技术领域本发明属于分析检测技术领域，公开了采用大体积进样-pH动态连接-扫集微乳毛细管电泳(LVSS-DypH-MEEKC)测定化妆品中多环芳烃中性分子的方法。
背景技术：
多环芳烃(PAHs)多为脂溶性高、疏水性强的中性分子，可诱发皮肤癌、阴囊癌和肺癌，是重要的环境和食品污染物。《化妆品卫生规范》规定，苯并[g,h,i]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]荧蒽、苯并[a]蒽、荧蒽等多环芳烃化合物为化妆品中禁用物质。目前，PAHs的主要分析技术有高效液相色谱法(HPLC)气相色谱法(GC)。有些PAHs不能用GC直接分析。而对于结构相似的PAHs，利用HPLC分析，灵敏度和分离度均较低。毛细管电泳方法具有仪器简单、操作方便、分离效率高、分析速度快、操作模式多等特点，越来越广泛地应用于各类样品的分析。目前已有一些利用胶束毛细管电泳(MEKC)和填充毛细管色谱(CEC)成功分离PAHs的例子。但是传统毛细管电泳方法的检测灵敏度较低，不能满足质量监控要求。在线富集技术仅通过对缓冲液组成和进样程序进行调控就可显著提高检测灵敏度，近年来成为毛细管电泳分析领域的研究热点。在线富集技术大致可分为样品堆积技术、扫集术、等速电泳等，其中堆积技术往往在进样时实现，可与后几种技术联用，进一步改善灵敏度。大体积进样电堆积是常规电堆积模式的一种特殊形式，能有效地克服常规堆积技术进样体积的限制，使检测灵敏度提高二个数量级以上。在MEEKC方法中，样品与含有更高容量因子的微乳粒子的作用增强，浓缩程度增加，使检测灵敏度显著提高。
技术实现要素：
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于将大体积进样、pH动态连接及扫集相联用的方式对PAHs进行富集分离，通过改变携带分析物前进的微乳粒子的迁移速度，在pH连接区带上产生堆积，不需要转变极性就可以实现大体积进样堆积，实现对PAHs的灵敏检测。本发明的目的通过下列的技术方案实现：在反向电压下，利用合适的LVSS-DypH-sweep体系同时分离分析六种强亲脂性的多环芳烃中性分子，达到同时检测的目的。该本发明的检测步骤如下：(1)准确称取六个标准品，用二氯甲烷及乙醇溶解定容在5mL的容量瓶中，配成2g/L的贮备液，在-18℃下避光保存。(2)在反向电压下，采用大体积进样-pH动态连接-扫集微乳毛细管电泳(LVSS-DypH-MEEKC)测定6种多环芳烃，得6种PAHs的标准品的正向MEEKC电泳谱图(3)采用LVSS-DypH-sweep体系，利用微乳毛细管电动色谱法，在最佳检测条件下，对样品的提取液进行分析，获得样品的毛细管电泳图。(4)根据六种多环芳烃的校正曲线方程，计算出步骤(3)中化妆品样品中的多环芳烃的含量。本发明采用的最佳检测条件为：微乳液的组成为：SDS2.4％(w/w)、正辛烷0.6％(w/w)、正丁醇6.6％(w/w)、20mmol/LNaH2PO4缓冲液(pH2.2)。高导缓冲液(HCB)组成为：20mmol/LNaH2PO4(pH2.2)-乙腈(80:20v/v)。样品基质为：SDS2.4％(w/w)-正丁醇6.6％(w/w)-正辛烷0.6％(w/w)、0.2mmol/L硼砂缓冲液(pH7.8)-20％乙腈。紫外检测波长为280nm，运行电压为-20kV，温度为20℃。步骤(3)所述样品提取液采用以下步骤获得，在一定量的样品中，加入10mL正己烷-丙酮(1:1；v/v)溶液，超声20min后，利用高速离心机离心5min，取上清液，在下层残渣中再加入10mL正己烷-丙酮(1:1v/v)溶液，操作方法同上，重复提取三次，合并上清液，膏霜类化妆品在上述步骤基础上再重复提取两次上层清液，合并上清液。将上清液放入冰箱内冷冻5min；冷冻后的提取液取出后用0.45μm过滤膜过滤，并定容于50mL容量瓶中。将滤液再用二氯甲烷液液萃取4次，每次10mL，合并上层环己烷相，浓缩至约2mL。在最佳的检测条件下，六种多环芳烃在9分钟内达到基线分离，显示了良好的分离选择性和灵敏度。六个物质在该方法的线性范围分别为50-4.0×103ng/mL，15-1.5×102ng/mL，10-1.0×104ng/mL，50-4.0×103ng/mL，1.0×102-1.0×104ng/mL，87.5-7.0×104ng/mL。检出限为38.0ng/mL，8.75ng/mL，57.5ng/mL，23.6ng/mL，84.0ng/mL，48.6ng/mL(S/N＝3)，峰面积的相对标准偏差(RSD)小于5.1％。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：(1)本发明为化妆品的质量控制提供技术支持，检测快速；(2)环境友好，经济环保，所用的缓冲液多为水相，无需消耗大量的有机溶剂，比液相色谱更环保，更有利于检测者的身体健康；(3)分析成本低，所需样品和溶剂都很少，检测一个样品消耗的缓冲溶液不到1mL，且不需要特殊的色谱柱，仅使用普通的空心毛细管柱，价格比一般的色谱柱要低好几倍。(4)该方法不仅可以用于多环芳烃的检测，而且为结构及性质较为相近的其它中性化合物的分离富集提供一个有效的参考。附图说明图1为LVSS-DypH-sweep原理图。其中(A)大体积进样；(B)动态pH连接；(C)扫集；(D)MEEKC模式分离。图2标准品的LVSS-DypH-sweep电泳谱图。其中1.苯并[g,h,i]芘，2.二苯并[a,h]蒽，3.苯并[a]芘，4.苯并[b]荧蒽，5.苯并[a]蒽，6.荧蒽。具体实施方案实施例：1、材料与方法(1)试验材料：某品牌化妆品中的乳液。(2)仪器及色谱条件：TH-3100高效毛细管电泳仪。采用未涂层石英毛细管(总长度为65cm，有效长度50cm，柱内径为50μm)为分离通道，以20s/16Kpa的方式进高导区带(HCB)，然后80s/16Kpa方式进样，紫外检测波长280nm，运行电压-20kV，温度20℃。(3)多环芳烃标准溶液的配制：准确称取六个标准品，用二氯甲烷及乙醇溶解定容在5mL的容量瓶中，配成2g/L的贮备液，在-18℃下避光保存。(4)样品溶液制备：准确称取2.00g待测化妆品，加入10mL正己烷-丙酮(1:1；v/v)溶液，超声20min后，利用高速离心机离心5min，取上清液，在下层残渣中再加入10mL正己烷-丙酮(1:1v/v)溶液，操作方法同上，重复提取三次，合并上清液，膏霜类化妆品在上述步骤基础上再重复提取两次上层清液，合并上清液。将上清液放入冰箱内冷冻5min；冷冻后的提取液取出后用0.45μm过滤膜过滤，并定容于50mL容量瓶中。将滤液再用二氯甲烷液液萃取4次，每次10mL，合并上层环己烷相，浓缩至约2mL。(5)微乳运行液的制备：0.024g/mL十二烷基硫酸钠SDS，0.066g/mL正丁醇，0.006g/mL正辛烷，20mmol/LpH2.2的磷酸二氢钠缓冲液，超声30min。使用前经0.45μm滤膜过滤，并超声脱气10min。(6)化妆品中多环芳烃含量的测定：优化的实验条件下，化妆品提取液在高效毛细管电泳仪上进样，平行测定3次。(7)样品回收率测定：在相应化妆品中加入一定量相应多环芳烃的标准溶液，充分混匀，与相应样品同时同样处理，所得提取液在高效毛细管电泳仪上进样，同样平行测定3次。2、测定结果(1)多环芳烃分离结果(如附图2所示)(2)多环芳烃测定结果：6种多环芳烃的线性范围、回归方程及相关系数、检出限见表1所示。样品测定结果与加标回收率见表2。表1六种PAHs的回归方程、线性范围和检出限(富集倍数：稀释倍数×LVSS-DypH-sweep的峰面积/正相MEEKC的峰面积)表2样品中六种多环芳烃的测定结果和回收率实验注：N.F指未检出。