一种同时检测抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根的方法与流程

本发明涉及一种通过电化学的方法同时检测抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根等五种物质。

背景技术：

抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸及亚硝酸根这五种物质对人体的新陈代谢起到重要作用，而通过这些物质的检测，可以通过判断坏血病、精神分裂症及老年痴呆症、糖尿病、肝功能衰退、食物中毒等病人体液中所含上述物质的含量，并起到预防作用。

目前，临床医学中常用氧化还原滴定法、分光光度法、尿酸酶－过氧化物酶偶联法、荧光分光光度法、比色法等。在临床应用中，要么对不同物质采用不同的检测手段，要么样品处理过程繁琐，要么使用酶等容易失活的生物物质进行标记，这对检测速度和效果都带来了不利影响。另外，由于各种待测物之间存在着相互作用，只有实时同步测定，才能反应体液内相应物质真实的水平。

临床上体液的检测手段正向低成本、多项同步、高灵敏、准确及快速的方向发展。而电化学传感器是与传感器电极与待测物之间的电化学响应峰电位为定性指标，响应峰电流为定量指标，可同时检测多种物质。

本发明涉及的电化学传感器，其工艺简单、成本低，通过该电化学传感器可以快速同时检测人体体液中所含抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸及亚硝酸根这五种物质的含量。

技术实现要素：

本发明的目的在于构建工作电极、参比电极及对电极三电极系统，同时实现检测抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸及亚硝酸根这五种物质，实现高灵敏度、低检测限的目的。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种同时检测抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根的方法，通过由工作电极、参比电极、对电极三个电极构成的电化学传感器实现，包括以下步骤：

(1)以磷酸缓冲溶液作为底液，配置不同pH值的抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根五种待测物混合溶液，电化学传感器的三电极连接电化学工作站插入该溶液中，采用差分脉冲伏安法测试，获得具有5个电化学响应特征峰的电压－电流工作曲线，在不同pH值下对比峰电流的大小，找出最大峰电流的pH值；

(2)以磷酸缓冲溶液作为底液，稀释血清并调整pH值，使血清的pH值调整为上步骤中确定的最大峰电流的pH值，抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根五种物质的溶液浓度稀释到步骤(1)工作曲线浓度范围内；

(3)三电极插入步骤(2)溶液中，采用差分脉冲伏安法测试，其中峰电流大小与工作曲线比较，获得稀释后血清中5个待测物的浓度，该浓度再乘上稀释倍数即可获得血清中抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根五种物质的浓度。

进一步的，工作电极采用石墨烯/钽电极或石墨烯/掺硼金刚石膜电极或石墨烯/钛电极；参比电极采用饱和甘汞电极或Ag/AgCl电极或汞/硫酸亚汞电极；对电极采用铂片电极。

进一步的，工作电极采用以下步骤实现：(1)在钽或掺硼金刚石膜或钛的基底上预沉积一层镍颗粒，作为石墨烯生长所需的催化剂；(2)采用直流电弧等离子体喷射化学气相沉积技术制备石墨烯，其中反应压强为100Pa～4000Pa，基底温度为500℃～1200℃，生长时间为0.5min～30min，电弧电压为50V～70V，电弧电流为80A～130A。

进一步的，步骤(1)和(2)中底液pH值为4.0～10.0、浓度为0.1mol/L～0.2mol/L的磷酸缓冲溶液。

进一步的，步骤(1)中抗坏血酸的浓度范围为5～1500μmol/L，多巴胺的浓度范围为0.25～75μmol/L，尿酸的浓度范围为0.4～120μmol/L，色氨酸的浓度范围为0.25～75μmol/L，亚硝酸根的浓度范围为2～600μmol/L。

进一步的，步骤(1)中差分脉冲伏安法的电位范围设置为-1.0V～1.2V，电位增量设置为0.001V～0.05V，振幅设置为0.01V～0.05V，脉冲宽度设置0.005s～0.25s，脉冲周期设置0.01s～0.5s。

进一步的，步骤(2)中血清稀释倍数选择1～100倍。

本发明具有以下特点：

(1)可同时快速检测血清中抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根等五种物质的浓度。

(2)检测线性范围宽，灵敏度高，检测限低。

(3)传感器的再现性、重复性、稳定性好，寿命长。

(4)成本低、有利于微型化。

附图说明

图1为本发明制备的工作电极表面石墨烯的扫描电子显微镜照片。

图2为用本发明的基础上制备的石墨烯/钽丝作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂片为对电极在不同浓度下获得的差分脉冲伏安曲线及工作曲线。

其中，抗坏血酸浓度为5～1500μmol/L，多巴胺浓度为0.25～75μmol/L，尿酸浓度为0.4～120μmol/L，色氨酸浓度为0.25～75μmol/L，亚硝酸根浓度为2～600μmol/L。图中，a为差分脉冲伏安曲线，b～f依次为抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根的工作曲线。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

(1)工作电极的制备

①配置浓度为0.6mol/L的Ni(NO3)2乙醇溶液，并滴涂在直径为0.6mm的钽丝表面，烘干后置于直流电弧等离子体喷射化学气相沉积系统的样品台上，调节样品台高度，使其距离等离子体喷射口大约1.5cm。

②关闭反应室，对系统抽真空，当真空度达到1Pa以下时，通入流量为2L/min的氢气、1.5L/min的氩气及200mL/min的甲烷，其中反应压强为100Pa～4000Pa，电弧电压为50V～70V，电弧电流为80A～130A，基底温度为500℃～1200℃，生长时间为0.5min～30min后，取出石墨烯/钽丝样品，作为工作电极。本发明优选当腔压和泵压达到3000Pa和13000Pa时，施加110A的电弧电流，样品台基底温度为950℃，生长石墨烯15min时，所得工作电极最为理想。所得工作电极表面石墨烯的扫描电子显微镜照片如附图1所示。

(2)确定pH值

①配置pH值为4.0～10.0、浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲溶液作为底液，配置pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根的混合溶液，其中这五种物质的浓度依次为:500μmol/L、25μmol/L、40μmol/L、25μmol/L、200μmol/L。

②石墨烯/钽丝作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂片为对电极，连接电化学工作站，并将这三个电极插入不同pH值的抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根的混合溶液中，采用电化学工作站中的差分脉冲伏安法测试电流－电压曲线。差分脉冲伏安法的参数中，电位范围设置为-1.0V～1.2V，电位增量设置为0.001V～0.05V，振幅设置为0.01V～0.05V，脉冲宽度设置0.005s～0.25s，脉冲周期设置0.01s～0.5s。本发明中优选电位增量设置为0.001V，振幅设置为0.01V，脉冲宽度设置为0.005s，脉冲周期设置0.01s。

③通过比较不同pH值下获得的峰电流的大小，确定pH值，对本实例的电极，最优的pH值为7.0。

(3)建立工作曲线

①以磷酸缓冲溶液为底液，配置pH值为7.0的不同浓度的抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根的混合溶液。其中，抗坏血酸浓度为5～1500μmol/L，多巴胺浓度为0.25～75μmol/L，尿酸浓度为0.4～120μmol/L，色氨酸浓度为0.25～75μmol/L，亚硝酸根浓度为2～600μmol/L。

②依然采用上步骤中采用过的三个电极，采用与上步骤相同参数的差分脉冲伏安法测试电流－电压曲线，参见附图2。由于每种待测物的电化学响应特性不同，在上述步骤中测试的差分脉冲伏安法电压－电流曲线中，会出现5个针对五种待测物的响应特征峰，其中峰电位用于定性指标，峰电流用于定量指标，绘制每个待测物的工作曲线，即浓度为横坐标，峰电流为纵坐标的曲线。从曲线中获得抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根的峰电位依次为-0.115V、0.115V、0.25V、0.58V、0.715V左右，这些峰电位作为定性指标。

③以每个待测物的浓度作为横坐标，峰电流作为纵指标，通过不同浓度下获得的每个待测物的峰电流大小，绘制工作曲线，作为待测物的检测模型。

在本实例中，检测抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根五种物质的的最低浓度可以达到5μmol/L、0.25μmol/L、0.4μmol/L、0.25μmol/L、2μmol/L。

(3)分析血清中的回收率

以磷酸缓冲溶液为底液，稀释血清，并调整pH值为7.0。由于对不同人的血清中抗坏血酸、多巴胺、尿酸、色氨酸和亚硝酸根的浓度不同。在本实例中，血清的稀释倍数采用10倍、20倍、50倍，血清的回收率可以达到95％～105％范围。