一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，包含GP73捕获抗体溶液、生物素标记的AAL、用于形成GP73抗体-抗原-生物素标记AAL复合物并进行ELISA检测的AAL-ELISA检测板和用于形成GP73抗体-抗原-生物素标抗体复合物并进行ELISA检测的Protein-ELISA检测板。本发明所述的方法及试剂盒具有高通量性，较高特异性，检测快速准确等突出优点，对肝癌的诊断具有重要的临床价值。
【专利说明】一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂
1111
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学领域，与应用性基础医学研宄和临床研宄相联系；涵盖肿瘤学、诊断学，糖生物学。
【背景技术】
[0002]肝细胞性肝癌(--是一种多基因、多因素、病理机制复杂的常见恶性肿瘤。在我国，乙肝病毒携带者占人口的7.18 %，是全世界乙肝携带者的2/3，肝病发病率仍居全球之首，全球50%以上的年新增肝癌病例发生在我国。绝大多数患者发病隐匿，出现临床症状后就医时已属晚期，丧失了治疗的良机，因此早期诊断对于提高患者的生存率至关重要。理想的肝癌标志物需要有较高的特异性，能够将肝癌与肝硬化、肝炎、肝脏再生结节等疾病区分开来；同时还需较高的敏感性，能够在肝癌早期即提示诊断，同时应具有易检测、可重复、可经非侵入性操作测定等特点。
[0003]在蛋白质不同的翻译后修饰中，糖基化最为常见，几乎50%的蛋白质都被认为具有糖基化修饰。糖蛋白聚糖存在着宏观和微观的不均一性，其结构功能变化和与疾病发生发展有着密切的联系。聚糖在很多关键的生物学过程中起到重要作用，比如细胞黏附、分子运输和清除、受体激活、信号转导以及内吞作用等。在生物体发育过程中，聚糖结构也在变化，在不同的分化阶段，聚糖有不同的表达。在癌症的发生过程中，糖基化的改变是普遍存在的，如能关注糖基化的变化，可以提升诊断的特异性和敏感性。因此，利用检测糖蛋白聚糖结构的异常来诊断恶性肿瘤已引起相当重视，如八---13的变化已成为检测肝癌的重要聚糖标志等。目前检测糖蛋白聚糖结构变化的技术方法有生物质谱、液相色谱和植物凝集素亲和印迹等，其中植物凝集素是一类存在于多数植物中的糖蛋白，其最大特点是能够识别糖蛋白和糖脂中的聚糖，特别是细胞膜中复杂结构的聚糖即细胞膜表面决定簇，它们与聚糖的结合是非共价且可逆的。…杨树茹凝集素)是一种亲和0连接岩藻糖(161-11111181 3 ？110和土…-匕51)的植物凝集素，岩藻糖修饰能赋予聚糖很多独特的功能特性，其在输血反应、凝集素介导的白细胞和内皮的粘附、宿主和微生物相互作用和个体发育等方面发挥重要作用。此外，岩藻糖还参与构成某些重要粘附分子的聚糖结构，与肿瘤转移关系密切。在癌症中发现81071[冊18 3含量增多，许多肿瘤中4和8型血型抗原丢失伴随着0血型抗原和16*187表达升高。
[0004]高尔基体蛋白73((^73)是一种高尔基体II型膜蛋白，表达于上皮细胞，是一种糖蛋白，包含3个潜在.糖基化位点:八811109，八811144和八811398。随着糖生物学技术的发展，已有研宄证实将⑶73的岩藻糖基化异质体在某些肝癌患者中作为标志物进行检测会优于⑶73。在前期工作中，发现相比于肝硬化患者，肝癌患者血清单位⑶73亲和歐能力显著降低，说明肝癌患者的单位⑶73岩藻糖基化聚糖含量降低。本发明应用对岩藻糖化聚糖的高亲和性，通过…和？1~0仏111-此的制备与检测，分别形成⑶73抗体-抗原-生物素标复合物和⑶73抗体-抗原-生物素标抗体复合物，获得⑶73结合八八I的吸光度与⑶73蛋白的吸光度比值？11(3-⑶73，通过对临床资料进行回顾性研宄，建立肿瘤判别诊断函数，获得80(:曲线和0打值，同时比较八---13和[110-(^73对肝癌诊断的准确率差异。本发明适用于肝癌高发现场或者肝病人群大规模筛查，对于提高肝癌的诊断率，实现早期干预治疗，降低肝癌病死率具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种具有较高准确率的用于诊断肝细胞性肝癌(--的试剂盒。
[0006]为了达到上述目的，本发明提供了一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，包含⑶73捕获抗体溶液、生物素标记的?VI用于形成⑶73抗体-抗原-生物素标记歐复合物并进行此13八检测的…检测板和用于形成⑶73抗体-抗原-生物素标抗体复合物并进行￡[13八检测的？1~0丨6111-211“检测板。
[0007]优选地，所述的八从-此检测板的预处理方法为:在八从-此检测板中加入6？73捕获抗体，—1-211“中即73捕获抗体浓度为1 V 用量为100 V 1?611，室温孵育过夜；采用？831缓冲液洗板；采用含有3 % 8“(质量-体积浓度)的？83溶液进行封闭，用量为200 V 1/^611采用？831缓冲液洗板；采用邱4.0的含有100禮版1104和50禮柠檬酸的溶液进行氧化，用量为200 V 1/^611，41:避光反应111 ；采用？831缓冲液洗板，得到预处理后的…此1“检测板。
[0008]优选地，所述的八检测板的预处理方法为:在？1*01:6111-1^13八检测板中加入即73捕获抗体，^1-0^6111-2118^中即73捕获抗体浓度为2 V 匕用量为100 V 1/%11，室温孵育过夜；采用？831缓冲液洗板；采用含有(质量-体积浓度)和0.05%版為(质量-体积浓度)的？83溶液进行封闭，用量为200 V 1/^611 ；采用？831缓冲液洗板；采用含有1 % 8“(质量-体积浓度)和0.05 %似吧(质量-体积浓度)的？83溶液进行氧化，用量为200 ^17冊11，41:避光反应1卜；采用？831缓冲液洗板，得到预处理后的？1~01:6111-2118^ 检测板。
[0009]优选地，所述的6？73捕获抗体溶液共有两种，浓度分别为1 V 和2 V 。
[0010]优选地，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括生物素标记的⑶73抗体。
[0011]优选地，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包含含有3 % 83八的？88溶液，含有1 % 83八和0.05 %版為的？88溶液，邱4.0的含有100應&10 4和50禮柠檬酸的溶液。
[0012]优选地，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括？881缓冲液。
[0013]优选地，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(册?。
[0014]优选地，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括底物溶液和终止液。
[0015]优选地，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包含采集血样装置及操作说明书。
[0016]本发明中提及的(^73蛋白由前期糖蛋白质组学工作确定单位(^73亲和…^能力显著降低，说明肝癌患者的单位⑶73岩藻糖基化聚糖含量减少。
[0017]本发明主要是建立并优化八从-此和方法，确定最优的捕获抗体浓度、血清样品的上样量、凝集素浓度和检测抗体浓度；并选择合适的…封闭剂和氧化剂。排除⑶73抗体与其它抗原的交叉反应，确立八从-此和？1~0丨6111-此13八对6？73的检测范围和重复性，构建可用于临床血清样品筛查的半定量检测系统。
[0018]如图1所示，本发明通过八从-此13八和的制备，联合并行分析血清中⑶73的岩藻糖和蛋白的表达水平，用于肝癌和肝硬化病人血清中单位⑶73蛋白中结合岩藻糖的含量$110-(^73)的定量检测。并根据？1^4？73的检测数据和临床资料的回顾性研宄，建立肿瘤判别诊断函数可用于原发性肝细胞肝癌的早期诊断。
[0019]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0020]本发明通过八从(杨树茹凝集素)-此和的制备与检测，分别形成抗体-抗原-生物素标复合物和抗体-抗原-生物素标抗体复合物，以6？73结合八八I的吸光度(00值)与即73蛋白的吸光度比值作为衡量单位即73蛋白中结合岩藻糖的含量$11(3-(^73),通过对临床资料进行回顾性研宄，建立肿瘤判别诊断函数，获得受试者工作曲线￠00以及判别⑴此0打)值，该函数对于!1(1:的诊断灵敏度和特异度分别为73.9%和65.4%，^0为0.801，优于甲胎蛋白.聚糖核心岩藻糖(他?-!^)。本发明所述的方法及试剂盒具有高通量性，较高特异性，检测快速准确等突出优点，对肝癌的诊断具有重要的临床价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为高通量[110-(^73检测系统原理示意图；
[0022]图2为线性检测范围图；
[0023]图3为1^-(^73和他?-13检测系统分别构建80(:曲线图；
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0025]实施例
[0026]一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其组成为:
[0027]1、？110~6？73半定量检测此板，所述的1^-(^73半定量检测此板由用于形成即73抗体-抗原-生物素标记复合物并进行此13八检测的…检测板和用于形成6？73抗体-抗原-生物素标抗体复合物并进行此13八检测的？1~0丨6111-此13八检测板组成。
[0028]2、6？73捕获抗体溶液，其浓度分别为1 V 和2 V ^1(由汕脑代公司制备，？88溶液稀释)。
[0029]4、含有 3% 83八的？88 溶液(3% 83八 111 ？83，邱7.2-7.4)。
[0030]5、含有 1 % 83八和 0.05 % 版^3的？83 溶液(1 % 88^,0.05 % 3111 ？83，邱7.2-7.4)。
[0031]6、含有 100禮似104和 50禮柠檬酸的溶液(100^ ^10 50111101^10 ￡^1(1，邱4.0)。
[0032]7、生物素标记的八从溶液，浓度为1 V ^60^01-公司，9^0(111(3^18-1395, ？881缓冲液稀释)。
[0033]8、生物素标记的即73抗体溶液，浓度为2 V ^1(由广州生物医药与健康研宄院提供
[0034]9、册？-81^61)1:8^1(1111 (1116:0110 8016111:1^10, ^1-0(11101:^ 100)0
[0035]10、采集血样装置及操作说明书。
[0036]11、？881 缓冲液(0.05 % 1^66=20111 ？83，邱7.2-7.4)。
[0037]12、底物溶液:3，3 7 ,5,5 ；-四甲基联苯胺(118)溶液，双氧水溶液￠0嫩
0101:6011 1110.^1^0(11101:^1(0331002) 0
[0038]13、终止液；观！！2804
[0039]上述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒的使用方法为:
[0040]( 一板和？1~0忱111-此1 “ 板的预处理:
[0041]1、取两块乩板，分别用作八从-此板和？1~0仏111-211“板；
[0042]2、捕获抗体:在八从-此板和板中分别加入⑶73捕获抗体，
中 6？73 捕获抗体浓度为 1 V 8/此，100 V 1/^611 ；？1~0^6111~2118^ 中 6？73 捕获抗体浓度为2 V 100 V 1/^6110室温孵育过夜。
[0043]3、洗板:采用？83丁缓冲液(0.05% 1^66=20111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡2分钟，300 V 17*611，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
[0044]4、封闭:魈[-此1 “板采用含有 3% 88^ 的？83 溶液(3% 88^ 111 ？83，邱7.2-7.4)进行封闭，室温封闭1卜，用量为200 ^17冊11 ；？1~0仏111-此采用含有1 % 8“和0.05%關3的？88溶液(1% 88^,0.05%關“11 ？83，邱7.2-7.4)进行封闭，室温封闭1卜，用量为
200V1/^6110
[0045]5、洗板:采用？831 缓冲液(0.05% 1^661120111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡2分钟，300 V 17*611，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
[0046]6、氧化:八从-此板采用邱4.0的含有100禮似104和50禮柠檬酸的溶液(1001111 他 104，501111 011:1-10 801(1, 1)? 4.0)进行氧化，用量为 200 V 1/^611，4。〇避光反应111 ；？1~0七6111-此13八采用含有1% 83八和0.05%版^3的？88溶液(1% 88^,0.05%關办？83，邱7.2-7.4)进行氧化，4X:避光反应比，200 V 17冊11。
[0047]7、洗板:采用？881 (0.05% 1^661120111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分钟，300 V 17冊11，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干，分别得到处理后的…^4113八板和？1~01:6111-2113八板，用于下述步骤。
[0048]( 二)1^-(^73半定量检测此检测方法:
[0049]1、采样:通过采集血样装置采集血样，抽取静脉血5“，每份标本均无溶血、月旨血。371:静置一小时，3000印111离心300111后上清即为所需血清，-701:分装冻存(10(^1/1:11)36)。
[0050]2、加样:八从-此板加入血清样品100 V 1/^11 ；？1~0^6111-2118^板加入稀释后血清样品100上1/^611 (采用？83，邱7.2-7.41.4倍稀释至100^1)，室温2匕。
[0051]3、洗板:采用？881 (0.05% 1^661120111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分钟，300 V 17*611，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
[0052]4、检测试剂规-乩13八板中加入1 V邑/此生物素标记的撒(^881稀释)；^1-0^6111-2118^板中加入生物素标记的抗体2 V ^/1111(^88稀释)，100 V 17冊11，室温2匕。
[0053]5、洗板:采用？881 (0.05% 1^66=20111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分钟，300 V 17*611，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
[0054]6、酶结合物工作液:八从-2113八板中加入册?(米用3 % 83八111？88^ ^7.2-7.4,1: 12500 稀释)；？1~0忱111-此1“ 板中加入册？-8钍6的(采用 1 %83八 111 ？88^ ^7.2-7.4,1: 12500 ^^),100 1^/^611,^^301111110
[0055]7、洗板:采用？881 (0.05% 1^66=20111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分钟，300 V 17*611，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
[0056]8、加底物溶液，所述的底物溶液由3，37，5，57 -四甲基联苯胺(118)溶液和的双氧水溶液按照体积比为1: 2混合而成，100 V 17^611，室温20111111。
[0057]9、加终止液:100 V 18^0？ 3011^1011/^611，终止液的加入顺序与底物溶液的加入顺序相同。
[0058]10、检测:立即用版11100皿社1200 (邛“⑷酶标仪在450咖波长测量各孔的00值。应提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
[0059](三)？110~6？73半定量检测此分析方法:
[0060]1、数据:每个血清样品的00值应减去空白孔的00值为实际00值。每个血清样品即73结合八从的实际00值与此相同血清样品即73蛋白的实际00值(^1-0^6111-2118^)比值即为值。
[0061]采用软件回归分析建立的上述预测模型进行检测区分肝癌和肝硬化的0打值为3.9433。按照上述预测模型计算？值，将？值与0打值比较，? 3.9433为肝硬化，? 3.9433为肝癌。
[0062]采用实施例中的试剂盒和检测方法，分析49例肝病血清样品(肝硬化26例和肝癌患者23例，均经临床确诊)中即73的岩藻糖和蛋白的表达水平，计算得到含量。同时使用他?-13检测试剂盒(他?-13检测试剂盒购自汕110妨公司(01^110^1^1187)和其操作说明中的检测方法，检测上述49例肝病血清样品中八---13含量，采用软件获得80(:曲线。比较本发明试剂盒和八---13对肝癌诊断的灵敏性和特异性，结果如图3所示，本发明试剂盒的灵敏度为73.9%，特异度65.4%，如?0为0.801，而他?-13对的诊断灵敏度为69.6 %，特异度为69.2 %，皿为0.701。因此，本发明具有较高敏感性，对肝癌的预测具有重要临床价值。
[0063]采用1*6(30111131的111: 6？73标准品进行倍比稀释，确定？1~01:6111-2113八线性检测范围。结果如图2所示，？1~01:6111-2118^的定量线性检测范围为0?500000呢加1。
【权利要求】
1.一种用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，包含GP73捕获抗体溶液、生物素标记的AAL、用于形成GP73抗体-抗原-生物素标记AAL复合物并进行ELISA检测的AAL-ELISA检测板和用于形成GP73抗体-抗原-生物素标抗体复合物并进行ELISA检测的Protein-ELISA检测板。
2.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的AAL-ELISA检测板的预处理方法为:在AAL-ELISA检测板中加入GP73捕获抗体，AAL-ELISA中GP73捕获抗体浓度为lyg/mL，用量为100 μ L/well，室温孵育过夜；采用PBST缓冲液洗板；采用含有3% BSA的PBS溶液进行封闭，用量为200 μ L/well ;采用PBST缓冲液洗板；采用pH 4.0的含有10mM似104和50mM柠檬酸的溶液进行氧化，用量为200 μ L/well，4°C避光反应Ih ;采用PBST缓冲液洗板，得到预处理后的AAL-ELISA检测板。
3.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的Protein-ELISA检测板的预处理方法为:在Protein-ELISA检测板中加入GP73捕获抗体，Protein-ELISA中GP73捕获抗体浓度为2 μ g/mL，用量为100 μ L/well，室温孵育过夜；采用PBST缓冲液洗板；采用含有1% BSA和0.05%似乂的PBS溶液进行封闭，用量为200 μ L/well ;采用PBST缓冲液洗板；采用含有I % BSA和0.05%似乂的PBS溶液进行氧化，用量为200 μ L/well，4°C避光反应Ih ;采用PBST缓冲液洗板，得到预处理后的Protein-ELISA 检测板。
4.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的GP73捕获抗体溶液共有两种，浓度分别为I μ g/mL和2 μ g/mL。
5.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括生物素标记的GP73抗体。
6.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包含含有3% BSA的PBS溶液，含有I % BSA和0.05 % NaN3的PBS溶液，pH 4.0的含有10mMNa1 4和50mM柠檬酸的溶液。
7.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括PBST缓冲液。
8.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。
9.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包括底物溶液和终止液。
10.如权利要求1所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清学预测的高尔基体蛋白73异质体试剂盒还包含采集血样装置及操作说明书。
【文档编号】G01N21/31GK104483484SQ201410816433
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】张舒, 郭坤, 刘银坤 申请人:复旦大学附属中山医院