无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器的制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器的制备方法，属于新型纳米功能材料和生物传感器领域。本发明首先在二氧化钛纳米颗粒基底上，利用光电化学合成方法，制备核壳结构的枝晶纳米棒状的贵金属合金纳米材料，进而制得了成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速、制备简单的检测瘦肉精的无标记电致化学发光免疫传感器。
【专利说明】无标巧电致化学发光瘦肉精免疫传感器的制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及采用一种快速、灵敏检测瘦肉精的无标记电致化学发光免疫传感器的 制备方法和应用，属于新型纳米功能材料与生物传感器【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 瘦肉精是一类叫做0 -兴奋剂的药物，而不是某一种特定的药物。该类药物具有 实现促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的功能，所W统称为"瘦肉精"。根据国务院食品安全委员 会办公室r瘦肉精"专项整治方案》（食安办〔2011) 14号）规定的"瘦肉精"品种目录为16 种，包括：莱克多己胺Ractopamine ;克伦特罗Clenbuterol ;沙了胺醇Sa化utamol ;硫酸沙 了胺醇 Sa化utamol Sulfate ;盐酸多己胺 Dopamine Hy化ochloride ;西马特罗 Cimaterol ; 硫酸特布他林Terbutaline Sulfate ;苯己醇胺APhenylethanolamine A ;班布特罗 Bambuterol ;盐酸齐帕特罗 Zilpaterol Hy化ochloride ;盐酸氯丙那林 Clo巧renaline Hy化ochloride ;马布特罗Mabuterol ;西布特罗Cimbuterol ;漠布特罗化ombuterol ;酒石 酸阿福特罗 Arformoterol Tartrate ;富马酸福莫特罗 F'ormoterol Fumatrate。
[0003] 瘦肉精可W提高猪的瘦肉率，但如果人们食用含有大量瘦肉精的猪肉后，会造成 屯、血管系统的损坏，并可能出现严重的神经症状。针对瘦肉精中毒事件频发该一严重现象， 2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，农业部分别下发文件禁止食品动物禁止使 用0 -兴奋剂类药物作为饲料添加剂(农业部176号、193号公告、1519号条例）。
[0004] 目前，检测瘦肉精的方法有高效液相色谱法HPLC、气相色谱一质谱法GC-MS和酶 联免疫法化ISA。该些方法，虽具有一定的灵敏度，但存在样品处理时间长，检测过程烦琐、 难于操作，或者重现性差等缺点，在实际应用中受到一定的限制。
[0005] 电化学发光免疫传感器由于其灵敏度高、特异性好、操作简便等优点被广泛应用 于临床诊断、药物分析、环境监测等领域。制备性能优越的电化学发光免疫传感器，其最关 键技术就是发光强度及稳定性和免疫分子的有效固定及重现性等性能的提高。
[0006] 鲁米诺-过氧化氨Luminol-H2〇2发光体系由于成本低廉、发光强度高，已被广泛 应用到电致化学发光的分析方法中，但由于Luminol-H2〇2发光体系的发光需要借助一定的 催化剂，才能有快速、灵敏、高强度的光信号响应，因此一般常加入辣根过氧化物酶HRP来 进行催化反应。而HRP的使用对反应条件要求苛刻，不利于Luminol-H2〇2发光体系的普及 使用。因此开发新型纳米材料模拟酶来代替HRP，会相比于HRP具有较宽泛的使用条件。另 夕F，贵金属纳米材料具有比表面积大、易于与多种生物分子(核酸、蛋白质和生物分子等）结 合、对人体无害等特点，可被应用于电致化学发光免疫传感器的制备中。
[0007] 为了解决上述问题，本发明采用W光化学合成方法，直接在电极上实现了 Ti化 NPs负载的核壳结构的金银钮合金纳米椿-壳聚糖复合材料Ti化-Au@Ag-Pd NDRs-C服，使 之与Ti化NPs的复合材料共同修饰的电极，一方面增加了电极比表面积，增强电极导电能 力和抗体的负载量，提高传感器的检测限，另一方面二者可W产生协同催化作用，可W无需 使用&化，仅利用水溶液中的溶解氧即可使鲁米诺产生电致化学发光，并且该体系具有更好 的催化响应速度和电致化学发光强度。由此，成功的发明了无标记电致化学发光瘦肉精免 疫传感器的制备方法。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于避免现有检测方法中存在的仪器设备复杂、操作过程繁琐及对 检验人员的技能要求高等缺点，提供了一种快速、灵敏检测瘦肉精的无标记电致化学发光 免疫传感器的制备方法，所制备的传感器具有灵敏度高、特异性强的特点，且制备简单、操 作方便，可应用于瘦肉精的快速、灵敏检测。
[0009] 本发明采用的技术方案如下； 1.无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤为： (OW直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂5?10 uL二氧化铁纳米 粒子溶胶Ti〇2 NPs，室温下惊干后，滴涂5?10化的金银纳米椿-壳聚糖复合材料Au@Ag NRs-C服溶液，并在室温下惊干； (2) 将步骤（1)中得到的电极超纯水清洗，室温下惊干成膜，表面滴涂5?lOuL 0.01 mol/L的氯钮酸溶液H2PCICI4,立刻使用高压隶灯照射30?90秒，制得Ti〇2 NPs负载的金银 钮合金纳米椿-壳聚糖复合材料Ti〇2-Au@Ag-Pd NDRs-C服修饰的工作电极，室温下惊干； (3) 将步骤（2)中得到的电极用超纯水清洗，室温下惊干后，将电极浸入到邸C/N服溶 液中，1小时后取出； (4) 将步骤（3)中得到的电极用超纯水清洗，在电极表面滴涂5?10化10嗦/mL的瘦 肉精抗体溶液，4 °C冰箱中保存惊干； (5) 将步骤（4)中得到的电极用超纯水清洗，继续在电极表面滴涂5?10化100嗦/mL 的牛血清白蛋白BSA溶液，4 °C冰箱中保存惊干，超纯水清洗，4 °C冰箱中惊干成膜，审U 得无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器； 所述的Ti化NPs为Img/mL的二氧化铁纳米粒子水溶液； 所述的Au@Ag NRs-C服为金@银核壳纳米椿与壳聚糖复合材料的水溶液，所述金@银核 壳纳米椿是W椿状金纳米粒子为核、W银纳米粒子为壳层的核壳结构的椿状纳米粒子，所 述椿状纳米粒子的长度为20?50nm，所述壳聚糖为将壳聚糖纯品加入到体积分数为1%的 醋酸中制备而成的壳聚糖水溶液； 所述的^PdCL为抑值为1?2的氯钮酸水溶液； 所述的Au@Ag-Pd NDRs为金银钮合金纳米椿，所述的金银钮合金纳米椿为金@银钮核 壳枝晶状的纳米椿，所述金@银钮核壳枝晶状的纳米椿是W椿状金纳米粒子为核、W枝晶 状银钮合金纳米粒子为壳层的核壳结构的纳米粒子，所述纳米椿的长度为20?50nm ; 所述的邸C/N服为1- (3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺盐酸盐邸C和N-哲基了二 酷亚胺N服的混合溶液，所述混合溶液中邸C的浓度为0. Olmol/L，N服的浓度为0. 002mol/ L。
[0010] 2. -种如本发明所述的制备方法所制备的无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感 器，所述的无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器应用于瘦肉精的检测，其特征在于，检测 步骤为： (1)标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的瘦肉精标准溶液，底液为 pH 7. 4的磯酸盐缓冲溶液； (2) 工作电极修饰：将本发明所述的无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器为工作电 极，将步骤（1)中配制的不同浓度的瘦肉精标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 °C冰箱 中保存； (3) 工作曲线绘制：将饱和甘隶电极作为参比电极，销丝电极作为辅助电极，与步骤 (2)所修饰好的工作电极组成=电极系统，连接到电致化学发光设备上；在电解槽中先后加 入15血抑=7. 4的PBS缓冲溶液和1血5 mmol/L的鲁米诺溶液luminol ;用循环伏安法对 组装的工作电极施加循环电压；根据所得的电致化学发光的光信号强度与瘦肉精抗原标准 溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；空白标样的光信号强度记为4,含有不同浓度的瘦肉 精标准溶液的光信号强度记为A，响应光信号强度降低的差值为= 4-q，瘦肉精 标准溶液的质量浓度Ct间成线性关系，绘制A C-幻C作曲线； (4) 瘦肉精的检测；用待测样品代替步骤（1)中的瘦肉精标准溶液，按照步骤（2)和（3) 中的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值A巧日工作曲线，得到待测样品中瘦 肉精的含量。
[0011] 3.本发明所述的无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器的制备方法和应用，其特 征在于所述瘦肉精选自下列之一；莱克多己胺、克伦特罗、沙了胺醇、硫酸沙了胺醇、盐酸多 己胺、西马特罗、硫酸特布他林、苯己醇胺A、班布特罗、盐酸齐帕特罗、盐酸氯丙那林、马布 特罗、西布特罗、漠布特罗、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗。
[001引本发明的有益成果 (1) 本发明所述的无标记电致化学发光免疫传感器制备简单，操作方便，并通过纳米 材料的增效和增敏作用，可实现对实际样品的快速、灵敏、高选择性检测，具有市场发展前 景； (2) 本发明首次将光化学合成方法制备Ti02-Au@Ag-Pd NDRs-C服复合材料，并应用于 电致化学发光免疫传感器的制备，所制备的传感器无需使用&02便可实现对luminol电致 化学发光的增敏、增效，极大地提高了检测灵敏度和重现性，获得了较低的检出限，具有重 要的科学意义。
【具体实施方式】
[0013] 实施例1无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器的制备 (OW直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂5 uL Ti化NPs，室温下惊干 后，滴涂5化的Au@Ag NRs-C服溶液，并在室温下惊干； (2) 将步骤（1)中得到的电极超纯水清洗，室温下惊干成膜，表面滴涂加L 0.01 mol/L 的HsPclCl"立刻使用高压隶灯照射30秒，制得Ti化-Au@Ag-Pd NDRs-C服修饰的工作电极， 室温下惊干； (3) 将步骤（2)中得到的电极用超纯水清洗，室温下惊干后，将电极浸入到邸C/N服溶 液中，1小时后取出； (4) 将步骤（3)中得到的电极用超纯水清洗，在电极表面滴涂5化10嗦/mL的瘦肉精 抗体溶液，4 °C冰箱中保存惊干； (5) 将步骤（4)中得到的电极用超纯水清洗，继续在电极表面滴涂5化100嗦/mL的 BSA溶液，4 °C冰箱中保存惊干，超纯水清洗，4 °C冰箱中惊干成膜，制得无标记电致化学 发光瘦肉精免疫传感器； 所述的Ti化NPs为Img/mL的二氧化铁纳米粒子水溶液； 所述的Au@Ag NRs-C服为金@银核壳纳米椿与壳聚糖复合材料的水溶液，所述金@银 核壳纳米椿是W椿状金纳米粒子为核、W银纳米粒子为壳层的核壳结构的椿状纳米粒子， 所述椿状纳米粒子的长度为20nm，所述壳聚糖为将壳聚糖纯品加入到体积分数为1%的醋 酸中制备而成的壳聚糖水溶液； 所述的H2PCICI4为抑值为1的氯钮酸水溶液； 所述的Au@Ag-Pd NDRs为金银钮合金纳米椿，所述的金银钮合金纳米椿为金@银钮核 壳枝晶状的纳米椿，所述金@银钮核壳枝晶状的纳米椿是W椿状金纳米粒子为核、W枝晶 状银钮合金纳米粒子为壳层的核壳结构的纳米粒子，所述纳米椿的长度为20nm ; 所述的邸C/N服为1- (3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺盐酸盐邸C和N-哲基了二 酷亚胺N服的混合溶液，所述混合溶液中邸C的浓度为0. Olmol/L，N服的浓度为0. 002mol/ L。
[0014] 实施例2无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器的制备 (OW直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂8 uL Ti化NPs，室温下惊干 后，滴涂8化的Au@Ag NRs-C服溶液，并在室温下惊干； (2) 将步骤（1)中得到的电极超纯水清洗，室温下惊干成膜，表面滴涂8uL 0.01 mol/L 的H2PCICI4,立刻使用高压隶灯照射60秒，制得Ti化-Au@Ag-Pd NDRs-C服修饰的工作电极， 室温下惊干； (3) 同实施例1 ; (4) 将步骤（3)中得到的电极用超纯水清洗，在电极表面滴涂8化10嗦/mL的瘦肉精 抗体溶液，4 °C冰箱中保存惊干； (5) 将步骤（4)中得到的电极用超纯水清洗，继续在电极表面滴涂8化100嗦/血的 BSA溶液，4 °C冰箱中保存惊干，超纯水清洗，4 °C冰箱中惊干成膜，制得无标记电致化学 发光瘦肉精免疫传感器； 所述的Au@Ag NRs-C服中金纳米椿的长度为40皿； 所述的畔(1化的抑值为1.5 ; 所述的Au@Ag-Pd NDRs的长度为40nm ; 其余同实施例1。
[0015] 实施例3无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器的制备 (OW直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂10 uL Ti化NPs，室温下惊 干后，滴涂10化的Au@Ag NRs-C服溶液，并在室温下惊干； (2) 将步骤（1)中得到的电极超纯水清洗，室温下惊干成膜，表面滴涂lOuL 0.01 mol/L 的H2PCICI4,立刻使用高压隶灯照射90秒，制得Ti化-Au@Ag-Pd NDRs-C服修饰的工作电极， 室温下惊干； (3) 同实施例1 ; (4) 将步骤（3)中得到的电极用超纯水清洗，在电极表面滴涂10化10嗦/mL的瘦肉 精抗体溶液，4 °C冰箱中保存惊干； (5)将步骤（4)中得到的电极用超纯水清洗，继续在电极表面滴涂10化100嗦/mL的 BSA溶液，4 °C冰箱中保存惊干，超纯水清洗，4 °C冰箱中惊干成膜，制得无标记电致化学 发光瘦肉精免疫传感器； 所述的Au@Ag NRs-C服中金纳米椿的长度为50皿； 所述的H2PCICI4的抑值为2 ; 所述的Au@Ag-Pd NDRs的长度为50nm ; 其余同实施例1。
[0016] 实施例4上述实施例1 - 3所制备的无标记电致化学发光免疫传感器，应用于瘦 肉精的检测，步骤如下： (1) 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的瘦肉精标准溶液，底液为 pH 7. 4的磯酸盐缓冲溶液； (2) 工作电极修饰：将本发明所述的无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器为工作电 极，将步骤（1)中配制的不同浓度的瘦肉精标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 °C冰箱 中保存； (3) 工作曲线绘制：将饱和甘隶电极作为参比电极，销丝电极作为辅助电极，与步骤 (2)所修饰好的工作电极组成=电极系统，连接到电致化学发光设备上；在电解槽中先后加 入15血抑=7. 4的PBS缓冲溶液和1血5 mmol/L的鲁米诺溶液luminol ;用循环伏安法对 组装的工作电极施加循环电压；根据所得的电致化学发光的光信号强度与瘦肉精抗原标准 溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；空白标样的光信号强度记为4,含有不同浓度的瘦肉 精标准溶液的光信号强度记为A，响应光信号强度降低的差值为= 4-q，瘦肉精 标准溶液的质量浓度Ct间成线性关系，绘制A C-幻C作曲线； (4) 瘦肉精的检测；用待测样品代替步骤（1)中的瘦肉精标准溶液，按照步骤（2)和（3) 中的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值A巧日工作曲线，得到待测样品中瘦 肉精的含量； 所述瘦肉精选自下列之一；莱克多己胺、克伦特罗、沙了胺醇、硫酸沙了胺醇、盐酸多己 胺、西马特罗、硫酸特布他林、苯己醇胺A、班布特罗、盐酸齐帕特罗、盐酸氯丙那林、马布特 罗、西布特罗、漠布特罗、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗。
[0017] 本发明所制备的免疫传感器检测16种瘦肉精的技术指标见表1。
[001引表1本发明所制备的免疫传感器检测16种瘦肉精的技术指标
【权利要求】
1. 无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤为： (1) 以直径4 mm的玻碳电极为工作电极，在电极表面滴涂5~10 uL二氧化钛纳米 粒子溶胶Ti02 NPs，室温下晾干后，滴涂5~10 ML的金银纳米棒-壳聚糖复合材料Au@Ag NRs-CHS溶液，并在室温下晾干； (2) 将步骤（1)中得到的电极超纯水清洗，室温下晾干成膜，表面滴涂5~10uL 0.01 mol/L的氯钯酸溶液H2PdCl4，立刻使用高压汞灯照射30~90秒，制得Ti0 2 NPs负载的金银 钯合金纳米棒-壳聚糖复合材料Ti02-Au@Ag-Pd NDRs-CHS修饰的工作电极，室温下晾干； (3) 将步骤（2)中得到的电极用超纯水清洗，室温下晾干后，将电极浸入到EDC/NHS溶 液中，1小时后取出； (4) 将步骤（3)中得到的电极用超纯水清洗，在电极表面滴涂5~10 ML 10 Pg/mL的瘦 肉精抗体溶液，4 °C冰箱中保存晾干； (5) 将步骤（4)中得到的电极用超纯水清洗，继续在电极表面滴涂5~10ML 100 Pg/mL 的牛血清白蛋白BSA溶液，4 °C冰箱中保存晾干，超纯水清洗，4 °C冰箱中晾干成膜，制 得无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器； 所述的Ti02 NPs为lmg/mL的二氧化钛纳米粒子水溶液； 所述的Au@Ag NRs-CHS为金@银核壳纳米棒与壳聚糖复合材料的水溶液，所述金@银核 壳纳米棒是以棒状金纳米粒子为核、以银纳米粒子为壳层的核壳结构的棒状纳米粒子，所 述棒状纳米粒子的长度为20~50nm，所述壳聚糖为将壳聚糖纯品加入到体积分数为1%的 醋酸中制备而成的壳聚糖水溶液； 所述的H2PdCl4S pH值为1~2的氯钯酸水溶液； 所述的Au@Ag-Pd NDRs为金银钮合金纳米棒，所述的金银钮合金纳米棒为金0银I巴核 壳枝晶状的纳米棒，所述金@银钯核壳枝晶状的纳米棒是以棒状金纳米粒子为核、以枝晶 状银钮合金纳米粒子为壳层的核壳结构的纳米粒子，所述纳米棒的长度为20~50nm ; 所述的EDC/NHS为1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基丁二 酰亚胺NHS的混合溶液，所述混合溶液中EDC的浓度为0? Olmol/L，NHS的浓度为0? 002mol/ L〇
2. -种如权利要求1所述的制备方法所制备的无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感 器，所述的无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器应用于瘦肉精的检测，其特征在于，检测 步骤为： (1) 标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的瘦肉精标准溶液，底液为 pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液； (2) 工作电极修饰：将本发明所述的无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器为工作电 极，将步骤（1)中配制的不同浓度的瘦肉精标准溶液分别滴涂到工作电极表面，4 °C冰箱 中保存； (3) 工作曲线绘制：将饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为辅助电极，与步骤 (2 )所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接到电致化学发光设备上；在电解槽中先后加 入15mL pH=7. 4的PBS缓冲溶液和lmL 5 mmol/L的鲁米诺溶液luminol ;用循环伏安法对 组装的工作电极施加循环电压；根据所得的电致化学发光的光信号强度与瘦肉精抗原标准 溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；空白标样的光信号强度记为4,含有不同浓度的瘦肉 精标准溶液的光信号强度记为A，响应光信号强度降低的差值为A j =斗-A，A i?与瘦肉精 标准溶液的质量浓度Ct间成线性关系，绘制A i? - CX作曲线； (4)瘦肉精的检测：用待测样品代替步骤（1)中的瘦肉精标准溶液，按照步骤（2)和（3) 中的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值△腐P工作曲线，得到待测样品中瘦 肉精的含量。
3.如权利要求1所述的无标记电致化学发光瘦肉精免疫传感器的制备方法，其特征 在于所述瘦肉精选自下列之一：莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、盐酸多巴 胺、西马特罗、硫酸特布他林、苯乙醇胺A、班布特罗、盐酸齐帕特罗、盐酸氯丙那林、马布特 罗、西布特罗、溴布特罗、酒石酸阿福特罗、富马酸福莫特罗。
【文档编号】G01N21/76GK104502429SQ201510034905
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月25日 优先权日:2015年1月25日
【发明者】张勇, 马洪敏, 魏琴, 李燕, 吴丹, 庞雪辉 申请人:济南大学