一种测定乳中钙含量的方法、测定试剂和试剂盒与流程

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种测定乳中钙含量的方法、测定试剂和试剂盒。
背景技术：
：为了准确地衡量乳制品中钙离子的含量，需要检测乳制品，如生乳、牛奶半成品、牛奶成品中的钙离子含量。目前常见的检测方法有国标gb541321-2010《食品安全国家标准-婴幼儿食品和乳品中钙、铁、锌、钠、钾、镁、铜和锰的测定》以及分光光度检测法。但是上述常见的检测方法往往操作步骤十分繁琐，需要花费很多的时间，且需要大型仪器和用到乙炔等较危险气体，对于操作要求比较高。此外，已知在碱性条件下，样品中的钙与偶氮胂ⅲ(式ⅰ)作用生成蓝紫色络合物(式ⅱ)，其颜色深浅与钙离子的浓度成正比。通过在650nm波长处测定蓝色复合物的吸光度的变化值，与经过同样处理的钙校准液进行比较，即可计算出样品中钙离子的含量。但是由于乳的成分远远复杂于血液，并且乳中的一些钙处于与牛乳蛋白结合的状态，因此现有技术中的检测方法难以将待测乳中结合态的钙释放出来，从而导致检测结果与实际情况相比误差很大。上述这些不足，尤其是获得检测结果需要过长的时间的不足，直接制约了检测乳制品中钙离子含量的方法的实际应用。因此亟待获得快速、简便、可靠、准确地检测乳中钙含量的方法。技术实现要素：本发明要解决的技术问题就是针对现有的乳中钙含量的检测方法获得检测结果需要过长的时间、误差大、操作复杂、稳定性差的不足，提供一种测定乳中钙含量的方法、测定试剂和试剂盒。所述的方法和所述的测定试剂能够快速、可靠、准确地检测乳中钙的含量。此外，所述的检测方法精密度高、重复性好、稳定性高，并且节约时间。所述的试剂盒快速、操作简便、准确稳定，能够广泛用于乳制品行业对乳中钙含量的检测中。由于在乳中直接使钙与偶氮胂ⅲ作用生成蓝色复合物再来测定钙含量的效果十分不理想，准确性很低。发明人针对该问题在乳本身特征的基础上，创造性地设置了适于乳的稀释液和测定试剂的配方组分，并进一步根据乳的特质调整了测定乳中钙含量的计算方法。其中，所述稀释液是针对乳乃至乳制品的预处理而特殊选择，能够使乳和乳制品中的钙更好地释放。所述测定试剂与所述稀释液相互配合，使测定结果更为准确可靠。本发明的技术方案之一是一种测定乳中钙含量的方法，其包括以下的步骤：(1)将乳与稀释液混合，得样品乳；所述稀释液为以下的组分：0.5～2％盐酸和0.01～1.0％tritonx-100；或者，为以下的组分：0.5～3％氢氧化钠，所述百分比为质量百分比；(2)将步骤(1)所得的样品乳、水和钙校准品分别与上述的测定试剂混合后反应，分别得到样品溶液、空白溶液和校准溶液；所述测定试剂为以 下的组分：100～200μmol/l偶氮胂ⅲ、25～70mmol/l哌嗪-1,4-二乙磺酸和0.05～2％tritonx-100，所述百分比为质量百分比；(3)测定步骤(2)所得的样品溶液、空白溶液和校准溶液在650nm波长处的吸光度值，计算步骤(1)所述乳中钙含量。步骤(1)为：将乳与稀释液混合，得样品乳；所述稀释液为以下的组分：0.5～2％盐酸和0.01～1.0％tritonx-100；或者，为以下的组分：0.5～3％氢氧化钠，所述百分比为质量百分比。其中，所述的稀释液中，所述盐酸的含量为0.5～2％，较佳地为0.5～1％，更佳地为0.8％，所述百分比为质量百分比。所述tritonx-100的含量为0.01～1.0％，较佳地为0.02～0.5％，更佳地为0.02％，所述百分比为质量百分比。或者，本发明所述的稀释液中，所述氢氧化钠的含量为0.5～3％，较佳地为0.5％，所述百分比为质量百分比。所述混合时所述乳和所述稀释液的体积比为本领域常规的体积比，较佳地为1∶8～1∶10，更佳地为1∶9。步骤(2)为：将步骤(1)所得的样品乳、水和钙校准品分别与上述的测定试剂混合后反应，分别得到样品溶液、空白溶液和校准溶液；所述测定试剂为以下的组分：100～200μmol/l偶氮胂ⅲ、25～70mmol/l哌嗪-1,4-二乙磺酸和0.05～2％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。其中，所述测定试剂中，所述偶氮胂ⅲ的含量为100～200μmol/l，较佳地为150～200μmol/l，更佳地为150μmol/l。所述哌嗪-1,4-二乙磺酸(pipes)的含量为25～70mmol/l，较佳地为25～50mmol/l，更佳地为50mmol/l。所述tritonx-100的含量为0.05～2％，较佳地为0.05～0.1％，更佳地为0.1％，所述百分比为质量百分比。所述反应的时间为本领域常规的时间，较佳地为4～6分钟，更佳地为5分钟。所述反应的温度为本领域常规的温度，较佳地为36～38℃，更佳地为37℃。所述反应的方式为本领域常规的方式，较佳地为水浴。所述样品乳、水和钙校准品分别与上述的测定试剂混合的体积比为本领域常规的体积比，较佳地为1∶99～1∶101，更佳地为1∶100。所述水为本领域常规的水，较佳地为蒸馏水，更佳地为去离子水。步骤(3)为：测定步骤(2)所得的样品溶液、空白溶液和校准溶液在650nm波长处的吸光度值，计算步骤(1)所述乳中钙含量。其中，所述计算的方法为本领域常规的计算方法，能够计算出步骤(2)所得的样品溶液中钙含量即可，较佳地，按照以下的公式进行计算：ca(mg/100ml)＝钙校准品浓度×(a样品溶液-a空白溶液)/(a校准溶液-a空白溶液)×稀释倍数，其中，a样品溶液为所述样品溶液的a值；a空白溶液为所述空白溶液的a值；a校准溶液为所述校准溶液的a值；a值指吸光度；所述钙校准品浓度指钙元素占所述钙校准品的质量体积百分比，通常指每100ml所述钙校准品中钙的质量(mg)。所述稀释倍数指所述样品乳用所述稀释液稀释的稀释倍数。如所述乳和所述稀释液的体积比1:9，则所述稀释倍数为10。本发明的一个较佳实例为：所述的方法中，所述稀释液为0.5％氢氧化钠；且所述测定试剂为150μmol/l偶氮胂ⅲ、50mmol/l哌嗪-1,4-二乙磺酸和0.1％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。本发明的一个较佳实例为：所述的方法中，所述稀释液为2％盐酸和0.5％tritonx-100；且所述测定试剂为150μmol/l偶氮胂ⅲ、50mmol/l哌嗪-1,4-二乙磺酸和0.1％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。本发明的一个较佳实例为：所述的方法中，所述稀释液为0.8％盐酸和0.02％tritonx-100；且所述测定试剂为150μmol/l偶氮胂ⅲ、50mmol/l哌嗪-1,4-二乙磺酸和0.1％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。本发明还提供了所述的方法中，所述稀释液和所述测定试剂的制备方法，其包括以下步骤：将盐酸和tritonx-100加入水中混合；或者，将氢氧化钠溶解于水中混合，即得所述稀释液；将偶氮胂ⅲ、哌嗪-1,4-二乙磺酸和tritonx-100加入水中混合，即得所述测定试剂。本发明所述稀释液的形态为本领域常规的形态，较佳地为无色透明澄清液体。本发明所述测定试剂的形态为本领域常规的形态，较佳地为紫色透明澄清液体。本发明所述乳为本领域常规的乳，其包括生乳和经过加工的处理乳。所述处理乳为本领域常规的处理乳，较佳地包括半成品乳和成品乳，更佳地包括杀菌乳、酸乳、灭菌乳、乳粉、干酪、发酵乳、乳清和复原乳。所述乳的来源为本领域常规的来源，较佳地包括人、牛、羊、马、驴和骆驼，更佳地为牛。本发明所述的方法所使用的仪器是本领域常规的仪器，较佳地为分光光度仪，更佳地为varioskanflash全波长扫描式多功能读数仪，购自thermoscientific。较佳地，所述的方法是以非疾病诊断或治疗目的的方法。本发明提供的技术方案之二是一种测定乳中钙含量的测定试剂，其包括以下的组分：100～200μmol/l偶氮胂ⅲ、25～70mmol/l哌嗪-1,4-二乙磺酸和0.05～2％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。较佳地，所述的测定试剂为150μmol/l偶氮胂ⅲ、50mmol/l哌嗪-1,4-二乙磺酸和0.1％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。本发明提供的技术方案之三是一种测定乳中钙含量的试剂盒，其包括上述的测定试剂和上述的稀释液。所述稀释液为以下的组分：0.5～2.0％盐酸和0.01～1.0％tritonx-100；或者，所述稀释液为以下的组分：0.5～3.0％氢氧化钠，所述百分比为质量百分比。较佳地，所述稀释液为0.5％氢氧化钠；或者，所述稀释液为0.5～1％盐酸和0.02～0.5％tritonx-100，或者，所述稀释液为0.8％盐酸和0.02％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。本发明中，较佳地，所述的试剂盒还包括钙校准品。所述的钙校准品为本领域常规使用的钙校准品。所述的钙校准品浓度为本领域常规的浓度，较佳地为8～12％，所述百分比为钙占所述钙校准品的质量体积百分比。本发明中，较佳地，所述的试剂盒还包括水。所述水为本领域常规的水，较佳地为蒸馏水，更佳地为去离子水。本发明所述的试剂盒操作简便，能够高效、准确地特异性检测乳中钙含 量。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明提供一种测定乳中钙含量的检测试剂、方法和试剂盒。所述的检测试剂能够准确、可靠地检测乳中的钙含量。所述的方法能够将乳中结合态的钙释放出来，从而能够可靠、准确地检测乳中钙的含量。具体地，使用所述的方法对生乳样品、半成品牛奶样品和成品牛奶样品进行检测的结果的偏差均<10％，符合国标允许的偏差要求。其中生乳样品不同方法间的偏差≤5％的符合率达到60％、牛奶半成品样品符合率达到100％、牛奶成品样品符合率达到73.3％。此外，所述的方法精密度高，对生乳样品、半成品牛奶样品和成品牛奶样品进行检测的结果的相对标准偏差均小于5％；稳定性好，不同时间检测同一批样品cv值小于5％，符合要求；速度快，单个样品进行检测仅需8分钟，大批量检测还能进一步缩短3-5分钟。所述的试剂盒操作简便、准确可靠，能够广泛用于乳制品行业对乳中钙含量的检测中。附图说明图1为不同检测方法检测生乳样品的正态性检验图。其中，均值为-3.42、标准差为4.595、n为30、a为0.351、p值为0.446。图2为不同检测方法检测半成品牛奶样品的正态性检验图。其中，均值为-0.925、标准差为2.249、n为4、a为0.286、p值为0.404。图3为不同检测方法检测成品牛奶样品的正态性检验图。3a为原子吸收分光光度计1检测检测成品牛奶样品的正态性检验图。其中，均值为-4.86、标准差为2.240、n为15、a为0.356、p值为0.410。3b为原子吸收分光光度计2检测检测成品牛奶样品的正态性检验图。其中，均值为3.92、标准差为1.666、n为10、a为0.482、p值为0.177。原子吸收分光光度计1，2为 两台相同型号的原子吸收分光光度计。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中，所述生乳样品购自蒙牛集团分析测定中心。所述半成品牛奶样品购自蒙牛集团分析测定中心。所述成品牛奶样品购自蒙牛集团分析测定中心。所述钙校准品的浓度为10％，所述百分比为钙占所述钙校准品的质量体积百分比。所述分光光度仪为varioskanflash全波长扫描式多功能读数仪，购自thermoscientific。国标法，又称原吸法：参见国标gb541321-2010《食品安全国家标准-婴幼儿食品和乳品中钙、铁、锌、钠、钾、镁、铜和锰的测定》中有关钙的测定的相关内容。国标法所用的原子吸收分光光度计为z-2000原子吸收分光光度计，购自日本hitachi公司。若无特别说明，实施例中各检测方法测得的结果的单位均为mg/100ml。实施例1不同稀释液的比对采用分光光度检测法进行检测：(1)、样品稀释：取样品与稀释液加入到ep管中，震荡混匀，得样品乳。(2)、将步骤(1)所得的样品乳、水和钙校准品分别与测定试剂震荡混匀后于37℃水浴反应5min，分别得到样品溶液、空白溶液和校准溶液。测定试剂为以下的组分：150μmol/l偶氮胂ⅲ、50mmol/l哌嗪-1,4-二乙磺酸和0.1％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。具体的混合比例如表1所示：表1样品溶液、空白溶液和校准溶液编号试验管名称试剂名称组分1空白溶液管空白溶液1000μl测定试剂和10μl去离子水2校准溶液管校准溶液1000μl测定试剂和10μl校准品3样品溶液管样品溶液1000μl测定试剂和10μl样品乳(3)、测定步骤(2)所得的样品溶液、空白溶液和校准溶液在650nm波长处的吸光度值。分别吸取200μl空白溶液管、校准溶液管和样品溶液管中的液体至对应的微孔杯中，并将微孔杯放置于分光光度仪卡槽中，顺序如表2所示，运行lb程序进行检测并读数。根据吸光度读数计算所述待测乳中钙含量。该计算按照以下的公式进行：ca(mg/100ml)＝钙校准品浓度×(a样品溶液-a空白溶液)/(a校准溶液-a空白溶液)×稀释倍数。其中，a样品溶液为所述样品溶液的a值；a空白溶液为所述空白溶液的a值；a校准溶液为所述校准溶液的a值；a值指吸光度；所述钙校准品浓度指钙占所述钙校准品的质量体积百分比；所述稀释倍数为10。表2检测顺序编号试验管名称对应检测孔1空白溶液管第一孔2校准溶液管第二孔3样品溶液管第三孔或第四孔a、采用分光光度检测法进行检测步骤(1’)为将100μl生乳样品分别与900μl稀释液1或900μl稀释液2在ep管中混合，得待测样品1和待测样品2。其中，稀释液1为以下的组分：0.5％氢氧化钠，所述百分比为质量百分比。稀释液2为以下的组分：2％盐酸和0.5％tritonx-100，所述百分比为质 量百分比。步骤(1’)完成后按照上述分光光度检测法的步骤(2)、(3)对步骤(1’)所得的待测样品1和待测样品2的钙含量进行检测。b、使用国标法进行检测按照上述国标法对生乳样品中的钙含量进行检测，分别采用两台相同型号的原子吸收分光光度计进行检测，结果分别表3和表4所示。表3分光光度检测法与国标法检测的结果比对其中，偏差的含义是使用本发明的分光光度检测法的测定值与国标法的测定值的差值和国标法的测定值的比值；从表3结果可知选择氢氧化钠为稀释液(稀释液1)与国标法的检测结果进行比较，偏差≤5％的符合率为85％，偏差＜10％的符合率达到100％。选择盐酸和tx-100为稀释液(稀释液2)与国标法的检测结果进行比较，偏差≤5％的符合率达到100％。表4分光光度检测法与国标法检测的结果比对从表4结果可知，选择氢氧化钠为稀释液(稀释液1)与国标法的检测结果进行比较，偏差≤5％的符合率为40％，偏差＜10％的符合率达到95％；选择盐酸和tx-100为稀释液(稀释液2)与国标法的检测结果进行比较，偏差≤5％的符合率达到70％，偏差＜10％的符合率达到100％。综合上述结果可知，盐酸和tx-100为稀释液(稀释液2)作为稀释液偏差均小于10％，因此选择稀释液2作为稀释液检测样品中钙含量相对于稀释液1效果更好，结果更为准确。实施例2不同样品的比对随机选取30个不同批次的生乳样品、4个不同批次的半成品牛奶样品和25个不同批次的成品牛奶样品作为样品。采用分光光度检测法进行检测：步骤(1a)为将100μl样品与900μl稀释液3在ep管中混合，得待测样品。其中，其中，步骤(1a)中稀释液3为以下的组分：0.8％盐酸和0.02％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。步骤(1a)完成后按照实施例1所述的分光光度检测法的步骤(2)、(3) 对步骤(1a)所得的待测样品的钙含量进行检测。同时按照上述国标法对样品进行检测。结果分别如表5～7和图1～3所示。表5不同检测方法检测生乳样品的比对结果其中，“/”的含义为没有测平行值。表5说明，本发明的分光光度检测法的测定结果与国标法比较，偏差≤5％的符合率为60％，偏差<10％的符合率为100％。计算上述平行样品的cv值可知，国标法的cv值在0.6-3.9之间，本发明的分光光度检测法cv值在0-2.8之间。通过对表5数据进行正态性检验分析可知(参见图1)，a＝0.351，小于95％置信区间的临界值0.725，可见系统服从正态分布，数据处于统计受控状态。表6不同检测方法检测成品牛奶样品的比对结果表6说明，本发明的分光光度检测法的测定结果与国标法比较，偏差≤5％的符合率达到100％。计算上述平行样品的cv值可知，国标法的cv值在0.5-2.1之间，本发明的分光光度检测法的cv值在0-2.8之间。通过对表6数据进行正态性检验分析可知(参见图2)，a＝0.286，小于95％置信区间的临界值0.725，可见系统服从正态分布，数据处于统计受控状态。表7不同检测方法检测半成品牛奶样品的比对结果表7说明，本发明的分光光度检测法的测定结果与国标法比较，偏差≤5％的符合率达到73.3％，偏差<10％的符合率达到100％。计算上述两种方法 的平行样品的cv值可知，国标法的cv值在0.4-4.9之间，本发明的分光光度检测法的cv值在0.7-2.8之间，可知本发明的分光光度检测法的检测结果稳定性较好。过对表7数据进行正态性检验分析可知(参见图3a、图3b)，ad值分别为0.356和0.482，小于95％置信区间的临界值0.725，可见系统服从正态分布，数据处于统计受控状态。实施例3精密度实验随机选取实施例2中的任意的1个生乳样品、1个半成品牛奶样品和1个成品牛奶样品分别作为样品。采用分光光度检测法进行检测：步骤(1b)为将100μl样品与900μl稀释液3在ep管中混合，得待测样品。其中，其中，步骤(1b)中稀释液3为以下的组分：0.8％盐酸和0.02％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。步骤(1b)完成后按照实施例1所述的分光光度检测法的步骤(2)、(3)对步骤(1b)所得的待测样品的钙含量进行检测。为了进行精密度实验，将上述每种样品各做20次重复的平行实验。检测结果如表8所示。表8的结果说明，本发明的分光光度检测法检测生乳样品的相对标准偏差为2.0％、检测半成品牛奶样品的相对标准偏差为1.4％、检测成品牛奶样品的相对标准偏差为1.4％，偏差均小于2.0％，而国标法的标准偏差为5％，可见本发明的分光光度法效果优于国标法，完全胜任对乳中钙的测定。说明本发明的分光光度检测法检测生乳、半成品牛奶和成品牛奶的精密度均满足要求。表8精密度实验的结果实施例4稳定性实验随机选取实施例2中的任意的1个成品牛奶样品(样品a)和购自内蒙古蒙牛乳业的特仑苏牛奶(样品b)作为样品。采用分光光度检测法进行检测：步骤(1c)为将100μl样品与900μl稀释液4在ep管中混合，得待测样品。其中，步骤(1c)中稀释液4为以下的组分：2％盐酸和0.5％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。步骤(1c)完成后按照实施例1所述的分光光度检测法的步骤(2)、(3)对步骤(1c)所得的待测样品的钙含量进行检测。同时按照上述国标法对样品进行检测。为了进行稳定性实验，分别在不同的日期进行检测。结果如表9所示。表9稳定性实验的结果其中，“/”的含义为没有数据。表9说明，对样品a，国标法的检测结果的cv值为3.7％，本发明的分光光度检测法的检测结果的cv值为1.7％；对样品b，国标法的检测结果的cv值为5.0％，本发明的分光光度检测法的检测结果的cv值为1.6％。可见本发明的分光光度检测法的稳定性优于国标法，且这两种检测方法均满足稳定性的要求。此外，采用国标法对样品b进行检测，发现2016年1月11日的检测结果与2016年1月12日和2016年1月13日的检测结果偏差较大。即使这些较大的偏差在10％以下，仍视为对稳定性有一定的不利影响。综合上述的实施例的结果可知，当稀释液为以下的组分：2％盐酸和0.5％tritonx-100，所述百分比为质量百分比时，该稀释液为分光光度检测法检测乳中钙含量的最优稀释液。使用改进的分光光度检测法对生乳样品、半成品牛奶样品和成品牛奶样品进行检测的结果的偏差均<10％，符合国标允许的偏差要求。其中生乳样品不同方法间的偏差≤5％的符合率达到60％、牛奶半成品样品符合率达到100％、牛奶成品样品符合率达到73.3％。此外，改进的分光光度检测法精密度高，对生乳样品、半成品牛奶样品和成品牛奶样品进行检测的结果的相对标准偏差均小于5％；改进的分光光度检测法稳定性好，不同时间检测同一批样品cv值小于5％，符合要求。实施例5采用分光光度检测法进行检测：稀释液为以下的组分：3％氢氧化钠，所述百分比为质量百分比。测定试剂为以下的组分：100μmol/l偶氮胂ⅲ、25mmol/l哌嗪-1,4-二乙磺酸和0.05％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。其余步骤和条件均与实施例1中“a、采用分光光度检测法进行检测”中的步骤和条件完全一致。结果发现，改进的分光光度检测法准确性好、稳定性高，能够用于乳中钙含量的检测。实施例6采用分光光度检测法进行检测：稀释液为以下的组分：0.8％盐酸和0.2％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。其余步骤和条件均与实施例1中“a、采用分光光度检测法进行检测”中的步骤和条件完全一致。表10分光光度检测法与国标法检测的结果比对表10说明，当稀释液的组分含有0.8％的盐酸时，所得的结果与国标法对比的偏差非常小，说明实施例6的稀释液能够准确地测定乳中的钙含量。结果发现，改进的分光光度检测法准确性好、稳定性高，能够用于乳中钙含量的检测。实施例7采用分光光度检测法进行检测：稀释液为以下的组分：0.5％盐酸和0.01％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。测定试剂为以下的组分：200μmol/l偶氮胂ⅲ、70mmol/l哌嗪-1,4-二乙磺酸和2％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。其余步骤和条件均与实施例1中“a、采用分光光度检测法进行检测”中的步骤和条件完全一致。结果发现，改进的分光光度检测法准确性好、稳定性高，能够用于乳中钙含量的检测。实施例8采用分光光度检测法进行检测：稀释液为以下的组分：0.5％盐酸和1.0％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。其余步骤和条件均与实施例1中“a、采用分光光度检测法进行检测”中的步骤和条件完全一致。结果发现，改进的分光光度检测法准确性好、稳定性高，能够用于乳中钙含量的检测。对比例1采用分光光度检测法进行检测：稀释液为以下的组分：5％盐酸和0.5％tritonx-100，所述百分比为质量百分比。其余步骤和条件均与实施例1中“a、采用分光光度检测法进行检测”中的步骤和条件完全一致。表11分光光度检测法与国标法检测的结果比对表11说明，当稀释液的组分含有5％的盐酸时，所得的结果与国标法对比的偏差很大，说明此时的稀释液不能准确地测定乳中的钙含量。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12