcadSciUSA，1995,92:7297-7301)和纳米粒(HuFQ，etal.InterJPharm.，2006，315:158-166.)等。其中，阳离子脂质体是目前应用最多最为广泛的一种非病毒基因给药载体，其主要由阳离子的磷脂和中性磷脂DOPE二者组成，具有较高的体外转染效率，但是有血浆存在时，转染效率急剧降低，不能用于体内的基因转染，严重限制了其临床应用，而且该载体毒性较强；阳离子聚合物是目前研究较多的另外一种非病毒基因给药载体，如聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)，树桩大分子(PAMAM)以及聚赖氨酸(PLL)和其他的聚阳离子蛋白质如鱼精蛋白等，该类基因给药载体也具有较高的体外转染效率，并且能够促进质粒向细胞核内的转运，可用于体内的基因转染，但同样存在毒性较强，而且很容易聚集的缺点；纳米粒能够克服组织的障碍，具有良好的细胞摄取效果，能够将质粒DNA导入细胞浆内，但转染效率较低。在上述载体材料中，树状高分子(Dendrimers)是人工合成的，高度分支的的聚合物，具有单分散性和完全均一的分子结构。阳离子树状高分子由中心核、内层重复单元和表面端基三部分组成，与一般的线性大分子相比，其特点是1)结构规则，高度对称，分子大小和形状结构可在分子水平精确控制；2)代数较低时为平面结构构型，随代数增加，分支亦增多，由松散状态过渡为球形三维结构，分子内部具有大量的空穴，分子表面的官能团密度则比较致密；3)有较好的反应活性和包容能力。分子内部的空穴结构可容纳小分子药物，表面的官能基团则便于进一步修饰(GraysonSM，Fr6chetJM.ChemRev.2001Dec;101(12):3819-68.)。目前工业化生产的与非病毒基因治疗载体相关的两个树状高分子是聚酉先胺_胺(polyamidoaminedendrimer，PAMAM)禾口聚丙烯亚胺(poly(propyleneimine)denazZdrimers，PPI)，其中前者已有用于体外转染的商品化试剂出售(SuperFect，QiaGen公司)。其中的聚酰胺_胺(polyamidoaminedendrimer，PAMAM)在G3代以上时，分子结构为球状，能更好地容纳表面大量的活性基团。J.P.Behr的研究显示G6代的PAMAM对贴壁细胞和悬浮细胞均具有最佳的转染效率，而较低代数的PAMAM在N/P比较高时(6:1)亦有较高的转染效率，但是这时的转染效率会受到血清的影响；结果还显示PAMAM对细胞的转染效率不受溶酶体裂解剂的影响，认为PAMAM本身具有从溶酶体逃脱的能力，即PAMAM本身具有很强的质子海绵效应，有利于复合物从溶酶体的逃离出来(J.Haensler，F.C.SzokaJr.，Bioconjug.Chem.4(1993)372-379.)。其中的聚丙烯亚胺(poly(propyleneimine)dendrimers，PPI):BerndH.Zinselmeyer对1-5代PPI在A431细胞系上的转染试验显示低代数的PPI(G2和G3)具有较高的转染效率，效率和阳离子脂质载体DOTAP的转染效率相当，高代数的PPI(G4和G5)因具有较大的细胞毒作用而不能单独用于转染(PharmaceuticalResearch,Vol.19，No.7，July2002:960-967)。PPI分子表面的氨基通过碘甲烷季铵盐化以后，不仅降低了细胞毒性，而且提高了体内外的转染效率；有研究体内试验显示，PPI作为基因载体，治疗基因表达的主要器官是肝脏，而不是阳离子脂质载体作为载体时所表达的月市脏(AndreasG.Schatzleina,BerndH.ZinselmeyeJournalofControlledRelease101(2005)247—258)。Pluronic是得到FDA批准的用作药物制剂辅料的一种高分子。它是聚氧乙烯(PE0)-聚氧丙烯(PPO)-聚氧乙烯(PE0)构成的一个三嵌段共聚物。当浓度在CMC以下时，Pluronic在水中以单分子存在，当浓度高于CMC时，自发聚集形成胶束结构，憎水嵌段PP0组成胶束的内核，亲水嵌段PE0位于表面组成亲水性外壳。这种独特的分子结构使Pluronic得到了广泛的应用和研究。Pluronic中的PP0疏水嵌段和细胞膜相互作用，降低细胞膜的微粘度，有利于外源物质进入到细胞内(THEJOURNAL0FPHARMAC0L0GYANDEXPER頂ENTALTHERAPEUTICS,2003，304(2):845-854)。研究显示，Pluronic和裸DNA—起注射到骨骼肌、心肌和肿瘤等组织中，能够增强转基因在这些组织中的表达强度和持续时间；Nguyen以Pluronic-PEI(2K)压縮质粒DNA，并于体系中加入游离的P123，结果形成100-160nm的粒子，这些粒子在血清存在的条件下并不聚集，相对于单独的PEI而言，体内外的基因递送效果均提高。而且，以亲水性的PluronicF127代替载体系统中的P123，转染效率并没有降低。该聚合物载体系统实际上是电中性的，而且体内外的毒性均很小(GeneTher即y(2000)7，126-138)。
发明内容本发明的目的是提供一种新型的非病毒基因给药载体_混合共聚物载体系统，具体涉及一种非病毒基因给药载体-基于普朗尼克(Pluronic)修饰的阳离子树状高分子(Dendrimer)混合共聚物载体系统组合物及其制备方法。本发明采用Pluronic修饰的阳离子树状高分子、游离Pluronic和质粒DNA共同制备混合共聚物载体系统，作为一种新型非病毒基因给药载体，具有较高的体外细胞转染效率。具体地，本发明以Pluronic修饰阳离子树状高分子，通过凝聚法制备混合共聚物载体系统，以绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N2)和虫荧光素酶质粒(pLuc-promotor)作为报告基因，测试了大量不同的高分子的体外转染效率，尤其考察该载体系统对SPC-A1、CH0、293T等细胞的转染效率，结果显示，Pluronic修饰PPI树状高分子毒性较小，能够非常高效地转染细胞，尤其对SPC-A1、CH0、293T等细胞具有比较高的转染效率。本发明合成了一系列的Pluronic修饰的PPI阳离子树状高分子，分别PluronicL61、P123和F123与PPI反应，得到不同修饰度的Pluronic-PPI高分子。所述混合共聚物载体系统中的Pluronic主要有P123、P85、P84、P103、P104、L61、L62、L64、L81、和L92或其中任意两种或两种以上的混合物。优选P123、P84、L64或其中任意两种或两种以上的混合物。所述混合共聚物载体系统中的阳离子树状高分子Dendrimer主要有PPI(聚丙烯亚胺)、PAMAM(聚酰胺-胺)和PLL(聚赖氨酸)。本发明混合共聚物载体系统组合物可通过凝聚法制备。本发明综合了阳离子树状高分子和Pluronic的优点，以Pluronic修饰阳离子树状高分子作为非病毒基因给药载体，发挥两种高分子各自的优点和相互协同作用。其中的Pluronic可以增大细胞膜的流动性，利于载体系统进入胞质内，同时可以降低载体系统和血浆蛋白的相互作用，保护pDNA不受核酸酶降解，延长载体系统在血液循环系统中的时间，发挥纳米载体系统治疗肿瘤的EPR(通透性增强和滞留)效应；树状高分子压縮、包裹质粒DNA，进入溶酶体后，其强烈的质子海绵效应利于其逃离出来免受降解。图1是逆转肿瘤MDR混合共聚物载体系统原理图。图2是混合共聚物载体系统示意图。图3是P123-2.5g-PPI在N/P比5和10时，添加不等量P123对酶切保护的影响。图4是P123-2.5g-PPI在N/P比10、添加不等量P123对血清解离的抵抗作用。图5是P123-2.5g-PPI/P123在N/P比10、添加不等量P123对抗肝素钠的解离作用。图6是不同N/P比P123-2.5g-PPI/DNA在血清存在与否条件下转染SPC-A1细胞的转染效率。图7是P123-2.5g-PPI在N/P20和30时血清存在与否条件下的荧光图谱。图8是N/P比20时MCS在血清存在与否条件下转染SPC-A1细胞的转染效率。图9是P123-2.5g-PPI在N/P10和20、血清存在与否条件下转染SPC-A1的虫荧光素酶活性。图10是FBS对P123-2.5g-PPI/3P123/DNAN/P20的转染效率的影响。图11是P123-2.5g-PPI/3P123/DNAN/P20在不等量FBS条件下转染SPC-A1细胞的荧光图谱。具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1合成P123-PPI称2.0克Pluronic于50ml圆底烧瓶中，于50。C烘箱真空干燥过夜，加入20ml无水乙腈，完全溶解后，于4(TC油浴、磁力搅拌的条件下，缓慢滴加溶解于10ml无水乙腈中的等摩尔的CDI，约在30min之内滴加完毕，然后于4(TC油浴、磁力搅拌的条件反应10hr。反应结束后，往反应体系中加入等体积的纯水，然后进行透析(透析介质20%乙醇溶液，截留分子量3500)以去除小分子的咪唑。透析结束后，开始和PPI的接枝反应，室温下反应48hr。不同型号的Pluronic，因水溶性不同，故接枝反应体系也不同。结果表明，接枝反应的投料比不同时，得到不同修饰度的PPI高分子，如一个PPI分子上平均接1个或2个P123分子。实施例2凝聚法制备混合共聚物载体系统制备步骤如下(1)于5个0.5mlEP管中，各加入135yl质粒DNA(100yg/ml)，再分别加入纯水160、156、148、124和87ii1和50mg/mlP123溶液0、4.1、12.2、36.5和73iil，并混匀。(2)于5个0.5mlEP管中，分别各加入P123-2.5g-PPI81ii1(2.5mg/ml)和纯水40iil，并混匀。(3)将(2)—次性加入(1)中，立即混合均匀，于室温下孵育15min，然后测定粒径和l电位。得到的混合共聚物载体系统的粒径和l电位表征结果如下表所示表1、混合共聚物载体系统的粒径和zeta电位<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例3混合共聚物载体体外抵抗DNaseI酶解、血清解离和肝素钠解离作用该系列以体外实验分别考察了混合共聚物载体系统抵抗DNaseI酶解、血清解离和肝素钠解离作用，以此预测其应用于体内的可能性。结果显示N/P比5时，游离P123的加入能够增加P123-2.5g-PPI的酶切保护作用，但和P123量的多少无明显关系；N/P比10，游离P123的加入不改变P123-2.5g-PPI的酶切保护作用。表明复合物的电泳行为不受血清的影响，即所述的载体材料能够保护质粒DNA不受血清的解离作用。另一方面，血清可以和裸DNA相互结合，导致DNA电泳行为的显著改变。本发明所述的混合共聚物载体系统抗DNaseI酶解、血清和肝素钠解离作用的实验结果说明，当静注用于体内转染时，该系统能够在一定程度上克服血清的影响，具有较高的体内转染效率。实施例4混合共聚物载体介导绿色荧光蛋白报告基因和虫荧光素酶报告基因的转染材料和仪器NIKONEclipseTS100倒置光学显微镜；NIKONTE-2000倒置荧光显微镜；microplateL咖i謹eterTR717型发光测定仪(AppliedBiosystems);荧光光谱仪(LS55，PerkinElmer公司)；TECANSafire2酶标仪；细胞培养耗材(BDFalcon公司)；胎牛血清(Hyclone);胰酶-EDTA(Gibco公司)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；DMEM培养液(Gibco公司)；虫荧光素酶测定试剂盒(BioTherm公司)；BCA蛋白定量试剂盒(上海尚谊化工有限公司)实验方法a.制备各种PPI/DNA、Plu-PPI/DNA复合物以P123-2.5g-PPI/DNA的N/P比20，添加0、1、3、9、18倍游离P123的MCS的制备步骤为例，说明如下(1)于5个0.5mlEP管中，各加入20质粒DNA(100iig/ml)，再分别加入纯水39.3、38.1、35.7、28.5和17.7ii1和50mg/mlP123溶液0、1.2、3.6、10.8和21.6iil，并混匀。(2)于另外5个0.5mlEP管中，分别各加入P123-2.5g_PPI24ii1(2.5mg/ml)和纯水50iil，并混匀。(3)将(2)—次性加入(1)中，立即涡旋20s，于室温下孵育15min，然后24孔板每孔加入501复合物溶液(含质粒0.75g)。其他复合物的制备方法以此类推，尽量保证转染时每孔加入的复合物溶液体积为50iU，且含质粒的量为0.75iig。b.细胞培养SPC-A1、CH0、293T均以含10%FBS(V/V)DMEM(高糖)为培养液(不含双抗)，在二氧化碳培养箱中(37t:、5XC02、饱和湿度)连续培养，生长至80-90%融合度时传代或铺板。传代时以胰酶(0.1%Trypsin+O.02%EDTA)消化，以1:3传代。c.细胞的转染转染前一天，消化细胞，计数，以2X105个/1.Oml/孔均匀接种到24孔板中，第二天当细胞融合度达80-90%时，开始转染操作，吸弃旧的培养液，每孔加入0.45ml新鲜的培养液，然后将制备好的复合物加入(约50iU)，每孔中质粒为0.75g，每种处方做两个或者三个复孔。轻轻摇动24孔板使复合物均匀存在于孔中。培养箱中培养4hr后，吸弃含有复合物的培养液，PBS轻轻洗涤一遍，换上含10%FBS的完全细胞培养液。每天换以新鲜的培养液，继续培养48hr，；同时操作阳离子脂质体LipOfectamineTM2000作为阳性对照。d.流式细胞仪法和荧光分光光度计法评价绿色荧光蛋白报告基因体外细胞转染效率流式细胞仪法评价绿色荧光蛋白报告基因体外细胞转染效率转染48hr后，吸弃培养液，PBS轻轻洗涤两遍，每孔加入2滴PBS和1滴胰酶消化细胞。将细胞收集至1.5mlEP管中，1500rpm，5min离心，弃去上清如果可以马上测流式，每管中加入适量的PBS，使细胞浓度大约在5X105个/ml，细胞重悬均匀后，即可上机测试，每次测试计数3万个细胞；如果需要等一段时间才能测流式(超过1天)，弃上清后在每管中加入0.8ml2.5%的多聚甲醛，重悬均匀后室温下固定30min，再次离心后，弃上清后以适量PBS重悬细胞，放置于4t:冰箱，待上机测试。荧光分光光度计法评价绿色荧光蛋白报告基因体外细胞转染效率转染48hr后，吸弃培养液，PBS轻轻洗涤两遍，每孔加入2滴PBS和1滴胰酶消化细胞。将细胞收集至1.5mlEP管中，1500rpm，5min离心，弃去上清，每管加入0.2mlPBS，重悬均匀后全部吸至白色不透明的96孔板中，设定激发波长490nm，发射波长509nm测定绿色荧光蛋白的荧光强度。e.虫荧光素酶活性法评价复合物体外细胞转染效率转染48hr后，吸弃培养液，PBS轻轻洗涤两遍，每孔加入100y1细胞裂解液，室温条件下，摇床上摇荡30min，使细胞充分裂解，离心(4t:、8000rpm、15min)，取上清10iU，在发光测定仪上以虫荧光素酶试剂盒测定虫荧光素酶的活性，参数设置为delaytime2s，measureinterval10s，同时以BCA试剂盒测定细胞裂解液中蛋白质的含量，计算每mg总蛋白的相对光度单位(relativeluminescenceunits,RLU)。结果显示随着N/P比的增加，P123-2.5g_PPI的转染效率逐步提高，N/P20时达到平台状态。当N/P比低于20时，血清的加入明显降低转染效率；当N/P比高于20时，血清的加入对转染效率影响不明显。无血清条件下转染时，P123的加入均降低了转染效率，而P123加入的量与降低程度无相关性；在血清存在条件下转染时，P123的加入均显著提高转染效率，当P123的量在1倍和3倍质量比时，提高程度最明显，当P123的量在9倍和18倍质量比时，与对转染效率的提高程度有所降低。转染体系中血清的浓度对MCS的转染效率影响很大，在胎牛血清含量少于25%(V/V)时，转染效率均较高，当胎牛血清含量为50X时，严重削弱MCS的转染能力。Lipofectamine2000在50%胎牛血清存在下仍能够明显转染SPC-A1。实验结果证明了Pluronic修饰PPI树状高分子制备的混合共聚物载体系统转染绿色荧光蛋白质粒和虫荧光素酶报告质粒的效率均高于阳性对照Lipofectamine2000，即混合共聚物载体系统具有较高的体外转染效率。权利要求一种混合共聚物载体系统组合物，其特征是由聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物Pluronic修饰的阳离子树状高分子、游离聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物和质粒DNA组成。2.按权利要求l所述的混合共聚物载体系统组合物，其特征是所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯_聚氧乙烯共聚物Pluronic选自P123、P85、P84、P103、P104、L61、L62、L64、L81、或L92或其中任意两种或两种以上的混合物；所述的阳离子树状高分子Dendrimer选自聚丙烯亚胺PPI、聚酰胺_胺PAMAM或聚赖氨酸PLL。3.按权利要求l所述的混合共聚物载体系统组合物，其特征是所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物，Pluronic，是P123、P84、L64或其中任意两种或两种以上的混合物。4.按权利要求2所述的混合共聚物载体系统组合物，其特征是所述的聚氧乙烯_聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物修饰的阳离子树状高分子分别为PluronicL61、P123和F123与PPI反应，得到不同修饰度的Pluronic-PPI高分子。5.—种混合共聚物载体系统组合物的制备方法，其特征是采用凝聚法，将Pluronic修饰的阳离子树状高分子Pluronic-PPI和游离的Pluronic与含有治疗基因的质粒DNA于纯水中混合后，涡旋，室温下孵育15min，得到非病毒基因治疗载体系统。6.按权利要求5的制备方法，其特征是制得的混合共聚物载体系统的粒径和l电位表征如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>7.权利要求1所述的混合共聚物载体系统组合物在制备非病毒基因给药载体中的用途。全文摘要本发明属生物医药领域，提供一种新型的非病毒基因给药载体-混合共聚物载体系统，本发明采用Pluronic修饰的阳离子树状高分子、游离Pluronic和质粒DNA共同制备混合共聚物载体系统，体外实验表明，所述的混合共聚物载体系统是一种非常高效的非病毒基因给药载体，可以有效地压缩和包裹质粒DNA，抑制DNaseI对质粒的降解作用，抵抗肝素钠和血清对MCS/DNA的解离作用。作为一种新型非病毒基因给药载体，具有较高的体外细胞转染效率。文档编号A61K31/7088GK101766824SQ20081020536公开日2010年7月7日申请日期2008年12月31日优先权日2008年12月31日发明者张志文,方晓玲,李雅娟,沙先谊,蒋晔,郝俊国申请人:复旦大学