技术领域本发明涉及一种灰霾天急性生物毒性检测技术，具体为一种灰霾天急性生物毒性检测样品制备及其检测方法，属于大气污染物毒性检测技术领域。
背景技术：
在冬春季节，由于地面逆温，很容易形成雾天，如果空气中存在颗粒物，天空会变成灰蒙蒙的一片，这种天气就是灰霾天。灰霾天是颗粒物污染导致的，天气中的颗粒物污染对于人类的身体特别是呼吸系统健康，会产生严重的影响。空气中直径小于或等于2.5微米的固体颗粒或液滴等细颗粒物更容易对呼吸系统和心血管系统造成伤害，包括呼吸道受刺激、咳嗽、呼吸困难、降低肺功能、加重哮喘，导致慢性支气管炎、心律失常、非致命性的心脏病、心肺病患者的过早死等。灰霾天中污染物的来源和成分复杂，其中主要成分有元素碳、有机碳化合物、硫酸盐、硝酸盐、铵盐。其它常见的成分包括各种金属元素，既有钠、镁、钙、铝、铁等地壳中含量丰富的元素，也有铅、锌、砷、镉、铜等主要源自人类污染的重金属元素。如北京PM2.5的成分中，含碳的颗粒物及硫酸根、硝酸根、铵根等共占了总重量的69％；上海的PM2.5中有41.6％是硫酸铵、硝酸铵，以及41.4％含碳的物质。因此，灰霾天的污染物是复合污染物。那么，这些复合污染物对生物体的急性毒性效应如何呢？发光细菌是自然界中存在的一类能自身发射蓝绿可见光的细菌。其发光强度在正常条件下很稳定。一旦遭遇毒物，影响其正常生理代谢，其发光强度就会变化，通常表现为发光受抑制，且抑制的程度与所遭遇的毒物的毒性大小及浓度呈正相关。发光细菌法自上个世纪中期就用于环境检测，我国于1995年发布了利用发光细菌检测水质急性生物毒性的国家标准(GB/T15441-1995)。作为一种生物毒性检测方法，发光细菌法和采用小鼠、鱼类等毒性试验结果有良好的一致性，且更加灵敏、快速和低成本。目前，发光细菌毒性检测法已被广泛用于水质和液体的污染及生物毒性测试判断，以其简便易行、检测成本低廉等优点而受到关注。但是，尚未有用于测试灰霾天空气中复合污染物急性生物毒性的方法。
技术实现要素：
本发明的目的是为灰霾天的急性生物毒性的测试提供一种快速有效的方法。主要是利用淡水发光细菌——青海弧菌VibrioqinghaiensisQ67培养基制成新鲜菌液或采用青海弧菌冻干粉制成测试用菌液，来测试灰霾天的急性生物毒性。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。具体步骤如下：(1)收集灰霾天的空气样品：通过空气泵将空气样品抽吸并溶解到无菌水中，加入NaCl至终质量浓度为0.8％作为样品液；采用蒸馏水作为空白，加入NaCl至终质量浓度为0.8％作为对照样品液；(2)采用发光细菌青海弧菌Q67菌株(VibrioqinghaiensisQ67)制备发光细菌菌液；(3)在发光测定仪上测试溶解到无菌水中的大气样品的发光强度，通过与空白组对照计算其相对发光强度，相对发光强度的计算采用如下公式：(4)将发光率的数据与标准有毒物质测定得到的发光率进行比较，得出样品的相对急性生物毒性。步骤(2)所述发光细菌菌液可以采用新鲜培养的发光细菌，也可是市场上购置的发光细菌冻干粉，通过复苏后制备，发光强度在200-500万光子/秒；本发明中采用我国特有的淡水发光细菌—青海弧菌Q67菌株，其是对被测样品中所有毒物的综合毒性的反映，只要对生物体有毒，就会对发光细菌发生影响，而灵敏地从发光细菌的发光强弱上反映出来。发光检测仪采用现代光子检测技术，非常灵敏，极微弱的光强度发生也可检测出来。这对于灰霾天空气中的复合污染物的综合毒性检测非常适用。本发明同现有技术相比，采用我国独有的淡水发光细菌青海弧菌Q67菌株，对灰霾天空气污染的急性生物毒性检测具有灵敏高，检测速度快的特点，可在0.5小时内可以得出结果，判断空气污染的生物急性毒性大小。附图说明图1：不同采样时间细菌相对发光率变化。图2：相对发光率和PM2.5关系分析。图3：不同口罩类型对细菌发光的影响。具体实施方式一、灰霾天空气样品的采集灰霾天空气样品的采集采用大气取样器，抽吸到无菌水中，抽吸时间根据灰霾天的严重程度控制在30分钟-60分钟。样品采集后放置4度冰箱保存。二、测试用菌液准备1、新鲜菌液的准备：新鲜发光细菌青海弧菌Q67培养基成分如下：MgSO42.47g、MgCO30.79g、MgBr20.09g、MgCl20.109g、CaCO30.103g、KCl0.122g、NaCl8.29g、Mg(HCO3)20.50g、酵母膏5g、胰胨5g、甘油3g、琼脂20g，溶于1000mL蒸馏水中，将它制成斜面，于121℃灭菌20min，贮于4℃冰箱备用。用上述青海弧菌Q67菌株的斜面菌种，移接到新鲜斜面上，15－25℃培养12h-18h，此时细菌发光明亮，用10ml0.85％NaCl溶液，将菌苔从斜面上轻柔冲刷下来，摇匀，用少量生理盐水调整菌液浓度，使菌液浓度OD660≈0.3左右，取0.1ml菌液，加入置有2ml生理盐水的样品测试管中，用测光仪检测发光，发光强度在200-500万光子/秒时，这种新鲜菌液就可作为测试用的菌液。2、冻干粉剂菌液的准备：发光菌冻干粉剂，采用由上述菌种制作成的冻干粉剂，这种冻干粉剂的专利号：97106203.X，可以由市场购买，保存于-20℃冰箱之中，使用前打开，用适量复苏液使之溶解。复苏液配制参考华东师范大学学报(自然科学版，2008，4，58-65发表的《青海湖发光细菌的分离鉴定及电镜观察》文章。在青海弧菌Q67菌株冻干粉剂中加入5ml复苏液，充分混合，室温下下放置10分钟左右，使细菌恢复发光，得到冻干粉剂菌液，也可作为测试用菌液。所述的复苏液是摩尔浓度为0.05-0.2M，pH值为6.0-9.0的磷酸缓冲液，或质量-体积百分比浓度为0.5-8.0％的葡萄糖液。三、样品的检测步骤本发明中采用的发光细菌为青海弧菌Q67菌株VibrioqinghaiensisQ67。发光检测用仪器，采用北京滨松光子技术有限公司出品的BHP95114型发光检测仪。1)取溶解有空气污染物样品的水样，加入NaCl至终浓度为0.8％作为被试样品；采用蒸馏水作为空白，加入NaCl至终浓度为0.8％作为对照样品液；2)对样品的发光检测：取六个测试小杯，其中三个测试小杯分别加入2ml空气水样品液作为一组样品平行样，另三个测试小杯分别放入2ml对照样品液也作为一组对照平行样；在每组平行样中的三个测试小杯中每隔15s依次加入0.1ml新鲜菌液或0.05ml冻干粉剂菌液，分别放置15min后，这样每组平行样之间隔15s就采用发光检测仪测定各测试小杯内样品的发光强度，然后计算相对发光强度。实施例1：上海郊区某冬季空气生物急性毒性检测一、取样(1)取上海某冬季灰霾天空气样品，分别抽吸不同的时间，3060和120分钟，每个时间段平行取三个样，溶解进无菌水中。(2)对照水样品液：用蒸馏水，加入NaCl至终浓度为0.8％。二、发光检测采用北京滨松光子技术有限公司出品的BHP95114型水质毒性分析仪为测试用仪器。使用冻干粉菌液的复苏液。准备好三个测试小杯，每个小杯各加2ml水样，设为三个平行样；对照样品液也取三个测试小杯，各加入2ml，同样设置三个平行样，依次加入冻干粉复苏菌液0.05ml作为测试用菌液，每个测试小杯加菌液的时间间隔为15s，放置15min后，用发光检测仪依次相隔15s测定各测量杯的发光强度，计算相对发光强度。三、发光检测数据的计算结果：从图1中可见，当采样时间为30分钟时，细菌的相对发光率为75％；采样时间为60分钟时，为71％，相对稳定(P>0.05)；采样时间延长至2小时，降低到66％，相对发光率明显降低，差异显著(P<0.05)，表明毒性增大。实施例2：上海市区冬春季节大气样品生物急性毒性检测一、取样(1)取市区某冬春季节3月25日和4月10日的空气样品，溶解进无菌水中，加入NaCl至终浓度为0.8％，作为被试样品。(2)空白水样对照，用蒸馏水加入NaCl至终浓度为0.8％制备。二、发光检测采用北京滨松光子技术有限公司出品的BHP95114型水质毒性分析仪为测试用仪器。使用冻干粉菌液的复苏液。准备好三个测试小杯，每个小杯各加2ml蒸馏水样品，设为三个平行样，空白水样对照也取三个测试小杯，各加入2ml，同样设置三个平行样，每个测试小杯间隔15s依次加入冻干粉剂复苏菌液0.05ml，作为测试用菌液，每个测试小杯放置15min后，用发光检测仪依次相隔15s测定各测试小杯的发光强度，计算相对发光强度。取上海环保局网站的对应每日PM2.5数据进行作图分析。三、发光检测数据的计算将实验采集样品的细菌相对发光率和空气指标进行对比，从图2中可见，在采样分析期间空气中的PM2.5在54-90ug/m3范围波动，相对发光率在48-89％之间变化。在PM2.5较高的两天，3月28日和4月3日，细菌的发光率处于较低的水平，而在PM2.5浓度较低的4月4日和6日，相对发光率较高，经过统计计算细菌的发光率和PM2.5浓度相关性为-0.67，说明生物发光毒性测试结果和PM2.5的浓度呈现正相关。实施例3：上海市区某路口大气样品生物急性毒性检测一、取样(1)取上海市区交通繁忙路口采样，采集路口20分钟戴不同类型口罩，以及汽车尾气2分钟的空气样品，溶解进无菌水中，加入NaCl至终浓度为0.8％，作为被试样品。(2)空白水样对照，用蒸馏水加入NaCl至终浓度为0.8％制成。二、发光检测采用北京滨松光子技术有限公司出品的BHP95114型水质毒性分析仪为测试用仪器。使用冻干粉菌液的复苏液。准备好三个测试小杯，每个小杯各加2ml蒸馏水样品，设为三个平行样，空白水样对照也取三个测试小杯，各加入2ml，同样设置三个平行样，每个测试小杯间隔15s依次加入冻干粉剂复苏菌液0.05ml，作为测试用菌液，每个测试小杯放置15min后，用发光检测仪依次相隔15s测定各测试小杯的发光强度，计算相对发光强度。三、发光检测数据的计算结果在雾霾天交通繁忙路口进行20分钟采样，仪器戴口罩与否及戴不同类型口罩得到的样品对发光细菌的影响见图3。可见，相比较不带口罩的空白，一次性口罩对于细菌发光率的影响和空白几乎相同，发光率为50％，而带棉布口罩的发光率为70％，发光率明显高于空白和一次性口罩组，而小汽车尾气2分钟的样品发光率和空白组差不多，说明棉布口罩的防护效果要远好于一次性口罩。同时，汽车尾气的生物毒性效应明显，该结果显示在空气环境恶劣的交通繁忙路口停留20分钟，其生物综合毒性效应等同于直接吸收2分钟机动车的尾气。