皮肤角质层的NGAL的表达量的用途的制作方法

本发明涉及皮肤角质层的NGAL的表达量的用途，特别涉及其适用于评价皮肤粘弹性的用途。

背景技术：

皮肤的健康状况可使用各种各样的指标来进行评价。例如，可将皮肤的“弹性”感的有无作为健康状况和老化度的评价指标之一。“弹性”被分为来源于角质层、表皮的弹性与来源于真皮的弹性二种。特别地，来源于真皮的弹性为如果以手指按压皮肤则存在要推回来的弹力，将如果移开手指则迅速复原的状态称为好的弹性，物理上也称为粘弹性。而皮肤所显示的该粘弹性也因年龄和紫外线暴露、皮肤暴露于化学物质等而降低。因此，皮肤的弹性也可以成为皮肤老化的指标。

已经开发了将皮肤看做一个弹性体来测定皮肤的粘弹性率，代替“弹性”这样的感官性评价方法而使用的方法及测定装置。作为代表性的皮肤粘弹性测定装置，有CUTOMETER(キュートメーター，商品名)(Courage&Khazaka公司制)。该装置将皮肤表面引入负压状态的探测器开口部，通过棱镜测定被引入开口部的皮肤长度，然后解除吸引，同样地测定解除时的位移长度(返回)，将该测定结果作为参数求出粘弹性率(参见非专利文献1)。将使用了此装置的粘弹性率作为指标，皮肤的老化度的评价、评价化妆品的效果在化妆品业内、与美容相关医疗领域中广泛普及。

专利文献1中记载了使用CUTOMETER作为评价进行用于改善皮肤的松弛这样的美容手术时的效果的设备。

非专利文献2中记载了使用CUTOMETER评价含有葡糖苷酰鞘氨醇的甜菜提取物对皮肤弹性的影响。如此，认为皮肤粘弹性是用于评价皮肤的健康状态的重要参数。

但是，利用CUTOMETER的皮肤粘弹性的测定技术为，用于测定的探测器和装置价格贵，另外在使用时要求熟练。因此，正在谋求更加简便的方法。

另外，也提出了通过化学性的分析方法测定皮肤的粘弹性这样的物理性指标的方法。

专利文献2中记载了，如果通过0.15％的次氯酸钠清洗人的前臂，荧光标记并测定清洗前后的氧化蛋白质，则氧化蛋白质量增加，进而通过所述CUTOMETER测定前臂部而获得的物理量R0(最大拉伸宽度)的处理前后的比值增加。而且，同样地，在专利文献2提出了基于此结果将氧化蛋白质作为指标来评价皮肤的柔软性的方法。

进一步，本发明是涉及作为属于脂质运载蛋白家族的蛋白质的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)的发明。NGAL的基因序列和蛋白质的结构公开于专利文献3中。在本发明中，将公开于此专利文献3中的NGAL用于发明中。作为NGAL的利用技术，虽然专利文献4中公开了NGAL可以成为特应性皮炎的标记物，但尚未公开将其适用于皮肤粘弹性的评价。在反复研讨之后，本申请发明者完成了本发明。

已有技术文献

专利文献

【专利文献1】特开2010-51717号公报

【专利文献2】特开2006-34372号公报

【专利文献3】特表2005-503829号公报

【专利文献4】特表2008-536483号公报

非专利文献

【非专利文献1】皮肤粘弹性测定装置CUTOMETER MPA580手册、2007.5修正版、Integral公司(皮膚粘弾性測定装置CUTOMETER MPA580マニュアル、2007.5修正版、株式会社インテグラル)

【非专利文献2】堀未央、米井嘉一等,《抗老化药物》,7[11]129-142,2010(堀未央、米井嘉一他、Anti-Aging Medicine,7[11]129-142,2010)

技术实现要素：

发明所要解决的课题

本发明作为NGAL的新用途，以使之为用于预测、评价皮肤的粘弹性的新指标为课题。

用于解决课题的手段

本发明者在使用所述CUTOMETER测定皮肤的粘弹性，探索与粘弹性的参数具有关联关系的标记物的过程中，发现了皮肤角质层中的属于脂质运载蛋白家族的蛋白质中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(以下称之为“NGAL”)可以成为粘弹性的指标，完成了本发明。

进一步，发现了NGAL与被测试者的年龄具有高度的关联，也可以成为老化的指标。

即，本发明的构成如以下所述：

(1)皮肤角质层的NGAL的表达量适用于评价皮肤粘弹性的用途。

(2)皮肤角质层的NGAL的表达量适用于评价皮肤粘弹性的用途，其特征在于，包含：

采集被测试者的皮肤角质层的采集工序、测定通过所述采集工序所采集的角质层的NGAL的表达量的测定工序、由通过所述测定工序所测定的NGAL的表达量来求出皮肤粘弹性的工序。

(3)如(2)所述的用途，采集皮肤的角质层的所述采集工序为利用胶带剥离法进行的。

(4)通过(1)～(3)所述的用途而获得的皮肤粘弹性的评价结果。

(5)通过(4)获得的皮肤粘弹性的评价结果适用于评价化妆品的效果的用途。

(6)通过(4)获得的皮肤粘弹性的评价结果适用于评价皮肤老化的用途。

发明效果

在本发明的用途中，因为能够基于作为生物化学性的标记物的皮肤角质层中的NGAL的测定结果获得作为物理性的指标的皮肤的粘弹性，所以CUTOMETER等专用的测定装置变得不需要，皮肤粘弹性测定能够简化。另外，皮肤角质层可利用胶带剥离法而容易地采集，能够通过邮寄等简易的手段进行运送，因此在一个地方进行大量的被测试者的皮肤粘弹性的测定变得可能。另外，能够将NGAL作为新的老化指标。

附图说明

图1为测定操作CUTOMETER时所获得的皮肤的变形而得的曲线图；

图2为进行角质层中的NGAL测定值与皮肤粘弹性参数R2的关联分析的图；

图3为进行角质层中的NGAL测定值与皮肤粘弹性参数R7的关联分析的图；

图4为进行角质层中的NGAL测定值与年龄的关联分析的图。

具体实施方式

本发明为涉及皮肤角质层的NGAL的表达量适用于评价皮肤粘弹性的用途及NGAL的利用的发明。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)为从属于存在于皮肤角质层中的脂质运载蛋白家族的蛋白质。已知NGAL存在于健康人的血液和尿液中，其量在各种炎症性疾患和细菌感染时上升。另外，除了被用作急性肾功能衰竭的血液中标记物，还作为各种肿瘤标记物而受到关注。在本发明中，将专利文献3所公开的人NGAL用于发明。另外，专利文献4所公开的标记物成为替代皮肤的粘弹性参数的指标。鉴于所述状况，本申请发明者们以充分发现NGAL的用途为目的，由此发现了该新用途。

现有技术的利用CUTOMETER的皮肤粘弹性的测定如下所述而进行。

标准地，以吸引径6毫米，以300mb的吸入压力进行5秒钟吸引，解析之后开放时发生变形的皮肤的位移。作为能够通过CUTOMETER获得的皮肤粘弹性值的测定参数，解析如上所述以一定的吸入压力和时间发生变形的皮肤的位移而求出的返回弹性比率(Ur/Uf)主要用于评价。将利用CUTOMETER获得的皮肤的位移量随时间测定的代表性的曲线显示于图1中。在图1中，Uf：吸引时皮肤的延伸(对应于图1的Uf1)、Ur：即时性收缩(对应于图1的Ur1)、Ua：吸引释放时皮肤的返回(对应于图1的Ua1)。用作皮肤的粘弹性指标的参数有，R2：相对于吸引时皮肤延伸长度的吸引开放时皮肤的返回率＝皮肤的复原率(R2＝Ua/Uf)、R7：相对于吸引时皮肤延伸长度的即时性(瞬间的)收缩率＝收缩时的弹性率(R7＝Ur/Uf)。R2表示整体的弹力，完全弹性体为1.00，人皮肤为0.3～0.5。R7为返回弹性比率，越接近1则弹性越好，人皮肤为0.3～0.5。

另一方面，在本发明的用途中，测定基因量或蛋白质量作为皮肤角质层试样中的NGAL的表达量。在此，作为皮肤试样，优选包含人的表皮角质层的皮肤试样，作为方法，采用将粘着性胶带粘贴于皮肤上，在将其剥离时，将附着于胶带上的角质层作为试样的胶带剥离法对患者的负担少而优选。

在将皮肤试样中的NGAL作为基因试样而进行测定时，可举出例如RT-PCR法等。另外，NGAL基因的定量可通过实时(real time)RT-PCR进行。作为NGAL蛋白质的测定手段，可采用例如免疫染色等。用于进行测定的抗NGAL抗体及其标识体可使用市售品。

在免疫染色时，可通过例如荧光免疫染色进行测定。可通过例如以市售的测定装置和软件来将荧光强度进行定量来进行NGAL的定量。

另外，优选作为含有所述抗NGAL抗体、其标识体、第2抗体、标识第2抗体等的ELISA试剂盒。进一步，可作为与用于分析的缓冲液等组合而成的检查试剂盒。

【实施例】

下面举出实施例来详细说明本发明，但本发明并不受限于这些实施例。

1.皮肤粘弹性和NGAL的测定

A.方法

(1)试验对象

健康女性45岁～69岁(37名)

(2)使用CUTOMETER的粘弹性测定

在面部右侧脸颊部上统一测定部位来测定粘弹性。测定使用CUTOMETER MPA 580，使用附带的探测器，以吸引径6毫米，300mb吸入压力吸引5秒钟的模式进行。

B.NGAL的测定

·角质层采集

从被测试者的脸颊部使用一片2.5cm×2.5cm的角质层测试片(checker，朝日化工技术实验室公司(アサヒテクノラボ社)制)进行剥离，采集角质层。

·角质层提取方法

向纳入了玻璃珠与500μl的T-PER缓冲液(#78510/Thermo SCIETIFIC)的试管中添加采集了角质层的角质层测试片，使用珠型细胞破碎装置(Tommy)，以4600rmp、180秒提取角质层蛋白。

·角质层中总蛋白量的测定

各样品的蛋白量使用皮尔斯BCA蛋白测定试剂盒(Pierce BCA protein Assay Kit)(Thermo Scientific#23225)来测定。在测定中，向角质层样品10μl中添加以试剂A：试剂＝50：1混和而成的液体200μl，以60℃30分钟孵育之后，562nm的吸光度进行测定。同时，以精制牛血清白蛋白为标准品作出标准曲线，由吸光度的值计算蛋白量。

·角质层中NGAL量的测定

各样品的NGAL表达量，使用市售的ELISA试剂盒(R&D系统#DY1757)，利用夹心(Sandwich)ELISA法通过以下标准进行测定。

(1)吸附抗体的固定化

向96孔板(COSTAR#3590)添加以PBS(-)(WAKO#16219321)稀释所得液体100μl/孔，以使大鼠NGAL(大鼠抗脂质运载蛋白-2部分842271，rat anti-Lipocalin-2 part 842271)变为最终浓度2.0μg/ml，在25℃、氧/氮混合气氛下进行孵育。

(2)阻断

添加使用蒸馏水稀释为10倍而成的稀释液(R&D#890803)300μl/孔，在25℃下孵育1小时。

(3)样品添加

分别以100μl/孔添加标准曲线制作用的基因重组NGAL(重组人脂质运载蛋白-2部分842273，recombinant human Lipocalin-2 Part 842273)、人角质层提取液(以2倍的T-PER缓冲液稀释)，在25℃下孵育2小时。

(4)检测用抗体反应

将通过稀释液使其最终浓度变为100ng/ml的方式稀释生物素标记的山羊抗人脂质运载蛋白-2(部分842272)(biotinylated goat anti-human Lipocalin-2(Part 842272))而成的反应液以100μl/孔进行添加，在25℃孵育2小时。

(5)链霉亲和素-HRP反应

将通过试剂稀释剂稀释为200倍的链霉亲和素-HRP(部分890803)(Streptavidin-HRP(Part 890803))以100μl/孔进行添加，在25℃下孵育20分钟。

(6)TMB反应

将TMB单溶液(Promega公司#G7431)以100μl/孔进行添加，在25℃下孵育7.5分钟。

(7)反应终止液的添加与通过吸光光度计的测定

以100μl/孔添加0.5N的H2SO4(Wako#198-09595)，使反应停止，使用SPECTRA MAX 190(分子装置)测定450nm-540nm的吸光度。

另外，在进行步骤(2)～(6)之前使用清洗用缓冲液(0.05％Tween20/PBS)进行板的清洗。

作为角质层中NGAL量，通过提取液中的总蛋白量进行校正，以每单位蛋白量的NGAL量进行表示。

C.结果

粘弹性与NGAL的关联解析

关于粘弹性和NGAL的测定结果，进行了皮尔逊(Pearson)的单关联分析，求出单关联回归方程与关联系数。散点图和回归方程显示于图2、3中。

R2的粘弹性参数与NGAL测定值的关联系数R＝0.319、R7的粘弹性参数与NGAL测定值的关联系数为R＝0.303。由此解析结果，皮肤角质层的NGAL测定结果明显可代替通过CUTOMETER所测定的皮肤的粘弹性参数R2、R7。

即，能够代替皮肤的粘弹性的物理性的测定结果，通过测定NGAL来评价皮肤的粘弹性。

2.作为老化指标的NGAL的利用

进行了能不能将NGAL的测定结果作为老化指标而利用的试验。

与前述1.的试验同样地测定97名健康女性的脸颊部的NGAL，为了确认有无与年龄的关联，关于年龄与NGAL值，进行利用了皮尔逊方法的2元配置的关联分析。将散点图、一次回归方程、关联系数显示于图5中。

能够确定年龄与NGAL值存在负的关联。另外，如上所述，观察到皮肤的粘弹性与NGAL中存在正的关联，所以可知可将NGAL作为老化的指标而利用。