基于光谱法同时快速定性分析血清中两种转氨酶的活性的制作方法

本发明涉及一种血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)活性的快速无损分析方法，具体涉及采用光谱法结合化学计量学技术，同时定性分析血清中ALT和AST活性，属于生化检测领域。

背景技术：

转氨酶(aminotransferase)是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶，参与氨基酸的合成与分解。其中，丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)是重要的诊断标志物。ALT主要存在于肝细胞内，其胞内浓度显著高于血清中的浓度。当肝细胞受损时，血清中ALT浓度将明显升高。因此，世界卫生组织(WHO)推荐ALT血清活性为肝功能损害最敏感的评价指标。AST的分布较广，尤以心脏和肝脏内的浓度为高。当心、肝等脏器受损时，血清中的AST浓度将明显升高。所以，AST血清活性被用作肝功能损害的另一评价指标。此外，AST血清活性也被用作心脏功能受药物毒性影响的敏感评价指标。

血清中ALT和AST的活性目前医院和血液中心等医疗机构通常采用自动生化分析仪检测。该方法存在诸多缺点。特别值得注意的是，血液样品是通过损伤性采集方式获得的生物样品，传统的生化检测方法破坏血液样品，无法继续使用同一样品进行其他项目的检测。此外，前处理较繁琐耗时、需使用检测试剂、易造成环境污染等均是传统生化检测方法的缺陷。因此，发明一种同时快速无损定性分析血清中两种转氨酶活性的方法，对临床检测十分必要。

化学物质的光谱分析常用紫外-可见、近红外和红外光谱区域，分别测定离域电子跃迁、分子振动的倍频和组合频跃迁、分子振动跃迁。可见，光谱携带了丰富的样品信息，结合化学计量学技术(chemometric techniques)，能够实现复杂体系的高通量、快速、无损分析。光谱分析技术方便、快捷，适用于各层次的医疗及检验机构。

技术实现要素：

本发明的目的是同时快速无损定性分析血清中两种转氨酶的活性，主要包括以下步骤：

(1)采集ALT和AST不同活性的血液样品；

(2)将所采集的血液样品制备成相应的血清样品；

(3)采用生化法测定血清样品中ALT和AST的活性；

(4)测定血清样品的光谱；

(5)采用化学计量学技术对所测血清样品光谱数据进行预处理；

(6)以适宜的血清样品光谱建模区域，结合ALT和AST活性正常值范围，建立ALT和AST活性正常与异常的定性判别模型；

(7)对所建ALT和AST活性定性判别模型的性能进行评价；

(8)用所建模型对未知血清样品中ALT和AST的活性正常与否进行定性分析。

所述步骤(1)中血液样品的采集方法如下：采集空腹志愿者的静脉血适量，置于含有促凝剂的采血管中。

所述步骤(2)中血清样品的制备方法如下：待血液凝固分层，离心，取上清液即为血清样品。

所述步骤(3)中ALT和AST活性参考值的测定方法为目前医疗机构常用的方法，如采用全自动生化分析仪检测等。

所述步骤(4)中光谱可采用傅立叶变换近红外光谱仪，紫外-可见分光光度计等仪器进行测定。仪器的测量参数包括但不限于光谱测量范围、分辨率及扫描次数。

所述步骤(5)中光谱数据的预处理方法可为但不限于未处理、一阶导数、二阶导数、Norris平滑、Savitzky-Golay平滑、均值中心化、定标中的一种或多种。

所述步骤(6)中合理建模光谱区域可手动选择，使用建模软件自动选择以及自动与手动相结合；定性建模算法包括但不限于判别分析法和人工神经网络法。

所述步骤(7)中评价所建定性模型性能的参数包括但不限于校正集正判率和验证集正判率。

所述步骤(8)中用所建校正模型对未知样品进行判定时，未知样品所用的光谱测量方法、光谱测量参数、光谱数据的预处理方法和光谱区域均应与校正集样品一致；用于数据处理的软件包含但不限于TQ Analyst和MATLAB。

该方法适用于同时快速无损定性分析血清中ALT和AST的活性，快速筛查检测指标异常的血液样品。检测过程中，样品无损、无需复杂的样品前处理、无需使用检测试剂、无污染，是一种高通量、方便、快捷的分析技术，值得推广。

附图说明

图1男性ALT和AST活性DA模型结果图。

图2女性ALT和AST活性DA模型结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，该实施例不应解释为对本发明的限制。

实施例

本实施例意在通过傅立叶变换近红外透射光谱法结合化学计量学技术建立判别分析法(DA)定性模型，初步判别血清样品中ALT和AST的活性是否正常。

本实施例涉及的仪器为Antaris II傅立叶变换近红外光谱仪(美国Thermo公司)，采样装置为透射分析模块，信号采集软件为RESULT 3.0，数据分析及DA建模软件为TQ Analyst 8.0。酶活性测定仪器为BS-800M全自动生化分析仪(深圳迈瑞公司)。

本实施例方法主要包括下列几个步骤：

1.血清样品的制备

采集空腹志愿者的静脉血，置于含有促凝剂的采血管中，室温下放置待血液凝固分层，离心取上清液即为血清样品。样品：90个血清样品，其中45个血样采自男性，45个血样采自女性。

2.采用生化法测定血清样品中ALT和AST活性

采用全自动生化分析仪测定血清样品中ALT和AST的活性。健康人血清中ALT活性上限：男性为41U/L，女性为31U/L；AST活性上限：男性为37U/L，女性为31U/L。

3.近红外透射光谱的测定

取适量血清样品注入仪器配有的洁净液体样品管中，注入量约为其体积的2/3，将其正确放入液体样品支架，光谱信号采集软件为RESULT 3.0。光谱扫描范围为10000-4000cm^-1，分辨率为8cm^-1，扫描次数为32次。每次扫描样品前，以相同参数扫描并扣除背景。

4.定性模型的建立及性能评价

由于男性与女性的正常值上限不同，故分别建立男性和女性的DA定性模型。ALT和AST活性均在正常值上限以内的为正常，其余的为异常。随机挑选校正集与验证集的数量比例约为3∶1，血清样品信息见表1。未知样品男性3个，女性3个。模型性能由以下指标来评价：校正集正判率和验证集正判率。

表1血清样品信息

男性DA模型采用原始光谱建模，光谱范围为9881-7200cm^-1，7000-5400cm^-1和5200-4119cm^-1，主成分数为3，累积贡献率为98.2％，校正集及预测集的正判率都为100.0％。女性DA模型采用原始光谱建模，光谱范围为9881-7200cm^-1，7000-6700cm^-1，6600-5400cm^-1和5200-4119cm^-1，主成分数为7，累积贡献率为99.5％，校正集及预测集的正判率都为 100.0％。所建男性DA模型图示化效果见图1，女性DA模型图示化效果见图2。

5.定性模型的应用

分别取3个男性与3个女性未知血清样品应用所建模型预测ALT和AST的活性。未知样品所用的光谱测量方法、光谱测量参数、光谱数据的预处理方法和光谱建模区域均与校正集样品一致。判定结果：3个男性血清样品为异常；2个女性血清样品为正常，1个女性血清样品为异常。

6.结论

本发明通过傅立叶变换近红外透射光谱法结合化学计量学技术建立了DA定性模型。DA模型能够同时快速判别血清样品中ALT和AST的活性是否正常。与传统方法相比，该方法可同时测定多项检测指标，快速无损，操作简便，准确性较高，适用于各层次医疗及检验机构。