本发明涉及一种血细胞分析用试剂及其使用方法，更具体地讲，本发明涉及可以作为血细胞分析仪鞘流稀释剂使用的试剂及采用所述试剂的配制方法。
背景技术：
在20世纪50年代，美国的库尔特先生申请了粒子计数技术的发明专利，它是根据血细胞非传导性的特性，将悬浮在电解液中的颗粒随电解液通过小孔管时，取代相同体积的电解液，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比，该技术原理通常被称为库尔特原理。尽管各种新技术的出现极大推动了血细胞分析仪地快速发展，但各类仪器仍然采用库尔特原理作为血细胞计数和体积测量的基础来进行血细胞的计数和体积测定。发展到今天，血细胞分析已经成为临床检测中常规的检测项目，它可以对血液中的红细胞、白细胞、血小板和血红蛋白等参数进行检测和分析，大大提高了检验医师的工作效率。
本底计数作为仪器基本性能指标，对于能否获取到准确的检测结果有着重要的作用。同时仪器在每次开机前，都要求进行本底计数的检查，只有其数值在允许的范围内，才能在后续检测过程中输出可信的检测结果。仪器中存在众多的液体管路和阀门，当这些部件被污染，受到电磁波干扰或者没有良好的接地会出现干扰信号，导致本底计数不合格。使用的试剂中含有溶解氧气，它会随着储运时间的延长或者外界温度的变化释放出来，粘附在仪器管路中，进入仪器检测通道后会当做样本检测到，从而导致计数结果出现偏差。
国内专利CN1205436 公开了一种血液分析仪稀释液及其制备方法。该稀释液的原料含有NaCl、KCl、H3BO3、Na2B4O7.10H2O、EDTA-2Na、醋酸洗必泰等，具有一定的抑菌能力，生产工艺简单。
国内专利CN1834612公开了一种多功能稀释液及其制备方法。该稀释液包括乙二胺四乙酸盐,碱金属硫酸盐,碱金属氯化盐,磷酸盐缓冲液,碱金属的烷基硫酸盐,聚氧乙烯型非离子表面活性剂等组分。该稀释液能够使红细胞等体积球形化,仪器检测时不易受红细胞体积变化的影响,检测结果更准确可靠。
国内专利CN101451931B公开了一种血液稀释液。所述稀释液包括嘌呤类化合物、碱金属盐和缓冲剂等组分。该稀释液可以提供合适的电导和渗透压环境，保证在血液细胞分析仪检测时提供稀释及稳定细胞的作用，并且能够在室温条件下使未经处理的新鲜血液样本稳定放置2小时以上。
国内专利CN103323318A公开了一种血细胞分析仪稀释液。该稀释液包含碱金属氯化物、乙二胺四乙酸、吡啶鎓盐、pH缓冲剂调等组分。它解决了白细胞三分类不够准确问题。
国内专利CN103743616A公开一种血液分析仪用稀释液。该稀释液包括：氯化钠、硫酸钠、乙二胺四乙酸盐、氯化钾、咪唑、嘌呤类化合物等组分。该稀释液能保持全血样标本和预稀释样本中白细胞分类性以及MCV、以及血样物质的稳定性，同时当环境温度变化后血样的MCV值依然处于稳定的水平。
国内专利CN101021456公开了一种三分群血细胞分析仪用稀释液的生产方法，生产工艺的步骤包括纯净水制备、缓冲液的配制、溶解配制、定容配制、过滤灌装。选用氯化钠和硫酸钠为试剂的主要成分，降低了试剂的成本。该专利声称试剂中没有加入防腐剂，但在清洗包装中则加入了甲醛，这样不仅对操作人员的健康构成了威胁，而且甲醛作为防腐剂是公知。
国内专利CN1215168公开了一种不含氰化物离子的试剂组合物和一种用于测量血液样品中的血红蛋白浓度的方法。该试剂由至少一种季铵盐、吡啶鎓或其混合物的表面活性剂和一种能够把释放的血红蛋白转化为血色原的防氧化剂构成，其中的防氧化剂为抗坏血酸、亚磷酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠等或其混合物。
美国专利US 4322313 公开了一种多用途稀释液。该稀释液由碱金属盐、磷酸缓冲液、乙二胺四乙酸盐、氯化锂和苯氧乙醇等组成。它利用苯氧乙醇作为抗菌剂，氯化锂则起到稳定红细胞体积的作用。
美国专利US 4968629 公开了一种用于半自动血液分析仪中的稀释液。该稀释液由硫酸钠、磷酸缓冲体系等组成，pH在6.0~8.0范围内。该试剂在使用过程中不对白细胞的测量产生影响。
美国专利US5227304公开了一种包括等渗的稀释液和去垢剂组成的试剂系统。其中的稀释液由咪唑缓冲液、抗微生物剂、无机盐等组成。其中EDTA作为螯合剂，并增强了该稀释液的抗微生物能力，可以作为血细胞计数和大小分类的试剂应用。
上述公开的试剂可以为血液样本的检测提供适宜的pH和渗透压等环境，计数样本的红细胞、血小板数目。试剂的组成包括缓冲体系、碱金属盐等。但均没有涉及如何消除或者降低试剂中溶解氧气对仪器本底计数的影响，提高检测结果准确性的方法，以及试剂在储存和使用中随着时间延长导致气体透过包装材料进入到试剂中，随温度变化释放后形成气泡对仪器检测的影响。因此需要针对目前试剂中存在的问题，进行分析和研究，提出有效的解决方案。
技术实现要素：
在自然状态下，水中总会含有一定量的氧气，这是由于空气中的氧气在水中有一定的溶解性。通常在1大气压下，0℃的水中，溶解氧为6.95mg／L；在20℃的水中溶解氧含量为4.34 mg／L，随着温度的升高，它在水中的溶解度逐渐降低，比如当水的温度升高到80℃，溶解氧的含量则降低为1.4 mg／L。这种变化规律遵从亨利定律(Henry's law),该定律的表述为：“在等温等压下，某种挥发性溶质（一般为气体）在溶液中的溶解度与液面上该溶质的平衡压力成正比。”其公式为
Pg=Hx
式中：H为Henry常数，x为气体摩尔分数溶解度，Pg为气体的分压。H能够很好的表示气体的溶解量，它适用于溶解度很小的体系。在这个意义上，Henry常数只是温度的函数，与压力无关。
鞘流稀释剂在血细胞分析仪的正常和准确运行中起着重要的作用。一方面，鞘流稀释液为检测样本提供了适宜的pH、电导率和渗透压，保证细胞的形态完整，不发生溶血作用；一方面需要对上次检测样本残留的物质进行清洗，保证采样针、管路和流动室的清洁，防止交叉污染；再一方面仪器暂时停止运行期间稀释剂要充盈在管路中间，防止外界灰尘等异物进入仪器，造成故障。
鞘流稀释剂所使用的水为纯化水，它经过了多重处理后，有效去除水中的杂质、有机物、重金属、降低水的硬度。在水介质中，加入碱金属盐、螯合剂、缓冲剂并调节体系的pH在中性，可以得到用于血细胞分析仪用的稀释剂。但这种试剂体系在使用中存在着重大的不足：1）生产鞘流稀释液的过程是将物料和纯净水按一定比例放入反应釜中，通过搅拌的方式将加入的物料全部溶解，氧气在搅拌器的扰动下会和稀释液长时间接触，增加了试剂中溶解氧含量；在鞘流稀释液的检测指标中也更多关注pH、渗透压和电导率，而没有同时检测溶氧含量。2）由于仪器的使用地点分散在全国各地，试剂需要从生产厂家运输过去，而各地的温度有较大差异，导致运输过程中溶解氧在稀释剂中缓慢增加，同时试剂的包装材料也未能有效阻止氧气的透过，导致试剂在长时间储运中溶解氧增加，最终表现为稀释剂在仪器上的本底计数升高，不能提供准确的检测结果。3）在仪器使用过程中，充盈在内部管路中的稀释剂在仪器停机期间并没有被排空，而是持续灌充在管路中。随着时间的延长环境中的氧气会透过管路进入稀释液中，然后随着温度的变化溶解氧会逐渐释放出来形成微小气泡，聚集在仪器管路内壁，这种微小气泡会导致仪器的本底计数不达标，也会影响检测结果计数准确性。
本发明正是为了满足临床检验的需求，降低鞘流稀释液中溶解氧含量，防止试剂在储运和外界温度变化时氧气透过包装材料进入试剂中又缓慢析出，形成微小气泡，进入仪器内部影响本底计数和样本检测计数结果的准确性而开发的试剂。该试剂在血液细胞分析仪中为检测样本提供合适的电导和渗透压环境，保证在血液细胞分析仪检测时提供稀释剂稳定细胞的作用，同时作为载体将检测样本导入仪器中，计数红细胞、白细胞和血小板的数值。
本发明人在反复的实验中发现，通过加入具有还原能力的碱金属盐，可以有效地降低稀释剂中的溶解氧含量，消除鞘流稀释液由于长时间储运而增加的溶氧量的增加，同时彻底消除透过仪器管路进入的透过氧，从而保证仪器的良好运行状态。该反应的原理是具有还原能力的碱金属盐和水中的溶解氧发生氧化还原反应，消耗水中的溶解氧，同时该盐的还原能力消失生成水溶性碱金属盐。
所述的具有还原能力的碱金属盐包括包括亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、低亚硫酸钠、连二亚硫酸钠、连二亚硫酸钾、焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钠、亚硫酸钾化合物及其组合。较优的方案是采用亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸钠、亚硫酸钾；更优的方案是采用亚硫酸钠、亚硫酸钾。
根据上述反应原理通过理论计算得知，除去鞘流稀释液中1mg/L的溶解氧，需要8mg/L的亚硫酸碱金属盐。而常用的亚硫酸碱金属盐含有7个分子的结晶水，那么除去1mg/L的溶解氧理论上需要16mg/L的亚硫酸碱金属盐。亚硫酸碱金属盐的加入量越多，试剂中过剩量越多，除氧的百分率越高，当加入量达到一定值后。随着亚硫酸碱金属盐加入量的增加，除氧百分率则不再上升。实验发现当亚硫酸碱金属盐的量稍微过量，可以起到良好的去除溶解氧效果。
在常温下单纯加入亚硫酸碱金属盐，其除氧百分率最大可以达到94%。温度对加亚硫酸碱金属盐去除溶解氧效果是很重要的影响因素。在相同的亚硫酸碱金属盐加入量下，水温越高，去除溶解氧的效果越好；在相同的去除溶解氧效果下，水温越高，则需要的亚硫酸碱金属盐的量越少。当水温升高到40℃时，基本可以将溶解氧的含量降为0mg/L。
pH对去除鞘流稀释液中溶解氧的影响是随着pH值升高，加入相同量亚硫酸碱金属盐的除氧能力会降低。但在酸性及碱性pH范围内，各出现一个除氧百分率的最大值。
亚硫酸钠碱金属盐与水中的溶解氧的反应速度很快，加入亚硫酸钠碱金属盐约3min后即可达到反应的平衡点，此时再延长反应时间并不能增加除氧百分率。
另外一个影响因素是试剂离子强度。当温度、压力一定时，水中含盐量增加，会使气体在水中的溶解度降低。这是因为随着盐度的增加，离子对水的电缩作用（指离子吸收极性水分子，是水分子在其周围形成紧密排布的水合层的现象）加强，使水可溶解气体的空隙减少。
本发明鞘流稀释液的第一组分为具有还原能力的碱金属盐，包括亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、低亚硫酸钠、连二亚硫酸钠、连二亚硫酸钾、焦亚硫酸钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钠、亚硫酸钾化合物及其组合；该试剂的第二种组分为无机碱金属盐，包括硫酸钠、硫酸钾、氯化钠、氯化钾及其组合；该试剂的第三种组分为缓冲液，包括磷酸盐缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液等。
通过在本发明中加入适量的具有还原能力的碱金属盐，一方面消耗了试剂中的溶解氧，同时该碱金属盐的还原能力消失，生成水溶性的金属盐，从而可以降低氯化钠、硫酸钠等用于调节试剂电导率和渗透压等参数的金属盐加入量。
本发明另一方面提供了该试剂的生产方法。为了彻底将物料溶解，一般通过长时间的搅拌达到目的，但这个过程会导致环境中氧气在试剂中溶解量的增加。本发明人通过多次实验发现，采用先配制缓冲溶液并将其pH调节到一定范围内，然后加入需要量的碱金属盐调节试剂的离子强度，最后将计算量的还原性碱金属盐加入搅拌使其彻底溶解，检测合格后过滤灌装的生产方法，可以达到既有效降低试剂中溶解氧的含量，保证产品的质量；又减少试剂生产过程中能源的消耗。
本发明的有益效果：通过在鞘流稀释液中加入具有还原能力的碱金属盐，可以有效地降低试剂中溶解氧含量，消除鞘流稀释液在生产环节和储运环节形成的溶解氧析出形成微小气泡进入仪器内部管路，影响仪器计数准确性；消除仪器在停机过程中环境氧气透过仪器管路进入试剂中的溶解氧，在仪器运行中缓慢析出而影响仪器计数结果。同时，采用先配制缓冲溶液再溶解碱金属盐，最后加入还原性碱金属盐搅拌溶解的生产方式，可以达到既有效降低试剂中溶解氧的含量，保证产品的质量；又减少试剂生产过程中能源的消耗的目的。
本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点，在参考本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。
附图说明：
图1是不同还原性碱金属盐的消除溶解氧能力比较图。
具体实施方式
定义
除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。
本文中使用的术语“碱金属”是指在元素周期表中同属一族的金属元素，包括钠和钾，它们有很多相似的化学性质。
本文中使用的术语“还原能力”是指在化学反应中原子、分子或离子失去电子的能力。失电子能力越强的粒子所属的元素还原性就越强；反之越弱，而其非还原性就越强。还原性是相对于氧化性来说的。具有还原能力的物质容易被氧化。
本文中使用的术语“本底计数”是指用稀释液作为样本在血细胞分析仪上连续进行三次测试，取三次测试结果中的最大值作为本底计数的值。此数值越低，表明仪器的本底计数越低，最好为零，即没有读数值。
本发明的血细胞分析试剂
本发明所公开的试剂在血液细胞分析仪中为检测样本提供合适的电导和渗透压环境，保证在血液细胞分析仪检测时提供稀释剂稳定细胞的作用，同时作为载体将检测样本导入仪器中，计数红细胞、白细胞和血小板的数值。
无机碱金属盐
本发明中的无机碱金属盐包括碱金属硫酸盐和碱金属氯化盐的组合。这些碱金属盐能够提高溶液的导电性，保持试剂的等渗透压，并维持电化学的平衡。它们的存在可以溶解样本中的异常蛋白质，阻止它们沉积在管路上，起到清洁仪器管路的作用。优选的碱金属盐包括硫酸钠、硫酸钾、氯化钠和氯化钾，更优选的是硫酸钠和氯化钠。
缓冲剂
本发明所使用的缓冲剂为血液检测样本提供适宜的pH值，包括磷酸盐缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液等。优选的pH范围是4.5至8.5，更优选的是5.5至8.0，最优选的是6.5至7.5，也即在中性范围内。
实施例
以下所提供的实施例仅用于对本发明作出进一步的举例说明，而无意于对说明书作出任何限定。
除非另有声明，否则以下实施例中所用的血液细胞检测设备均为加斯戴克医疗器械有限公司生产的流式细胞分析仪。
实施例1 还原性碱金属盐对纯净水中溶解氧的消耗
取一个洁净的烧杯，用量筒准确量取1L纯净水倒入其中，放在磁力搅拌器上，调节转速为200r/min，并安装好校准后的溶解氧测定仪。分别加入1.0g准确称量的还原性碱金属盐，检测反应不同时间后液体中溶解氧的变化情况。结果如附图1所示(其中溶解氧的含量为mg/L)。
观察各还原性碱金属盐对溶解氧的消耗数据可以发现，各个还原性碱金属盐都可以在一定的时间内将水中的溶解氧消耗完全，并维持在该水平。没有出现随着搅拌时间的延长，环境氧气重新溶解在试剂中导致含氧量上升的情况。
实施例2 不同储运时间试剂的溶解氧变化
按如下物料比例配制鞘流稀释液：
磷酸盐缓冲液 0.05M
氯化钠 5.0g
无水硫酸钠 7.0g
无水亚硫酸钠 1.0g
补水到 1L
pH 6.9
溶解氧含量 0.44mg/L
比对实施例 1
磷酸盐缓冲液 0.05M
氯化钠 5.0g
无水硫酸钠 8.0g
补水到 1L
pH 6.9
溶解氧含量 6.05mg/L
将配制好的试剂精密过滤后灌装到塑料软包中，将其放入外包装中后封装，并做好对应的标记。产品分成两个相同部分储存于试剂仓库。第一部分静置于仓库中，第二部分则每间隔3个月在模拟运输实验台上以100r/min的转速往复震荡10个小时，用于模拟试剂产品的运输情况。经过6个月、9个月、12个月、15个月之后分别将两批试剂开封取出，检测试剂中含氧量的变化,测试三次，取结果的平均值。数据如下表1所示。
从上表数据可以看出，含有还原性碱金属盐的试剂静置放置在仓库中，经过15个月的时间后，其中的溶解氧含量维持在0.48mg/L的水平没有增加。经过间隔3个月震荡一次的试剂，其中的溶解氧含量略微有增加。而不含有还原性碱金属盐的试剂由于含氧量属于饱和状态，所以不管是静置放置不同时间还是通过间隔震荡的方式含氧量没有明显的变化，维持在6mg/L的水平。
实施例3 不同试剂对仪器本底检查的影响
将实施例2和对比实施例中制备的鞘流稀释液分别引导到加斯戴克医疗器械有限公司生产的流式细胞仪分析仪中，进行本底计数；然后关闭仪器24H后观察仪器管路中是否有微小气泡析出，并进行本底计数。结果如下表2所示。
经过观察发现，采用实施例2制备的试剂在仪器上进行本底测试，结果均为0，同时仪器在关闭24H 后的管路中没有发现微小气泡出现，可以保证检测计数结果的准确性。而采用对比试剂的本底检测结果中白细胞（WBC）数值为0.1´109 / L，血小板(PLT )数值为6´109 / L；待机24H后的检测结果为WBC 0.1´109 / L,PLT为8´109 / L，且在仪器的管路上能看到稀疏的微小气泡存在，通过多次冲洗之后才可将气泡驱赶掉，这样不仅增加了试剂的消耗，提高检测成本，而且对计数结果准确性产生了影响。
实施例4 不同生产方式降低试剂中溶解氧效果比较
采用如下生产流程配制试剂：
（1）在反应釜中加入规定量的纯化水，启动搅拌设备，加入称量好的缓冲液物料并搅拌反应至全部溶解，调节试剂的pH为6.0~6.5；
（2）加入需要量的氯化钠和硫酸钠到试剂中搅拌并全部溶解，用于调节试剂的离子强度；
（3）将计算量的还原性碱金属盐加入搅拌使其彻底溶解，用于消耗试剂中的溶解氧；
（4）调节试剂的pH 到7.0检测试剂的溶解氧含量和理化参数，然后过滤灌装。
采用该生产工艺首先制备pH为偏酸性的缓冲溶液，然后加入需要量的氯化钠和硫酸钠，增加试剂的离子强度，一方面可为还原性碱金属盐消耗溶解氧提供适宜的反应环境，一方面降低环境氧气在试剂中的溶解度，提高使用效果。最后加入还原性碱金属盐，可以达到既有效降低试剂中溶解氧的含量，保证产品的质量；又减少试剂生产过程中能源的消耗的目的。
对比实施例2,3
已通过上述各实施方案和具体实施例对本发明作出说明，但本领域技术人员会理解，在不偏离本发明宗旨和范围的情况下，可对本发明作出各种修改、变更和替换。