技术领域本发明涉及食品检测领域，尤其涉及一种快速高灵敏检测大田软海绵酸毒素的试剂盒及方法。
背景技术：
大田软海绵酸(OA)是由鳍藻和原甲藻产生的一种脂溶性的海洋生物毒素。不同种类贝类通过食用海洋藻类实现了生物毒素在贝类中的富集，但贝类本身并不受该毒素影响，而人类在食用受污染的贝类后，会引起腹泻性贝类中毒(DSP)和胃肠道紊乱。通过动物实验，OA已经被证明了具有致癌性，致突变和免疫毒性。欧盟委员会(EC)规定贝肉中的最大浓度不超过160ug/kg。小鼠生物法曾被作为测定OA的标准方法。但其选择性和精度较低且涉及到伦理问题，于2011年1月已被禁止。高效液相及高效液相色谱-质谱联用的方法灵敏度高、结果准确，但设备非常昂贵、耗时、也需要熟练的操作人员，且对样品前处理有较高要求。其他技术如细胞传感器等也被用于贝类毒素的检测，但也不利于实现现场快速检测。因此迫切需要高度敏感的方法来实现快速检测贝肉中的OA毒素。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，利用酶联免疫的方法，提出一种现场快速检测大田软海绵酸的试剂盒，该试剂盒具有高通量，低检测限，操作简便，耗时短，成本低的优点，填补了国内该技术的空白。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种快速高灵敏检测大田软海绵酸毒素的试剂盒，包括OA-BSA标记的可拆卸8*12的酶标板、OA系列浓度的标准品、HRP标记试剂盒标记的OA单克隆抗体HRP-MAb、10×浓缩洗涤液、显色底物TMB、终止液HCl。进一步,OA-BSA的制备过程为：(1)50μg的OA粉剂溶解在50μl甲醇溶液中，得到OA溶液。(2)将10ul20mg/ml的EDC和10ul10mg/ml的NHS加到OA溶液中，缓慢震荡2小时，得到活化的OA溶液，其中，EDC和NHS的溶剂是0.1MMES，pH＝5.5。(3)将400μl1mg/ml的BSA溶解在0.01MpH＝7.2的PBS缓冲液中，逐滴加入活化的OA溶液中。(4)以上混合液在震荡条件下持续反应4小时，得到OA-BSA溶液，同时将透析袋MW＝10000放在体积分数20％乙醇中煮沸后冷却。(5)将上述OA-BSA溶液用透析袋透析，透析液为0.01MpH＝7.2的PBS缓冲液，透析液每8小时更换一次，共更换四次，得到OA-BSA原液。进一步,OA-BSA标记的可拆卸8*12的酶标板的制备过程为：(1)包被酶标板，孵育，洗板；包被缓冲液为0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液，1L碳酸盐缓冲液中含有1.59gNaCO3、2.93gNaHCO3和0.1MNaCl；(2)封闭酶标板，孵育，洗板；封闭液为质量分数1％的BSA溶液。进一步,酶标板的孵育温度为35℃，孵育时间为1h。进一步,10×浓缩洗涤液为0.1M的PBS+1％Tween20，使用时稀释10倍。进一步,标准品浓度为0、0.2、0.5、1、2、5ng/ml。一种检测大田软海绵酸毒素的方法，包括以下步骤：(1)分别将标准品和样品加入OA-BSA标记的可拆卸8*12的酶标板孔中，向每个孔中加入HRP-MAb，孵育，洗板；(2)加显色底物TMB，孵育；(3)加终止液HCl，在450nm处测定吸光度；(4)根据标准品的吸光度绘制检测OA毒素的标准曲线，根据标准曲线计算样品中毒素的浓度。进一步,加入酶标板孔中的样品的前处理过程为：取0.2g搅碎贝肉加1ml体积分数90％甲醇，涡旋震荡5min，7000rpm离心3min，取上清液过滤，过滤器为0.25um有机系，稀释10倍待检测。进一步,OA-BSA100ul，封闭液200ul，标准品和样品分别100ul，HRP-MAb50ul，TMB100ul，HCl100ul。进一步,步骤(1)中的孵育时间30min，步骤(2)中的孵育时间15min。本发明与现有技术相比的有益效果是：本发明技术方案相对小鼠生物法、高效液相或者高效液相色谱-质谱联用的方法、细胞传感器的方法，操作更为简单，不需要专业的操作人员和操作环境，成本更为低廉，反应更为迅速。该试剂盒的检测限为0.19ng/ml，低于基于其他原理检测OA的试剂盒。在90分钟内即可完成检测，同时具有高通量的特点，一次能检测84个样本，非常适用于现场的快速检测，且填补了国内该领域的空白。附图说明图1是所述试剂盒的原理图；图2是所述试剂盒检测大田软海绵酸浓度范围的S型曲线图；图3是所述试剂盒检测大田软海绵酸的标准曲线图；图4是所述试剂盒的特异性曲线图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但并不是限制本发明。实施例1：一种快速高灵敏检测大田软海绵酸毒素的试剂盒，具体包括OA-BSA标记的可拆卸8*12的酶标板、OA系列浓度的标准品、HRP标记试剂盒标记的OA单克隆抗体HRP-MAb、10×浓缩洗涤液、显色底物TMB、终止液HCl。实施例2：抗原包被板的制备(1)抗原包被酶标板将0.05MpH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被液，向酶标板中每孔加入100ul，35℃孵育1h。(2)洗板倒掉酶标板中的液体，向每孔中加入200ul稀释10倍的浓缩洗涤液，震荡2min，重复以上步骤3次。(3)封闭向酶标板中每孔加入1％的BSA溶液，35℃孵育1h。(4)洗板，封装按(2)中的步骤洗板，然后将抗原包被的酶标板装入铝箔袋中，放入干燥剂，真空封口机进行抽真空封口，4℃储存。实施例3：检测范围的确定向试剂盒中加入100ulOA系列浓度，0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200ng/ml，每种浓度3个重复孔，加入HRP-MAb，孵育后洗板，然后加入TMB，孵育后加入HCl，450nm处测吸光度值，将每孔吸光度值A与浓度为0的孔的吸光度均值A0进行比较，得出A/A0。图2为随着OA浓度变化的A/A0值，由图可见，在OA浓度范围为0.2-5ng/ml范围内，A/A0与OA浓度呈现良好线性关系，图3为将该范围内的5个点选出来作标准曲线，得到r2为0.9839，呈现良好的线性关系，因此该试剂盒的线性范围确定为0.2-5ng/ml。实施例4：试剂盒的特异性向试剂盒中加入不同种类的毒素如鳍藻毒素(DTX)、石房蛤毒素(STX)、膝沟藻毒素(GTX)、扇贝毒素(PTX)，每种毒素每个浓度3个重复孔，后续过程参考实施例3。特异性用交叉反应率来表示。图3为不同种毒素对该试剂盒的交叉反应，DTX的IC50为6.382ng/ml，OA的IC50为1.504ng/ml，因此DTX与该试剂盒的交叉反应率为23.6％，一方面该交叉反应率较小，另外一方面，在我国贝类中DTX的含量几乎为0。而其他几种毒素的IC50都趋向很大，交叉反应率<0.2％。实施例5：检测限、加标回收率、变异系数的测定(1)样品加标：取无毒贝肉,贝肉种类为紫贻贝、扇贝、牡蛎,10g搅碎20s，向贝肉中注射相应的毒素量，加标浓度为20、40、80、160、200ug/kg，然后加入90％的甲醇50ml，搅拌2min，称取贝肉2g，3管，7000rpm离心3min，取上清液用0.25um有机系过滤器过滤，稀释10倍待检测。(2)向试剂盒中加入系列标准品，2个重复孔，其他孔分别加入空白值，7个重复孔，(1)中的加标样品，9个重复孔为9，后续实验过程参考实施例3。检测限的计算方法为所测空白孔的浓度的平均值+3×空白孔浓度的标准差；加标回收率通过9个孔中的每三个孔取平均值，然后得到的3个再取均值，再除以加标浓度，同时计算变异系数。计算得出该试剂盒的检测限位0.19ng/ml；表1为加标回收率和变异系数，可以看到，该试剂盒的回收率在75-105％之间，变异系数在2-16％。表1加标回收率和变异系数浓度(ug/kg)贻贝牡蛎扇贝2084.47％±2.75％82.35％±1.79％75.78％±8.11％4094.01％±6.43％89.91％±9.49％95.26％±7.16％8080.29％±2.82％102.56％±11.33％87.74％±15.62％16088.96％±15.93％99.92％±11.15％102.34％±9.68％20083.23％±8.43％78.96％±8.27％81.89％±15.46％实施例6：试剂盒检测实际样品与高效液相(HPLC)相比(应用实例)(1)取0.2g搅碎的有毒贝肉加1ml体积分数为90％的甲醇，涡旋震荡5min，7000rpm离心3min，取上清液用0.25um有机系过滤器过滤，稀释10倍待检测。(2)向所示试剂盒加入系列标准品，2个重复孔，其他孔分别加入(1)中有毒贝肉样品，3个重复孔，22个样品，后续实验过程参考实施例3。并用HPLC检测同样的贝肉样品。表2为所述试剂盒与液相检测实际样品的结果。本试剂盒的检测限为0.19ng/ml，前处理过程的稀释倍数为50倍，所以换算成贝肉中为9.5ug/kg。可以看出所检测的20个样本中，所述试剂盒检测出3个样本数据高于9.5ug/kg，而且试剂盒的检测结果与HPLC的结果接近，说明本试剂盒的有效性。表2试剂盒与HPLC检测实际样品数据