一种基于聚离子放大效应的表面电位检测方法与流程

本发明涉及表面电位检测方法，具体地说是一种基于聚离子放大效应的表面电位检测方法。

背景技术：

电位型传感器是化学传感器的一个重要分支，已广泛应用于各种电解质离子的直接测定，其应用涉及临床检测，环境监测，生物学，食品等领域。需要指出的是，尽管近年来电位型传感器已取得巨大发展，然而长期以来采用表面电位法检测特定目标物一直是一个难题。这主要是由于表面电位法的灵敏度比常规电位型传感器要低很多，而且现有的研究主要是基于对带电荷离子的检测。申请人团队采用鱼精蛋白为指示离子，核酸适体作为识别分子，发展了免标记免固定化的核酸适体电位分析方法，然而该方法需要加入指示离子，不能实现无试剂化检测。

现有的研究报道表面电位直接检测法中，主要是对金属离子，蛋白质，致病菌等的检测，但是由于其识别分子与目标物的识别不能引起较大的电荷变化，导致其电位响应小，灵敏度低，而且部分传感器的识别分子的选择性较差，这些因素严重限制了表面电位法的使用。

研究者曾报道了采用核酸适体作为识别分子检测大肠杆菌，直接电位法进行检测，避免了夹心免疫法对分子的标记，然而该方法的电位响应很小，传感器灵敏度低。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于聚离子放大效应的表面电位检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于聚离子放大效应的表面电位检测方法,其特征在于：采用层层组装法对电极进行化学修饰，并于修饰的电极表面固定作为识别分子的聚阴离子核酸适体，而后将电极置于待测目标物溶液内室温下孵育，使电极表面的识别分子从电极表面脱附，从而引起电位变化，进而获得目标物的浓度。

所述采用层层组装法对电极进行化学修饰是在电极表面将带相反电荷的物质交替沉积在电极表面形成聚电解质多层膜。

采用层层组装法对电极进行化学修饰，使电极表面依次沉积带负电物质和带正电物质，而后再固定作为识别分子的聚阴离子核酸适体，通过带负电识别分子与电极阳离子静电相互作用吸附于电极表面，使得修饰的电极表面带有负电荷，而后将电极置于待测目标物溶液内室温下孵育，使识别分子与待测目标物结合形成复合物，使识别分子从电极表面脱附，从而在电极表面基于聚离子放大效应实现电荷发生由负到正的变化，产生电位变化信号，通过电位变化，进而获得目标物的浓度。

所述识别分子为与目标物具有选择性识别特性的单链核苷酸。

所述识别分子为以金属离子、有机小分子、核酸、多糖、蛋白质、细菌、细胞、病毒为配体的各类核酸适体。

所述电极为玻碳电极、石墨电极、金属电极、ITO导电玻璃电极、丝网印刷电极或纸芯片电极。

所述带正电物质为聚阳离子，聚阳离子为聚二甲基二烯丙基氯化铵、聚盐酸丙烯胺、三甲基烯丙基氯化铵-丙烯酰胺共聚物、聚苯乙烯磺酸钠、聚天冬酰胺、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白、、聚季铵盐-6、聚烯丙基胺、树枝状化合物聚酰胺和聚丙撑亚胺或鱼精蛋白类似蛋白。

所述带负电物质为带负电的纳米材料或聚阴离子；带负电的纳米材料为带负电单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、石墨烯、纳米棒、富勒烯、金属纳米材料；聚阴离子为肝素、透明质酸、硫酸软骨素、肝素、海藻酸、黄原胶和葡聚糖。

所述待测目标物为金属离子、有机小分子、核酸、多糖、蛋白质、细菌、细胞或病毒。

本发明优点在于：

1.本发明利用直接表面电位法在聚离子的信号放大作用下检测目标物质含量，其采用的电位型传感器与传统的离子选择性电极不同，本发明传感器是利用表面电位技术进行检测目标物，表面电位测定所需电极制备较为简单，电极表面的反应更加快速。

2.本发明的电位型传感器，采用层层组装法将带有相反电荷的物质修饰于电极表面，当识别分子与目标物结合并脱附，可以使得电极表面的电荷发生由负到正的变化，电极表面电荷的极大变化使得传感器的电位信号产生较大改变，从而引起较大的电位响应，使得电极的灵敏度提高。

3.本发明的电位型传感器所采用的识别分子可以根据目标物的改变而改变，理论上任何物质都有其相应的对该种物质具有选择性识别特性的核酸适体，这极大的增大了本发明的应用范围。

附图说明

图1为本发明实施例提供的各步修饰电极的扫描电子显微镜图(其中a为ITO导电玻璃电极；b为羧基碳纳米管修饰的ITO电极；c为在b的基础上修饰聚二甲基二烯丙基氯化铵的ITO电极；d为在c的基础上修饰核酸适体的ITO电极)。

图2为本发明实施例提供的各步修饰电极的循环伏安图(其中a为玻碳电极；b为羧基化碳纳米管修饰的玻碳电极；c为在b的基础上修饰聚二甲基二烯丙基氯化铵的玻碳电极；d为在c的基础上修饰核酸适体的玻碳电极)。

图3为本发明实施例提供的表面电位传感器对双酚A响应的标准曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规的方法和条件进行选择。

本发明方法无需制作聚合物离子选择性敏感膜，而且目标物与聚阴离子核酸适体的结合反应在电极表面发生，电极电位响应快速。尤为重要的是，聚阴离子的引入极大提高了电极的灵敏度和选择性。

实施例1

以本发明检测有机小分子双酚A为例。其测定步骤如下：

(1)碳纳米管的羧基化

将购买的多壁碳纳米管(南京吉仓纳米科技有限公司)在浓硝酸和浓硫酸体积比为1：3的混合溶液中超声6个小时，然后进行抽滤，直到滤液为中性，最后置于真空干燥箱中进行干燥，即得羧基化的多壁碳纳米管。

(2)电极修饰

将电极用0.3微米的三氧化二铝进行打磨，然后用水冲洗，并在丙酮、乙醇、水中进行超声清洗并在红外光下干燥。将羧基化的多壁碳纳米管配制成溶剂为N,N-二甲基甲酰胺的0.5mg/mL的溶液，取5微升滴在电极上，自然晾干。然后将电极置于1mol/L的氢氧化钠溶液中1分钟，小心冲洗电极并将其在1mg/mL的聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液(含0.5mol/L的氯化钠)中放置20分钟，以便将聚二甲基二烯丙基氯化铵修饰于电极上，电极在室温条件下晾干。然后在电极上滴5微升浓度为10^-9M的核酸适体(对双酚A具有选择性识别特性)溶液，自然晾干。至此，电极表面修饰完成。

(3)电极表征

为方便表征，使用ITO导电玻璃电极作为基底进行场发射扫描电子显微镜表征(如图1)；将上面各步修饰的电极在铁氰化钾溶液(5mM Fe(CN)6^4-/3-)中进行循环伏安法扫描，以表征电极的修饰过程(如图2)。

(4)双酚A测定

首先，将20微升的不同浓度的双酚A溶液滴加在电极上，孵育15分钟，然后用水小心冲掉电极上的溶液。待电极干燥后，作为工作电极与参比电极(银/氯化银电极)组成两电极体系在电化学工作站上进行电位测定。以开路电位对双酚A浓度对照，绘图得标准工作曲线(如图3)。

电极性能：本发明电极可在10^-7.5mol/L—10^-6mol/L双酚A浓度范围内呈现良好的结尾响应，检出限可达10^-8mol/L。

实施例2

所述的电极修饰为：将羧基化的石墨烯配制成溶剂为水的0.5mg/mL的溶液，取5微升滴在电极上，自然晾干。然后将电极置于1mol/L的氢氧化钠溶液中1分钟，小心冲洗电极并将其在1mg/mL的聚二甲基二烯丙基氯化铵溶液(含0.5mol/L的氯化钠)中放置20分钟，以便将聚二甲基二烯丙基氯化铵修饰于电极上，电极在室温条件下晾干。然后在电极上滴5微升浓度为10^-9M的核酸适体溶液，自然晾干。至此，电极表面修饰完成。此修饰电极可以用于双酚A的测定。

实施例3

所述的聚阳离子为鱼精蛋白，聚阴离子核酸适体为对西维因选择性识别的单链核苷酸，将这两种物质修饰于电极，用于测定水体中西维因的含量。

实施例4

所述的聚阳离子为聚乙烯亚胺，聚阴离子为对大肠肝菌具有选择性识别的核酸适体，将这两种物质修饰于电极，用于测定水体中大肠肝菌的含量。