一种磷酸糖类物质的富集和固相衍生预处理方法与流程

本发明属于无机材料和分析技术领域，是一种基于金属离子亲和色谱材料(sio2@pd-ti⁴⁺)对磷酸糖类物质富集和固相衍生的预处理方法及其应用。

背景技术：

磷酸糖类物质，如6-磷酸葡萄糖、核糖-5-磷酸、赤藓糖-4-磷酸和甘油醛-3-磷酸等在许多生命过程中发挥着重要作用。它们是中心碳代谢，如糖酵解、糖质异生作用、磷酸戊糖途径和三羧酸循环代谢途径中的重要中间体代谢物，能参与调控肿瘤的能量代谢。目前，液相色谱质谱联用(lc-ms)技术由于高灵敏度和高分辨率的优点，已在磷酸糖类物质的检测中普遍采用。然而，由于磷酸糖类物质极性强，在反相液相色谱上保留弱，以及在生物样品中磷酸糖类物质浓度低，基质干扰严重，质谱离子化效率受到抑制，使得采用lc-ms方法检测仍然面临着很大挑战。上述问题使得发展磷酸糖类物质的高灵敏检测新方法和新技术十分必要。

为了改善磷酸糖类物质的反相色谱分离困难及质谱离子化效率低的问题，人们通常采用衍生的方法。如han等利用3-氨基-9乙基咔唑和磷酸糖类物质发生液相衍生反应，提高了其在反相色谱上的保留和分离度，但存在耗时、过量衍生试剂干扰和灵敏度低的问题。固相衍生方法是基于固体基质发生的衍生反应。这种方法通过材料预处理有效的去除了基质效应，并且缩短了衍生反应时间和避免了过量衍生试剂干扰。至今尚未见基于固定化金属离子亲和色谱材料来富集和固相衍生磷酸糖类物质的预处理方法的相关报道。

技术实现要素：

本发明针对现有方法的不足，建立了一种基于金属离子亲和色谱材料对磷酸糖类物质富集和固相衍生的预处理方法，该方法不仅能提高磷酸糖类物质在反相液相色谱上的保留和分离度，而且能提高低丰度磷酸糖类物质的质谱检测灵敏度。本发明的分析方法具有预处理过程简单、快速、重复性好、低检测限等优点。

本发明采用的技术路线如下：

第一步合成金属离子亲和色谱材料sio2@pd-ti⁴⁺：100-300mgsio2(粒径3-10μm)分散在30-50ml浓度为1-3mg/ml的多巴胺水溶液中，在磁力搅拌下迅速加入30-50mltris缓冲液(ph8-9)，在水浴温度25-60℃，磁力搅拌条件下反应8-12小时，水洗后得到sio2@pd微球。然后将sio2@pd分散在60-100ml浓度为80-120mm的ti(so4)2溶液中，在水浴温度20-60℃，磁力搅拌条件下继续反应2-4小时，水洗后得到sio2@pd-ti⁴⁺微球；

第二步预处理过程：取4-6mgsio2@pd-ti⁴⁺材料，用上样液(由acn/h2o(1:1-2:1，v/v)溶液加入终浓度2％(v/v)甲酸(fa)和终质量分数为0.2-1％ 的谷氨酸配制)平衡材料1-2次，再向材料中加入100-300μl浓度为8-12μg/ml的g6p溶液，涡旋振荡2-10min，离心去除上清液，材料用上样液洗涤2-4次。然后向该材料中加入200-600μl浓度为20-30mm3-氨基-9-乙基咔唑、100-300μl浓度为40-60mm氰基硼氢化钠和60-100μl乙酸作为催化剂，在混匀振荡仪上涡旋振荡5-20min，振荡频率为600-1200rpm/min，温度为50-70℃。衍生反应完后，离心去除上清液，用溶剂ch3oh/h2o(1:1-4:1，v/v)洗涤材料2-3次。最后向材料中加入100-300μl3-6％nh3.h2o，涡旋振荡2-10min，离心取上清液，进行lc-ms分析。

由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点：实现富集和衍生一体化，通过富集作用，去除基质干扰，提高了低丰度磷酸糖类物质的质谱检测灵敏度，通过衍生，提高了磷酸糖类物质在反相液相色谱上的保留和分离度。相比液相衍生，固相衍生方法还具有衍生反应所需时间短、避免使用过量的衍生试剂和提供更低的检测限。

附图说明

图1(a)金属离子亲和色谱材料sio2@pd-ti⁴⁺的合成示意图。(b)基于sio2@pd-ti⁴⁺从细胞中富集提取磷酸糖类物质的流程示意图。

图2实施例1中合成的微球在不同阶段的透射电镜图。sio2微球(a)、sio2@pd微球(b)和sio2@pd-ti⁴⁺微球(c和d)。从图d中能明显看出聚多巴胺层和外面螯合上的ti⁴⁺层，厚度约为30nm(图中用白色短线标记)。

图3(a)实施例1中多巴胺包覆前后红外光谱图。(a)sio2微球。(b)sio2@pd-ti⁴⁺微球。由(b)中特征吸收峰可知，多巴胺已成功包覆在sio2表面。

(b)合成的sio2@pd-ti⁴⁺微球的x射线能谱(edx)图。从图中可以看出ti⁴⁺已成功螯合上。通过edx分析，得到含ti的质量分数为5.14％。

图4磷酸糖固相衍生(a)和液相衍生(b)反应时间优化图。从图中可以看出固相衍生时间明显短于液相衍生时间。

图5实施例2中用sio2@pd-ti⁴⁺从细胞中提取的磷酸糖类物质衍生化后的分析色谱图。(a)分析物总离子流图，(b)、(c)、(d)、(e)图分别为己糖磷酸(标记为1)、戊糖磷酸(标记为2)、赤藓糖-4-磷酸(标记为3)和甘油醛-3-磷酸(标记为4)的提取离子流图。液相色谱条件：色谱柱为zorbaxsb-c18(1.8μmi.d.,100x2.1mm,agilent,usa)柱。流动相a相为水(含0.1％甲酸)，b相为乙腈(含0.1％甲酸)，梯度条件可表示为(min,b)：(0，15％)(6，20％)(8，50％)(10，100％)(10.1，15％)(13，15％)，柱温为40℃，流速为0.3ml/min，进样量为5μl。质谱条件：esi源，喷雾电压为4000v；鞘气和雾化气为n2，鞘气流速为8l/min，温度为350℃；雾化气压力为40psi。

具体实施方式

通过具体实例对本发明的一种用于富集和固相衍生磷酸糖类物质的预处理方法及其应用进行细致阐述。

实施例1.固定金属亲和色谱材料sio2@pd-ti⁴+的合成及其对磷酸糖类物 质的富集衍生过程。

第一步合成固定金属亲和色谱材料sio2@pd-ti⁴⁺：200mgsio2(粒径3μm)分散在40ml浓度为2mg/ml的多巴胺水溶液中，在磁力搅拌下迅速加入40mltris缓冲液(ph8.5)，在水浴温度40℃，磁力搅拌条件下反应10小时，水洗后得到sio2@pd微球。然后将sio2@pd分散在80ml浓度为100mm的ti(so4)2溶液中，在水浴温度40℃，磁力搅拌条件下继续反应3小时，水洗后得到sio2@pd-ti⁴⁺微球。合成示意图见图1。

第二步富集衍生过程：以6-磷酸葡萄糖标样(g6p)为例，取5mgsio2@pd-ti⁴⁺材料，用上样液(由acn/h2o(65/35，v/v)溶液加入终浓度2％(v/v)甲酸(fa)和终质量分数为0.4％的谷氨酸配制)平衡材料1次，再向材料中加入200μl浓度为10μg/ml的g6p溶液，涡旋振荡5min，离心去除上清液，材料用上样液洗涤3次。再向该材料中加入400μl浓度为25mm3-氨基-9-乙基咔唑、200μl浓度为50mm氰基硼氢化钠和80μl乙酸作为催化剂，在混匀振荡仪上涡旋振荡10min，振荡频率为1000rpm/min，温度为60℃。衍生反应完后，离心去除上清液，用溶剂ch3oh/h2o(3/1，v/v)洗涤材料3次。最后向材料中加入200μl5％nh3.h2o进行洗脱，涡旋振荡5min，离心取上清液，进行lc-ms分析。

实施例2.选择性富集衍生细胞中的磷酸糖类物质和lc-ms分析

(1)细胞预处理：从培养箱中将7721肝癌细胞取出，用液氮瞬间猝灭，加pbs缓冲液洗涤3次。加入1ml甲醇，将细胞刮下转移至ep管中，涡旋30s，再加入400μl超纯水，涡旋30s，最后加入1ml氯仿，涡旋30s。静置1min后，在15000rpm/min转速下离心10min。取上清液900μl，冻干。加入4ml上样液(由acn/h2o(65/35，v/v)溶液加入终浓度2％(v/v)甲酸(fa)和终质量分数为0.4％的谷氨酸配制)进行复溶。

(2)材料预处理过程：取10mgsio2@pd-ti⁴⁺材料，用上样液(由acn/h2o(65/35，v/v)溶液加入终浓度2％(v/v)甲酸(fa)和终质量分数为0.4％的谷氨酸配制)平衡1次，加入上述(1)中细胞复溶液1ml，涡旋振荡5min，离心去除上清液，材料用1ml上样液洗涤3次。之后加入400μl浓度为25mm3-氨基-9-乙基咔唑、200μl浓度为50mm氰基硼氢化钠和80μl乙酸。在混匀振荡仪1000rpm/min，温度为60℃条件下衍生反应10min，离心去除上清液，材料用ch3oh/h2o(3/1，v/v)洗涤3次。最后向材料中加入500μl5％nh3.h2o进行洗脱，涡旋振荡5min，离心取上清液200μl冻干，再用40μl复溶溶剂acn/h2o(1/4，v/v)复溶，进行lc-ms分析。

(3)lc-ms分析：利用反相液相色谱-质谱联用的多反应监测模式进行衍生化后磷酸糖类物质的分析。液相色谱条件：色谱柱为zorbaxsb-c18(1.8μmi.d.,100x2.1mm,agilent,usa)柱。流动相a相为水(含0.1％甲酸)，b相为乙腈(含0.1％甲酸)，梯度条件可表示为(min,b)：(0，15％)(6，20％)(8，50％)(10，100％)(10.1，15％)(13，15％)，柱温为40℃，流速为0.3ml/min， 进样量为5μl。质谱条件：esi源，喷雾电压为4000v；鞘气和雾化气为n2，鞘气流速为8l/min，温度为350℃；雾化气压力为40psi。从7721肝癌细胞中提取的磷酸糖类物质衍生化后的提取离子流色谱图如附图5所示。该发明的预处理方法结合rplc-ms分析能检测到磷酸戊糖途径中的大部分磷酸糖，包括己糖磷酸(g6p，f6p)、戊糖磷酸(r5p，rb5p)、赤藓糖-4-磷酸(e4p)和甘油醛-3-磷酸(g3p)。