分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物含量及有关物质的方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物含量及有关物质的方法。
背景技术：
：他扎罗汀倍他米松乳膏为治疗银屑病的复方制剂，内含他扎罗汀及二丙酸倍他米松，是由0.05％他扎罗汀和0.05％二丙酸倍他米松(以倍他米松计)组成的全新复方制剂，主要用于治疗寻常型银屑病。他扎罗汀是第三代维a酸类药物，对寻常性斑块型银屑病有特效，他扎罗汀给药后在体内快速脱脂并转化成活性成分他扎罗汀酸，选择性地与维a酸受体结合，靶向作用于病变组织，调节细胞分化、抗增殖、抗炎；二丙酸倍他米松是一种脂溶性、糖皮质激素类药物；他扎罗汀与二丙酸倍他米松均为临床上治疗银屑病的有效药物，他扎罗汀与二丙酸倍他米松均为临床上治疗银屑病的有效药物，临床研究结果表明该浓度下两药的协同作用增强，且能减轻糖皮质激素引起的皮肤萎缩而不抑制其抗炎作用，同时可降低他扎罗汀的刺激性而不影响疗效。在现临床皮肤科领域，广泛应用他扎罗汀乳膏和二丙酸倍他米松乳膏乳两药联用。他扎罗汀倍他米松乳膏是全新复方制剂，现有的方法是对他扎罗汀和二丙酸倍他米松两种药物分别进行检测。到目前为止，还没有公开的方法报道可有效对他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物及其有关物质进行分离和定量测定。因此开发一种同时分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏两种药物含量及有关物质的方法，对于实现他扎罗汀倍他米松乳膏的质量控制、安全性保证具有极其重要的意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物含量及有关物质的方法，该方法属于一种反相高效液相色谱法，可同时分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物含量及有关物质，本发明的方法重复性好，检查结果准确可靠。为实现上述目的，本发明的技术方案为：用于固液分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物含量及有关物质的试剂组合物，其特征在于，由以下试剂组成：试剂a：酸性水溶液体系；试剂b：乙腈；所述两种药物为他扎罗汀和二丙酸倍他米松；所述酸性水溶液体系由酸性添加剂，甲醇和水组成；甲醇和水的体积比为2-10：90-98；酸性添加剂的体积百分比为0.05％～0.15％。作为一种优选，甲醇和水的体积比为5：95。作为一种优选，酸性添加剂的体积百分比为0.1％。进一步，所述酸性添加剂为三氟乙酸、冰醋酸中的一种或多种。作为一种优选，所述酸性添加剂选用三氟乙酸。所述的他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物为他扎罗汀和二丙酸倍他米松，有关物质包括：倍他米松，倍他米松17-丙酸酯，倍他米松21-丙酸酯、他扎罗汀亚砜、他扎罗汀砜、他扎罗汀酸。本发明的目的之二在于提供一种用所述试剂组合物分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物含量及有关物质的方法，具体包括以下步骤：1)配制供试样品溶液：取供试样品溶于乙腈，得样品溶液；2)配制流动相：a配制所述试剂a得流动相a；b所述试剂b做流动相b；3)将步骤1)所述样品溶液注入分离检测系统中，用步骤2)所述流动相对步骤1)所述样品溶液进行线性梯度洗脱得洗脱液；4)步骤3)所述洗脱液进入检测器测定。进一步，步骤3)所述的他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物为他扎罗汀和二丙酸倍他米松，有关物质包括：倍他米松，倍他米松17-丙酸酯，倍他米松21-丙酸酯、他扎罗汀亚砜、他扎罗汀砜、他扎罗汀酸。进一步，步骤3)所述的线性梯度洗脱的程序如下表：作为一种优选，步骤3)所述的线性梯度洗脱的程序如下表：进一步，步骤3)所述的流动相的流速为每分钟0.9ml-1.1ml。作为一种优选，步骤3)所述的流动相的流速为每分钟1.0ml。本发明的目的之三在于提供一种高效液相色谱法分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物含量及有关物质的方法，具体包括以下步骤：1)配制空白溶液：取乙腈稀释溶液作为空白溶液；2)配制供试样品溶液：取供试样品溶于乙腈，得样品溶液；3)配制对照品溶液：取他扎罗汀对照品、二丙酸倍他米松对照品及各有关物质对照品，用乙腈溶解稀释制成对照品溶液；4)分别取步骤1)所述空白溶液、步骤2)所述供试样品和步骤3)所 述对照品溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，确定他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物及其有关物质的保留时间，按外标法以峰面积计算供试样品溶液中他扎罗汀倍他米松乳膏两种药物含量及有关物质。记录的色谱图按出峰顺序依次为倍他米松、倍他米松17-丙酸酯、他扎罗汀亚砜、倍他米松21-丙酸酯、他扎罗汀砜、他扎罗汀酸、二丙酸倍他米松和他扎罗汀；理论板数按他扎罗汀峰计算不低于50000、按二丙酸倍他米松峰计算不低于50000。检测中溶剂峰不干扰他扎罗汀倍他米松乳膏中有关物质的测定，且他扎罗汀倍他米松乳膏中有关物质均能有效分离，分离度大于2.0。进一步，步骤4)所述高效液相色谱分析采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，色谱柱柱箱温度为20-35℃；以酸性水溶液体系和乙腈作为流动相。进一步，步骤4)所述检测器的检测波长为240-260nm。作为一种优选，步骤4)所述检测器的检测波长为250nm。进一步，所述色谱柱的规格为4.6×250mm，5μm。本发明的有益效果在于：本发明的分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏中有关物质的方法属于一种反相高效液相色谱法，可同时分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏中的有关物质，即能同时测定他扎罗汀和二丙酸倍他米松两种药物的含量，本发明的方法重复性好，检测中溶剂峰不干扰他扎罗汀倍他米松乳膏两种药物含量及有关物质的测定，且他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物及其有关物质均能有效分离，分离度大于2.0，检查结果准确可靠，对于实现他扎罗汀倍他米松乳膏的质量控制具有重要的意义。附图说明图1为他扎罗汀、二丙酸倍他米松及相关杂质的混合溶液高效液相色谱图。图2为他扎罗汀酸倍他米松乳膏空白基质高效液相色谱图。图3为他扎罗汀酸倍他米松乳膏样品高效液相色谱图。具体实施方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述
发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例1分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏中有关物质的方法仪器：shimadzulc-20a(日本岛津)色谱柱：vp-ods4.6×250mm5μm流动相a：0.1％三氟乙酸溶液-甲醇(95：5)流动相b：乙腈流速：1.0ml/min检测器：uv检测波长：250nm进样体积：20μl色谱工作站：labsolution线性梯度洗脱程序：样品配制：取本品约5g，精确加入乙腈25ml，置50℃水浴中加热，搅拌使膏体融化分散均匀后，继续搅拌2分钟，取出，趁热转移至50ml具塞离心管中，置冰水浴中冷却30分钟以上，离心使分层，取上清液迅速滤过， 取续滤液，放至室温，作为供试品溶液；分别精密称取倍他米松、倍他米松17-丙酸酯、倍他米松21-丙酸酯、他扎罗汀亚砜、他扎罗汀砜和他扎罗汀酸对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中各约1μg的溶液，作为对照品溶液。实施例2分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏中两种药物含量的方法仪器：shimadzulc-20a(日本岛津)色谱柱：vp-ods4.6×250mm5μm流动相a：0.1％三氟乙酸溶液-甲醇(95：5)流动相b：乙腈流速：1.0ml/min检测器：uv检测波长：250nm进样体积：20μl色谱工作站：labsolution线性梯度洗脱程序：样品配制：取本品2.0g(约相当于他扎罗汀1mg与倍他米松1mg)，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加乙腈25ml，置50℃水浴中加热，振摇使主药溶解，放冷至室温，并用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取他扎罗汀对照品和二丙酸倍他米松对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中约含他扎罗汀20μg和倍他米松20μg的溶液，摇匀，同法测定，按外标法以峰面积计算(其中二丙酸倍他米松乘以0.7778折算为倍他米 松)，即得。实施例3样品检测结果按实施例1和实施例2方法，对多批次他扎罗汀倍他米松乳膏的有关物质和含量进行检测。表8他扎罗汀倍他米松乳膏有关物质检测结果批号倍他米松17-丙酸酯，％倍他米松21-丙酸酯，％他扎罗汀亚砜，％20100030.100.220.4420100040.130.240.4620100050.140.230.48201306010.070.350.25201306020.070.330.28201306030.070.260.25表9他扎罗汀倍他米松乳膏含量检测结果批号二丙酸倍他米松(按倍他米松计)，％他扎罗汀，％2010003100.5100.6201000499.9100.3201000597.999.92013060198.297.02013060297.896.62013060399.696.8实施例4方法学验证分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏有关物质1、系统适用性试验分别称取倍他米松、倍他米松17-丙酸酯、倍他米松21-丙酸酯、他扎罗汀亚砜、他扎罗汀砜、他扎罗汀酸、他扎罗汀和二丙酸倍他米松对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含倍他米松1μg、倍他米松17-丙酸酯1μg、倍他米松17-丙酸酯1μg、他扎罗汀亚砜1μg、他扎罗汀砜1μg、他扎罗汀酸1μg、他扎罗汀100μg和二丙酸倍他米松100μg的混合溶液，照上述有关物质方法(实施例1)进样20μl，记录色谱图(图1)。试验结果：理论板数按他扎罗汀峰计算为147610、按二丙酸倍他米松峰计算为80699；他扎罗汀酸和二丙酸倍他米松的分离度为2.18。2、空白基质干扰试验取他扎罗汀倍他米松乳膏和空白基质各5g，照上述有关物质方法处理 溶配后，进样20μl，并记录色谱图(图2、图3)。试验结果：空白基质不干扰各相关物质的检测。3、定量限用乙腈配制每1ml中约含倍他米松0.128μg、倍他米松17-丙酸酯0.128μg、倍他米松21-丙酸酯0.128μg、二丙酸倍他米松0.128μg、他扎罗汀亚砜0.1μg、他扎罗汀砜0.1μg、他扎罗汀酸0.1μg和他扎罗汀0.1μg的溶液(相当于有关物质检测供试品溶液浓度0.1％)，作为定量限溶液，连续进样6次，考察峰面积重复性及信噪比。表1检测方法定量限试验结果：各组分在相当于供试品溶液浓度0.1％时重复进样，峰面积rsd均小于2％，信噪比(s/n)均大于10，符合高效液相色谱法对有关物质测定的要求。4、线性关系取倍他米松、倍他米松17-丙酸酯、倍他米松21-丙酸酯和二丙酸倍他米松12.85mg，精密称定，用乙腈溶解并稀释成每1ml中约含0.064μg～2.57μg(相当于供试品溶液浓度0.05％～2.0％)的溶液；取他扎罗汀亚砜、他扎罗汀砜、他扎罗汀酸和他扎罗汀10mg，精密称定，用乙腈溶解并稀释成每1ml中约含0.05μg～2μg(相当于供试品溶液浓度0.05％～2.0％)的溶 液，进样20μl，记录色谱图，量取峰面积进行线性回归。表2有关物质检测方法线性关系组分名称线性方程相关系数倍他米松y＝349.36x+12.11r＝0.9999倍他米松17-丙酸酯y＝333.70x+33.80r＝1.0000倍他米松21-丙酸酯y＝352.82x–9.54r＝1.0000二丙酸倍他米松y＝320.93x+17.94r＝1.0000他扎罗汀亚砜y＝377.65x-20.53r＝1.0000他扎罗汀砜y＝406.19x+18.04r＝0.9999他扎罗汀酸y＝455.20x–43.73r＝0.9999他扎罗汀y＝486.73x–91.86r＝1.0000试验结果：各组分在相当于供试品溶液浓度为0.05％～2.0％范围内，测定溶液浓度与峰面积呈良好的线性关系，符合高效液相色谱法对有关物质测定的要求。5、精密度按有关物质方法配制9份样本试验，有关物质检测供试品溶液浓度80％，100％，120％各三个样本。表3有关物质检测方法精密度试验结果：各杂质测试结果rsd小于3％，，符合高效液相色谱法对有关物质测定的要求。6、回收试验用乙腈配制每1ml中约含倍他米松128μg、倍他米松17-丙酸酯128μg、倍他米松21-丙酸酯128μg、他扎罗汀亚砜100μg、他扎罗汀砜100μg和他扎罗汀酸100μg的混合溶液。精密量取混合液0.1ml、0.5ml、1.0ml置于5g样品乳膏中(相当于加入供试品溶液浓度0.1％，0.5％，1.0％)，搅拌均匀，每个浓度制备三个样本，照有关物质方法配制供试品溶液和对照品溶液。 扣除样品本底后计算各杂质回收率。表4有关物质检测方法回收率试验结果：在相当于0.1％～1.0％范围内，各杂质的回收率均在为85％～115％，rsd均小于5％。表明该方法准确度高，符合高效液相色谱法对有关物质测定的要求。实施例5方法学验证分离测定他扎罗汀倍他米松乳膏两种药物的含量1、系统适用性试验分别称取倍他米松、倍他米松17-丙酸酯、倍他米松21-丙酸酯、他扎罗汀亚砜、他扎罗汀砜、他扎罗汀酸、他扎罗汀和二丙酸倍他米松对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含倍他米松1μg、倍他米松17-丙酸酯1μg、倍他米松17-丙酸酯1μg、他扎罗汀亚砜1μg、他扎罗汀砜1μg、他扎罗汀酸1μg、他扎罗汀100μg和二丙酸倍他米松100μg的混合溶液，照上述有关物质方法(实施例1)进样20μl，记录色谱图(图1)。试验结果：理论板数按他扎罗汀峰计算为147610、按二丙酸倍他米松峰计算为80699；他扎罗汀酸和二丙酸倍他米松的分离度为2.18。2、空白基质干扰试验取他扎罗汀倍他米松乳膏和空白基质各5g，照上述有关物质方法处理溶配后，进样20μl，并记录色谱图(图2、图3)。试验结果：空白基质不干扰两种药物的检测。3、定量限用乙腈配制每1ml中约含二丙酸倍他米松0.128μg和他扎罗汀0.1μg的 溶液(相当于含量检测供试品溶液浓度0.5％)，作为定量限溶液，连续进样6次，考察峰面积重复性及信噪比。表1检测方法定量限试验结果：两种药物在相当于含量检测供试品溶液浓度0.5％时重复进样，峰面积rsd均小于1％，信噪比(s/n)均大于10，符合高效液相色谱法对含量测定的要求。4、线性关系精密称取二丙酸倍他米松对照品约32mg(相当于倍他米松25mg)，他扎罗汀对照品约25mg，置200ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为贮备液，精密量取贮备液各2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置25ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度(相当于含量供试品浓度50％～150％)，摇匀，依次取20μl进样，分别记录峰面积，并进行线性回归。表5含量检测方法线性关系组分名称线性方程相关系数二丙酸倍他米松y＝36702x+4048.0r＝0.99999他扎罗汀y＝49333x+2330.2r＝0.99999试验结果：各组分在相当于含量检测供试品溶液浓度50％～150％范围内，测定溶液浓度与峰面积呈良好的线性关系。5、精密度按含量方法配制9份样本试验，含量检测供试品溶液浓度80％，100％，120％各三个样本。表6含量检测方法精密度试验结果：各组分测试结果rsd均小于2％，符合高效液相色谱法对含量测定的要求。6、回收试验用乙腈配制每1ml中约含二丙酸倍他米松0.25mg(相当于倍他米松0.2mg)和他扎罗汀0.2mg的混合溶液。精密量取4.0ml，5.0ml，6.0ml各3份，分别加入2g空白基质中，搅拌均匀，照含量方法制备成供试品溶液，依法测定各份的含量，计算回收率。表7含量检测方法回收率试验结果：本品在相当于80％～120％范围内，测得二丙酸倍他米松的平均回收率为100.5％，rsd为0.63％；他扎罗汀的平均回收率为100.6％，rsd为0.64％。表明该方法准确度好，符合高效液相色谱法对含量测定的要求。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12