一种比色法同时检测葱属总硫化物含量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种比色法同时检测葱属总硫化物含量的方法，方法包括：制备显色剂溶液及配制葱属硫化物标准溶液；向10mL的具塞比色管中依次加入待测样品、pH值为7.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液2.0mL和浓度为4.0×10-4mol/L显色剂标准溶液1.0mL，摇匀，显色剂标准溶液加磷酸盐缓冲液作空白，置于1cm比色皿比色，495nm波长处测定溶液的吸光度A，计算葱属样品中总硫化物的含量，本方法能实现同时检测半胱氨酸衍生物、半胱氨酸亚砜衍生物(蒜氨酸)、γ-谷氨酰-半胱氨酸衍生物等硫化物，及其后期代谢分解产生的硫化物均有较好响应，具有操作简单，响应速度快，线性和重现性好，灵敏度高等优点。
【专利说明】一种比色法同时检测葱属总硫化物含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于有机硫化物检测【技术领域】，具体为一种比色法同时检测葱属总硫化物 含量的方法。
【背景技术】
[0002] 硫取代的半胱氨酸衍生物及挥发性有机硫化物是重要的植物次生代谢产物，广泛 存在真菌、藻类及豆类作物中。葱属作物（如大蒜、洋葱、韭菜、大葱、细香葱、小根蒜等）因 含有多种硫化物而具有生理生化活性。烷基（烯基）半胱氨酸亚砜（蒜氨酸）是葱属的一 类主要硫化物，是大蒜素的代谢前体；同时鲜蒜中还含有γ-谷氨酰-烷基（烯基）半胱氨 酸肽类物质，它并非蒜酶的底物，不直接参与到风味物质的形成，是烷基（烯基）半胱氨酸 亚砜类的代谢前体物质。此两类物质是葱属作物中其它硫化物的转化来源，它们之间存在 比例平衡及转化，含量因葱属作物生长状态及贮藏方式不同而变化。这些存在于葱属作物 的硫化物由于具有显著有益健康特性正逐渐受到广泛关注。
[0003] 定量检测葱属硫化物含量对于食品工业以及功能活性药学研宄都是非常必要的。 目前，能用于测定硫化物的方法主要有毛细管电泳法（CE)、气相色谱法（GC)和高效液相色 谱法（HPLC)、Ν-甲基-N-羟乙基苯胺方酸氰比色法（检测半胱氨酸）、茚三酮比色法（检测 含硫氨基酸）、DTNB比色法（检测巯基硫化物）等方法。毛细管电泳法、气相色谱法只能检 测半胱氨酸亚砜类硫化物，且需要对样品进行柱前衍生操作，另外气相色谱检测还受到检 测样品气化能力及高温分解等因素制约，技术受到限制；高效液相色谱法使用较普遍，常见 柱前衍生剂有邻苯二甲醛/叔丁基硫醇、苯基异硫氰酸酯、芴甲基氯甲酸酯、丹磺酰氯等。 只有丹磺酰氯衍生处理能较好地实现样品中烷基（烯基）半胱氨酸亚砜和γ-谷氨酰-烷 基（烯基）半胱氨酸两类硫化物的同时检测，其它几种衍生方法由于稳定性、灵敏度、衍生 能力等原因都不能将所有两类硫化物完全检出。不论CE、GC还是HPLC检测方法均属于大 型仪器检测法，需要购买昂贵的仪器设备，且需复杂的衍生化处理，定量需要标准品，这些 都极大地限制了大型仪器检测法的使用。其它比色法如N-甲基-N-羟乙基苯胺方酸氰法 只能检测半胱氨酸；茚三酮法只能实现对氨基酸检测，检出限属于较低的mg/mL级别，灵敏 度受不同种类氨基酸影响较大，对含硫氨基酸如Cys、Met显色响应更低；DTNB法只能检测 巯基硫化物或者能还原成巯基硫化物的物质。因此，开发出一种操作简便快捷、成本低、灵 敏度高、并能实现对葱属所有种类硫化物的同时检测的比色方法具有重要的理论和实践意 义，这种检测方法将在食品工业及药物活性成分检测方面具有潜在应用。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中存在的问题和不足，本发明提供了一种比色法同时检测葱属 总硫化物含量的方法，该方法具有操作简单、显色快速、选择性好、灵敏度高、并能实现对葱 属所有种类硫化物的同时响应，可快速准确地用于葱属作物及其制品中总硫化物含量的检 测。其技术方案为：
[0005] 一种比色法同时检测葱属总硫化物含量的方法，包括以下步骤：
[0006] (1)显色剂碘铂酸标准溶液（4.0Xl(T4mol/L)的制备
[0007] 于50mL容量瓶中准确称取20. 6mg(0. 02mmol)的碘铂酸盐，加IOmL水溶解，用 lmol/L冰乙酸定容至50mL，冷藏避光备用；
[0008] (2)硫化物标准溶液的配制：
[0009] 使用的硫化物标准品分别是还原型谷胱甘肽（GSH)、L_半胱氨酸（L-Cys)、S_烯丙 基-L-半胱氨酸亚砜（PeCSO)、γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸（GSAC);
[0010] 配置的硫化物标准品线性范围分别是GSH: 1-30μg/mL;L-Cys: 1-6μg/mL; PeCSO:5-30μg/mL;GSAC:100-600μg/mL，绘制标准曲线，硫化物标准品现用现配；
[0011] (3)葱属作物样品的前处理
[0012] 仔细剥好的葱属作物样品，清水洗净再用去离子水冲洗，取5g样品置于烧杯中， 加入80mL乙醇/水（70 : 30,v/v)溶液，水浴至沸腾并保持5min，取出冷却至室温；勾浆 后用乙醇/水（70 : 30，v/v)溶液定容至100mL，8000r/min离心15min，清液用0-45μπι膜 过滤后备用；
[0013] (4)葱属作物样品中总硫化物浓度的测定
[0014] 取40yL上步清液于IOmL具塞比色管中，于40°C烘箱中烘烤直至溶剂烘干，冷却 后添加2.OmLpH7. 0的0. 2mol/L磷酸盐缓冲溶液（含3mmol/L的EDTA)及I.OmL浓度为 4.0Xl(T4m〇l/L显色剂标准溶液，摇匀；以显色剂标准溶液（ImL)加磷酸盐缓冲液（2mL)作 空白，放置Icm比色皿中比色，在该显色剂的最大吸收波长495nm处测得吸光度为A，选择硫 化物标准品绘制标准曲线，或者利用实验测得的摩尔消光系数（ε)，计算得到以该种硫化 物标准品表示的总硫化物浓度。
[0015] 所述步骤（1)中显色剂碘铂酸盐在495nm处有强吸收，半峰宽25nm，使用lmol/L 冰醋酸提供酸性环境。
[0016] 所述步骤（2)中选用硫化物标准品分别为还原型谷胱甘肽（GSH)、L-半胱氨 酸（L-Cys)、S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜（PeCSO)、γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸 (GSAC)〇
[0017] 所述步骤（3)中葱属作物样品灭酶条件为水浴至沸腾并保持5min，所用提取剂乙 醇与水体积比为70 : 30。
[0018] 所述步骤⑷中配制的pH7. 0的0· 2mol/L磷酸盐缓冲溶液中含3mmol/L的EDTA， 提高比色精确度。
[0019] 所述步骤（4)中四种硫化物标准品在此显色剂条件下摩尔消光系数（ε)分别为 GSH：2. 22ΧIO3L/(mol·cm) ,L-Cys：3. 77XIO3L/(mol·cm),PeCSO：1. 51XIO3L/(mol·cm), GSAC:3. 38XIO2IV(mol·cm)。
[0020] 所述步骤⑷中，利用实验所得摩尔消光系数（ε)的计算公式为c=ΛΑ/ (εXI)，c为葱属总硫化物的微摩尔浓度，单位为mol/L;1为光径，单位为cm;ε的单位为 L/(mol·cm)〇
[0021] 所述步骤（4)中，四种标准品对应的标准曲线分别是GSH:y= 0. 002+0. 0072x、 L-Cys：y= -〇.00365 + 0.03 157x,PeCSO：y= 0.0294 + 0.00752x,GSAC：y= 0.03073+2. 86E-4x〇
[0022] 所述步骤⑷中，四种标准品各自的LOD与LOQ分别为：GSH，LOD是(λ23μg/ml， LOQ是 0· 69μg/ml;L-Cys，L0D是 0· 21μg/ml，L0Q是 0· 63μg/ml;PeCS0，L0D是 0· 66μg/ ml，LOQ是I. 99μg/ml;GSAC，LOD是 5· 77μg/ml，LOQ是 17. 48μg/ml。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0024] 本发明从比色原理着手，并对该比色分析方法的各项指标进行了评价，这些指标 包括：最低检出限（LOD)、最低定量限（LOQ)、可重复性、重现性、准确度、精确度、摩尔消光 系数（ε)和溶剂干扰等方面进行了评价。
[0025] 比色原理
【权利要求】
1. 一种比色法同时检测葱属总硫化物含量的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 显色剂碘铂酸标准溶液（4.0Xl(T4m〇l/L)的制备 于50mL容量瓶中准确称取20. 6mg的碘铂酸盐，加10mL水溶解，用lmol/L冰乙酸定容 至50mL，冷藏避光备用； (2) 硫化物标准溶液的配制： 使用的硫化物标准品分别是还原型谷胱甘肽GSH、L-半胱氨酸L-Cys、S-烯丙基-L-半 月光氨酸亚讽PeCSO、y -谷氨酰-S-稀丙基-L-半脫氨酸GSAC ; 配置的硫化物标准品线性范围分别是GSH : 1-30 y g/mL ;L-Cys : 1-6 y g/mL ;PeCS0 : 5-30 y g/mL ;GSAC :100-600 y g/mL，绘制标准曲线，硫化物标准品现用现配； (3) 葱属作物样品的前处理 仔细剥好的葱属作物样品，清水洗净再用去离子水冲洗，取5g样品置于烧杯中，加入 80mL乙醇/水溶液，水浴至沸腾并保持5min，取出冷却至室温；匀浆后用乙醇/水溶液定容 至100mL，8000r/min离心15min，清液用0. 45 y m膜过滤后备用； (4) 葱属作物样品中总硫化物浓度的测定 取40 y L上步清液于10mL具塞比色管中，于40°C烘箱中烘烤直至溶剂烘干，冷却后添 加2. OmL pH 7. 0的0. 2mol/L磷酸盐缓冲溶液及1. OmL浓度为4. 0 X l(T4m〇l/L显色剂标准 溶液，摇匀；以显色剂标准溶液lmL加磷酸盐缓冲液2mL作空白，放置lcm比色皿中比色，在 该显色剂的最大吸收波长495nm处测得吸光度为A，选择硫化物标准品绘制标准曲线，或者 利用实验测得的摩尔消光系数e，计算得到以该种硫化物标准品表示的总硫化物浓度。
2. 根据权利要求1所述的比色法同时检测葱属总硫化物含量的方法，其特征在于，所 述步骤（1)中显色剂碘铂酸盐在495nm处有强吸收，半峰宽25nm，使用lmol/L冰醋酸提供 酸性环境。
3. 根据权利要求1所述的比色法同时检测葱属总硫化物含量的方法，其特征在于，所 述步骤（3)中葱属作物样品灭酶条件为水浴至沸腾并保持5min，所用提取剂乙醇与水体积 比为70 : 30。
4. 根据权利要求1所述的比色法同时检测葱属总硫化物含量的方法，其特征在于，所 述步骤（4)中配制的pH 7. 0的0. 2mol/L磷酸盐缓冲溶液中含3mmol/L的EDTA，提高比色 精确度。
5. 根据权利要求1所述的比色法同时检测葱属总硫化物含量的方法，其特征在于， 所述步骤（4)中四种硫化物标准品在此显色剂条件下摩尔消光系数（e)分别为GSH: 2. 22X 103L/(mol ：3. 77X 103L/(mol *cm),PeCS0 ：1. 51X103L/(mol *cm),GSAC ： 3. 38X 102L/(mol ? cm) 〇
6. 根据权利要求1所述的比色法同时检测葱属总硫化物含量的方法，其特征在于，所 述步骤（4)中，利用实验所得摩尔消光系数e的计算公式为c= AAAe Xl)，c为葱属总 硫化物的微摩尔浓度，单位为mol/L ;1为光径，单位为cm ; e的单位为L/ (mol ? cm)。
7. 根据权利要求1所述的比色法同时检测葱属总硫化物含量的方法，其特征在于， 所述步骤（4)中，四种标准品对应的标准曲线分别是GSH :y = 0. 002+0. 0072x、L-Cys :y =-0. 00365+0. 03157x, PeCSO ：y = 0.0294+0. 00752x, GSAC ：y = 0.03073+2. 86E-4x〇
8. 根据权利要求1所述的比色法同时检测葱属总硫化物含量的方法，其特征在于， 所述步骤⑷中，四种标准品各自的LOD与LOQ分别为：GSH，LOD是0. 23 y g/ml，LOQ是 0? 69 y g/ml ;L-Cys，LOD 是 0? 21 y g/ml，LOQ 是 0? 63 y g/ml ;PeCS0, LOD 是 0? 66 y g/ml，LOQ 是 1. 99 y g/ml ;GSAC，LOD 是 5. 77 y g/ml，LOQ 是 17. 48 y g/ml。
【文档编号】G01N21/31GK104483277SQ201410759286
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月6日 优先权日:2014年12月6日
【发明者】白冰, 陈璐琭, 张瑶, 檀德宏, 刘玲, 蒋东华, 吴朝霞, 程顺昌, 魏宝东, 纪淑娟 申请人:沈阳农业大学