技术领域本发明涉及一种用于单细胞电泳芯片的双激光诱导荧光多色检测器，特别用于微流控芯片电泳分离的单细胞内“不同激发、不同发射”荧光标记多组分活性小分子的同时检测与定量分析，属于化学分析仪器领域，也属于微流控芯片检测技术领域。
背景技术：
细胞的生命过程需要多种活性小分子的协同参与，为了发现以往在细胞群体研究中因统计学检测而被掩盖或无法发现的生理机制，进一步研究细胞的生理、病理过程，需要同时定量测定单细胞内多种活性小分子的含量。然而，由于细胞体系中许多活性小分子不仅共存，而且反应活性高、可以相互转化、彼此干扰严重等条件的限制，目前商品化仪器难以准确定量单细胞内的活性小分子，使得单细胞内多种活性小分子同时定量测定的分析问题至今尚无解决之良策。一般来说，激光相干性好，易聚焦成微束，适合微区样品的检测，因而基于激光优良特性的各类检测仪器的研制和应用已成为化学分析仪器研究的热门领域。激光诱导荧光检测器作为目前化学分析领域最灵敏的检测技术之一，具有超微样品检测体积、检测灵敏度高、特异性强、重现性好的特点。更为重要的是，将激光诱导荧光检测器与高分辨率分离技术相结合,例如毛细管电泳、微流控芯片等，其应用领域可从化学样品扩展到生物样品，如基因、蛋白质及单细胞等，并对这些领域的分析研究产生了较大的推动作用。与毛细管电泳相比较，微流控芯片具有二维或三维通道网络结构，适合在一块微小芯片上完成诸如单细胞进样、溶膜和细胞内多组分分离分析等操作的平行化处理，由此产生的仪器和方法具有进样体积小、分离效率高、分析速度快和易于自动化整合等诸多优势。由于引入了电泳分离，微流控芯片与激光诱导荧光检测器的联用，不但适于单细胞内多种化学组分的分离测定，并且消除了细胞基体对测定的干扰，已成为近年来单细胞分析研究的一个热点领域。但是，面对微流控芯片的快速发展，以及在众多领域对单细胞内多组分小分子同时定量检测需求，目前用于微流控芯片的激光诱导荧光检测器不适应“不同吸光、不同荧光特性”或“不同激发、不同发射”多色荧光标记物质的同时检测与定量。究其原因是，已报到的激光诱导荧光检测器多是基于单一波长激光激发、单色荧光检测的设计，尚未见双波长激光诱导荧光多色检测器用于微流控芯片电泳分离分析的报道，也未见同时定量测定单个细胞内三组分或三组分以上多色荧光标记小分子的报道。另外，现有的激光诱导荧光检测的聚焦激光与芯片分离通道的对准，多是基于测试者的主观判断，难以确保检测灵敏度和稳定性。综上可见，探索对单细胞内“不同激发、不同发射”荧光标记多组分活性小分子同时定量测定的双激光诱导荧光多色检测器，将极大拓展激光诱导荧光检测、微流控芯片、单细胞分析及小分子检测的研究与应用空间。
技术实现要素：
本发明的目的旨在克服现有技术之不足，提供一种用于单细胞电泳芯片的双激光诱导荧光多色检测器。利用本发明可以方便地对微流控芯片电泳分离的单细胞内“不同激发、不同发射”荧光标记多组分活性小分子进行同时检测与定量。本发明的目的可通过如下技术措施来实现：一种用于单细胞电泳芯片的双激光诱导荧光多色检测器，包括激光激发模块(1)、荧光收集与探测模块(2)、显微成像模块(3)、信号采集与处理模块(4)和微流控芯片检测平台(5)，其特征在于：所述的激光激发模块(1)：由固定波长激光器(101)，固定波长激光器(102)，第一全反射镜(103)，二向色激光合束器(104)，扩束器(105)，多边缘二向色分束器(202)和第一物镜(201)组成；其中：所述固定波长激光器(101)出射的水平光路上同轴地设有第一全反射镜(103)，第一全反射镜(103)的反射面与水平光路的夹角为45度，且第一全反射镜(103)与二向色激光合束器(104)平行；所述固定波长激光器(102)出射的水平光路上同轴地设有二向色激光合束器(104)、扩束器(105)和多边缘二向色分束器(202)，多边缘二向色分束器(202)的反射面与水平光路的夹角为135度；所述多边缘二向色分束器(202)的反射光路上同轴地设有第一物镜(201)，在第一物镜(201)的上方设有供微流控芯片(8)放置与固定的微流控芯片检测平台(5)，在第一物镜(201)的焦平面位置，第一物镜(201)的轴与微流控芯片分离通道中的样品液流的轴垂直且相交于检测区，以激发样品产生荧光；所述的荧光收集与探测模块(2)：通过无限远校正光学系统收集由检测区发出的荧光；在所述无限远校正光学系统中：第一透镜(206)、第二透镜(207)和第三透镜(208)的轴分别与第一物镜(201)的轴垂直并相交，交点位于多边缘二向色分束器(202)的下方，且交点处分别设置有与多边缘二向色分束器(202)平行的第一单边缘二向色分束器(203)、第二单边缘二向色分束器(204)和第二全反射镜(205)；所述第一单边缘二向色分束器(203)将经第一物镜(201)收集、多边缘二向色分束器(202)透过的检测区发出的荧光被分成两路，波长小于575nm的绿光反射进入同轴设置的第一透镜(206)、第一可调光阑(209)、第一带通滤波器(212)和第一光电倍增管(215)，而波长大于575nm的透射光经过第二单边缘二向色分束器(204)分成红光和近红外两个光路，反射的红光进入同轴设置的第二透镜(207)、第二可调光阑(210)、第二带通滤波器(213)和第二光电倍增管(216)，而透射的近红外光经第二全反射镜(205)反射，进入同轴设置的第三透镜(208)、第三可调光阑(211)、第三带通滤波器(214)和第三光电倍增管(217)；所述的显微成像模块(3)：由第二物镜(301)、分光镜(302)、白光辅助照明光源(303)、第三全反射镜(304)，中性衰减滤光片(305)、镜筒(306)和CCD图像传感器(307)组成；其中：所述白光辅助照明光源(303)出射的水平光路上同轴地设有分光镜(302)，分光镜(302)的反射面与水平光路的夹角为45度，分光镜(302)的反射光路上设置有第二物镜(301)，第二物镜(301)的轴与镜筒(306)的轴垂直并相交，交点处设置有第三全反射镜(304)，第三全反射镜(304)与分光镜(302)平行且位于分光镜(302)的上方，第三全反射镜(304)的反射光路上同轴地设有中性衰减滤光片(305)、镜筒(306)和CCD图像传感器(307)；所述的信号采集与处理模块(4)：包括三通道数据采集卡和程序软件；其中：所述三通道数据采集卡的输入端与第一光电倍增管(215)、第二光电倍增管(216)、第三光电倍增管(217)的输出端并联连接；程序软件用于实现采集信号的数据处理、电泳谱图和CCD图像的显示与记录等功能；所述的微流控芯片检测平台(5)：被水平固定于三维移动平台(6)上，通过调节三维移动平台可以实现微流控芯片(8)与第一物镜(201)和第二物镜(301)的焦平面的相对位置的任意匹配。在上述技术措施中，所述固定波长激光器(101)为473nm、488nm、532nm激光器中的任意一种，所述固定波长激光器(102)为730nm、750nm、785nm激光器中的任意一种，且第一固定波长激光器(101)和第二固定波长激光器(102)与第一全反射镜(103)、二向色激光合束器(104)、扩束器(105)、多边缘二向色分束器(202)及荧光收集与探测模块(2)中的光学器件为对应匹配关系。在上述技术措施中，所述第一物镜(201)和第二物镜(301)为长工作距离平场消色差显微物镜。在上述技术措施中，所述检测区位于微流控芯片分离通道的中心轴上，且距离分离通道出口10～40mm的位置。在上述技术措施中，所述第一可调光阑(209)、第二可调光阑(210)和第三可调光阑(211)的孔径在50～500μm范围内可调，进一步优选为100～300μm。在上述技术措施中，所述第一光电倍增管(215)、第二光电倍增管(216)和第三光电倍增管(217)为带有光电传感、电流-电压放大、低通滤波等功能的小型侧窗光电倍增模块。在上述技术措施中，所述分光镜(302)的透反比为10/90。在上述技术措施中，所述显微成像模块(3)被固定于三维行走工作平台(7)上，通过调节三维行走工作平台和切换不同光源的开关，能够使第二物镜(301)的焦平面与微流控芯片通道内部或第一物镜(201)焦平面的相对位置的任意匹配，从而方便地实现正常显微观察和双激光聚焦光斑与检测区对准观察；在上述技术措施中，所述微流控芯片的材质可为石英、玻璃、PDMS等。本发明的优点：与现有技术相比，本发明具有：在微流控芯片上进行双激光诱导荧光多色检测，实现对单细胞内“不同吸光、不同荧光特性”或“不同激发、不同发射”荧光标记多种活性小分子的同时检测与定量分析；在微流控芯片上进行双激光聚焦光斑与检测区对准的成像与观察，便于提高检测的灵敏度和重复性；对微流控芯片内部诸如单细胞的流动状态进行正常显微观察等功能。解决了现有技术完成这些操作时，需要用到不同的仪器，除了这些仪器本身的不足外，这些仪器也难以同时定量测定单细胞内多种活性小分子。附图说明：图1是本发明的组成示意图；图2是本发明的光学光路结构原理图；图3是本发明实施例的装置应用示意图；图4是本发明实施例的同时检测单个元代小鼠肝细胞内H2O2，Cys和GSH的电泳图；图5是本发明实施例的同时定量测定100个元代小鼠肝细胞内H2O2，Cys和GSH含量的统计图。其中，1、激光激发模块，101、第一固定波长激光器，102、第二固定波长激光器，103、第一全反射镜，104、二向色激光合束器，106、扩束器，2、荧光收集与探测模块，201、第一物镜，202、多边缘二向色分束器，203、第一单边缘二向色分束器，204、第二单边缘二向色分束器，205、第二全反射镜，206、第一透镜，207、第二透镜，208、第三透镜，209、第一可调光阑，210、第二可调光阑，211、第三可调光阑，212、第一带通滤波器，213、第二带通滤波器，214、第三带通滤波器，215、第一光电倍增管，216、第二光电倍增管，217、第三光电倍增管，3、显微成像模块，301、第二物镜，302、分光镜，303、白光辅助照明光源，304、第三全反射镜，305、中性衰减滤光片，306、镜筒，307、CCD图像传感器，4、信号采集与处理模块，5、微流控芯片检测平台，6、三维移动平台，7、三维行走工作平台，8、微流控芯片。具体实施方式以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。参照图1，本发明一种用于单细胞电泳芯片的双激光诱导荧光多色检测器，由激光激发模块1、荧光收集与探测模块2、显微成像模块3、信号采集与处理模块4和微流控芯片检测平台5组成。其中，激光激发模块1、荧光收集与探测模块2和信号采集与处理模块4在一个暗箱内进行相应固定；显微成像模块3被固定于三维行走工作平台7上，通过调节三维行走的位置，能够使第二物镜301的焦平面与微流控芯片通道内部或第一物镜201焦平面的相对位置的任意匹配；微流控芯片检测平台5被水平固定于三维移动平台6上，通过调节三维移动平台可以使放置于微流控芯片检测平台5上的微流控芯片8实现与第一物镜201和第二物镜301的焦平面的相对位置的任意匹配。参照图2，本发明的光学光路结构及各个器件在图2中的设置顺序。本发明具有在微流控芯片上进行“双激光诱导荧光多色检测、正常显微观察和双激光聚焦光斑与检测区对准观察”的三种主要功能模式。其中：双激光诱导荧光多色检测：固定波长激光器101和固定波长激光器102分别为可见光区和近红外光区的固定波长激光器，二向色激光合束器104将固定波长激光器102出射的激光光束和经过第一全反射镜103反射的固定波长激光器101出射的激光光束在同一水平光路上合束，这个合束光束依次经过扩束器105的扩束整形和多边缘二向色分束器202的反射，被第一物镜201聚焦进入到微流控芯片分离通道的中心(该中心即为检测区)，形成一个双激光聚焦光斑，以激发经芯片电泳分离并流经检测区的被测样品(或组分)产生荧光；检测区发出的荧光经第一物镜201收集、多边缘二向色分束器202透过，被第一单边缘二向色分束器203分成两路，反射光(波长小于575nm的绿光)进入同轴设置的第一透镜206、第一可调光阑209、第一带通滤波器212，被第一光电倍增管215探测，而波长大于575nm的透射光经过第二单边缘二向色分束器204分成红光和近红外两个光路，反射的红光进入同轴设置的第二透镜207、第二可调光阑210、第二带通滤波器213，被第二光电倍增管216探测，而透射的近红外光经第二全反射镜205反射，进入同轴设置的第三透镜208、第三可调光阑211、第三带通滤波器214，被第三光电倍增管217探测；为了滤除检测区以外的杂散光并富集所检测的荧光，第一可调光阑209、第二可调光阑210和第三可调光阑211的孔径在50～500μm范围内可调，进一步优选为100～300μm；三个光电倍增管215，216，217输出的检测信号经过信号采集与处理模块4，最终由程序软件联合PC机实现荧光检测信号的数据处理、电泳谱图显示等功能。正常显微观察和双激光聚焦光斑与检测区对准观察：采用同一显微成像模块3，通过调节三维行走工作平台7和切换不同光源来实现。其中，开启白光辅助照明303，调节三维行走工作平台7使第二物镜301的焦平面处于微流控芯片通道内部，CCD图像传感器307将微流控芯片内部(如单细胞的流动状态)进行成像并送入PC机，实现正常显微观察，便于提高单细胞分析效率；与此相似，开启两种固定波长激光器101，102的电源，调节三维行走工作平台7使第二物镜301的焦平面和第一物镜201的焦平面重合于检测区，可以方便地实现双激光聚焦光斑与检测区对准的观察，便于双激光聚焦光斑与检测区对准的调节和提高检测的灵敏度、重复性。下面本发明公开一组实时测试的实施例。参照图3，利用本发明与微流控芯片、多路高压电源和PC机相结合，即可构成应用于单细胞内多种活性小分子同时定量测定的装置。应用时的操作流程为：微流控芯片放置于微流控芯片检测平台上，多路高压电源的电极与微流控芯片的液池对应连接；借助双激光聚焦光斑与检测区对准的观察模式，通过调节三维移动平台和三维行走工作平台，使双激光聚焦光斑与检测区对准；调节三维行走工作平台使显微成像模块及第二物镜的焦平面脱离检测区，即可进行单细胞进样、溶膜、电泳分离和胞内多组分小分子的双激光诱导荧光多色检测。考虑到已有在芯片上实现单细胞进样、溶膜及电泳分离操作的相关报道(Anal.Chem.,2016,88(1),930–936.)，本发明在此不作详述，也不推荐附图。参照图4和图5，应用本发明实施例的装置，结合荧光探针FS和Cy-3-NO2对元代小鼠肝细胞内的H2O2、Cys和GSH选择性标记(生成“不同激发、不同发射波长”的三种荧光标记产物)，测得单个元代小鼠肝细胞内H2O2，Cys和GSH同时检测的电泳图(图4)及100个元代小鼠肝细胞内H2O2，Cys和GSH含量的统计图(图5)。测试条件：单细胞进样，门式进样；λex为473nm和730nm，λem为525、755和805nm；电泳模式，区带电泳；电泳运行介质，100mMPBS缓冲溶液(pH7.4)。定性定量方法：保留时间定性，标准工作曲线法定量。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。