技术领域本发明属于中药学研究技术领域，特别是涉及到一种人参总皂苷和黄连总生物碱制成的参连饮降糖速崩片对糖尿病及糖尿病肾病的治疗作用的分析方法。
背景技术：
糖尿病，中医称之为“消渴症”，是一种由代谢紊乱引起的分泌系统疾病。有研究表明，2013年全世界有3.82亿糖尿病患者，预测这个数字到2035年会上升到5.92亿。糖尿病分为1型糖尿病(Type1DiabetesMellitus,T1DM)和2型糖尿病(Type2DiabetesMellitus,T2DM)。根据WHO的最新统计，糖尿病的致死率已经上升至继癌症和心脑血管疾病之后位列第三位。因其发病机制复杂，到目前为止，临床对糖尿病的治疗主要还是通过药物治疗、加强运动、调控饮食等方法控制血糖上升和减缓糖尿病并发症，还没有找到充分有效的消除糖尿病的方法，而且，大多数降糖药物，如二甲双胍、阿卡波糖等都有一定的副作用。中药治疗2型糖尿病的优势在这种趋势下得以体现。中药含有多种组分，且复杂，因此一种针对2型糖尿病的中成药的治疗作用常常体现在多个靶点位置上。中药配伍是中医用药的特色和优势，充分体现了中医的“整体观念”、“辨证论治”的精髓，所有的方剂都是在中医药理论指导下遵循配伍规律组成的。人参黄连药对出自《万病回春》中“参连饮”，具有益气生津，清热燥湿的功效，是中医治疗“消渴症”古方中清热益气药的代表。现代中医通过临床研究发现人参黄连合用对2型糖尿病的治疗作用显著。现代药理学研究也表明人参黄连合用具有很好的降糖作用。但是，人参总皂苷与黄连总生物碱联合应用后对治疗2型糖尿病的靶点及作用机制包含哪些仍有待研究。细胞代谢组学是以细胞作为代谢组学研究对象，研究细胞受到外源性药物干扰后细胞内所有代谢物的综合表现，进一步阐明药物对机体的作用机制，符合中医治疗的“整体观念”。人参为五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Mey.)的干燥根和根茎，是我国的传统名贵中药。其性微温，味甘、微苦，入脾、肺、心经。可大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智。久服轻身延年。人参中含有多种化学成分，现代药理研究表明人参具有调节免疫力、改善微循环、调节血糖、抑制血小板聚集、提高组织抗缺氧能力等作用。其中人参皂苷在治疗和改善糖尿病及其并发症方面具有显著效果。Kim等研究发现加工后的红参能够刺激小鼠胰岛素的释放，另外，红参的乙醇提取物也被证实可以通过调控细胞Ca2+通道及K+通道而抑制胰岛素释放。提示红参对糖尿病的治疗作用是经由葡萄糖依赖性方式刺激胰岛素释放来达到的。有研究表明，脂肪细胞3T3-L1对葡萄糖的摄取可以通过人参皂苷Re激活胰岛素信号传导通路来提高。同时，人参皂苷Re增加胰岛素敏感性，并且减弱胰岛素抵抗可以通过抑制核因子NF-κBα的降解以及抑制c-Jun氨基端激酶(JNK)与核因子NF-κB的激活来达到。HanKL等人通过实验发现PPARγ的转录活性可以通过人参皂苷代谢物之一的20S-原人参三醇皂苷(PPT)来提高，这表明20S-原人参三醇皂苷是作为PPARγ激动剂来改善与糖尿病相关的胰岛素抵抗。通过研究人参皂苷Rb1对3T3-L1脂肪分解和脂肪细胞分化的实验发现，Rb1能够增加PPARγ2和C/EBPα基因的表达，来提高基础和胰岛素刺激的葡萄糖的利用来抑制基础脂解，同时加速脂肪细胞分化，葡萄糖转运蛋白4的表达也随之增加。这些结果均表明人参皂苷Rb1有抗糖尿病作用及对胰岛素的增敏效果。黄连为毛莨科植物黄连(CoptischinensisFranch.)、三角叶黄连(CoptisdletoideaC.Y.ChengetetHsiao)或云连(Coptis.teetaWall.)的干燥根茎。性寒、味苦，入心、脾、胃、肝经，可清热燥湿，泻火解毒[22]。现代药理学研究证明黄连具有抗氧化、抗病毒、抗菌、抗原虫、抗炎、抗癌、抗心律失常、保护胃黏膜、正性肌力及降压与降糖的作用。临床研究和动物实验显示,黄连中的生物碱类对于治疗和改善糖尿病及其并发症均有显著的效果。目前，黄连已经分离出来的生物碱主要有小檗碱(berberine)，又称黄连素、巴马汀(palmatine)、药根碱(jatrorrhizine)、表小檗碱(epiberberine)、黄连碱(coptisine)等。其中小檗碱的含量最高，而且其降糖作用也最好。Li等研究证实，酒炙黄连对STZ诱导的大鼠糖尿病模型具有增加胰岛素生物活性作用，降低大鼠空腹血糖(FBG)与胆固醇(TC)，防止caspase3的高表达，推测其对糖尿病的治疗作用是通过抑制氧化应激损伤导致的胰岛β细胞凋亡来实现的。刘新等采用HepG2细胞葡萄糖消耗实验与KM小鼠糖尿病模型来评价黄连总生物碱与单碱的降糖活性和氧化应激能力，结果表明黄连总生物碱的降糖活性及氧化应激能力均高于单碱，而且能明显增加SOD活力，降低MDA含量和AR活力。Lee采用高胰岛素正葡萄糖钳夹技术，证明了对于高脂饮食喂养的胰岛素抵抗大鼠模型，黄连素可以明显改善其胰岛素抵抗的作用。人参黄连药对出自《万病回春》中“参连饮”，具有益气生津，清热燥湿的功效，是中医治疗“消渴症”古方中清热益气药的代表，现代中医通过临床研究发现人参黄连合用对2型糖尿病的治疗作用显著。现代药理学研究也表明人参黄连合用具有很好的降糖作用。因此现有技术当中亟需要一种新型的技术方案来解决这一问题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是：提供一种参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法，通过实验对比证明参连饮降糖速崩片的有效成分人参总皂苷和黄连总生物碱结合物(简称RH)具有显著降低糖尿病患者血糖值，对早期糖尿病肾病具有一定的治疗作用。参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法，其特征是：包括以下步骤，步骤一、选取实验分组选取250只C57小鼠，取其中20只组成CON对照组，其余230只制备为糖尿病肾病模型组；CON组喂食正常饲料，模型组喂食高脂饲料，喂养四周后，向C57小鼠腹腔注射30mg/kg的链脲佐菌素STZ两次，一周后，向CON组给予与STZ体积相同的枸橼酸缓冲液，注射STZ四周后，测量空腹血糖，空腹血糖＞7.8mmol/L为糖尿病的判断标准；取10只CON组小鼠给溶媒8周，取模型组小鼠20只给溶媒8周，取模型组小鼠20只给含人参皂苷与黄连总生物碱的混合物RH80+320mg/kg的参连饮降糖速崩片8周,取模型组小鼠20只给40+160mg/kg的RH8周，取模型组小鼠20只给20+80mg/kg的RH8周，取模型组小鼠20只给80mg/kg的人参总皂苷GG8周，取模型组小鼠20只给320mg/kg的黄连总生物碱TBG8周，取模型组小鼠20只给8mg/kg的卡托普利CAP8周；各组分别治疗8周后，小鼠禁食12h～16h,取眼球血，进行离心分离血清；取小鼠肾脏组织，其中一部分用10％的福尔马林固定，另一部分在-80℃的冰箱内保存备用；步骤二、生理化指标的检测包括小鼠空腹血糖、总胆固醇以及甘油三脂的检测，葡萄糖耐量的检测，尿量、尿蛋白以及尿白蛋白的检测，血肌酐和血清尿素氮的检测，血清钠和血清钾的检测，尿钠和尿钾的检测，体重和肾脏指数的检测；小鼠空腹血糖、总胆固醇以及甘油三脂的检测对经所述步骤一分得的8组小鼠分别在给药前和给药8周后检测空腹血糖、总胆固醇以及甘油三脂，采用葡萄糖氧化酶法进行检测血清葡萄糖浓度，采用甘油三脂和总胆固醇酶法进行检测甘油三脂和总胆固醇；葡萄糖耐量的检测取所述步骤一中注射STZ四周后的小鼠，进行口服葡萄糖耐量测定，小鼠禁食12h～16h，自由饮水，腹腔注射40％葡萄糖，在葡萄糖注射前及在葡萄糖注射后30min，60min，120min断尾取血，3500×g离心15min，吸取血清，采用葡萄糖氧化酶法测定各时间点血清中葡萄糖含量；尿量、尿蛋白以及尿白蛋白的检测取所述步骤一中的8组给药小鼠，分别检测给药4周以及给药8周时小鼠的尿量、尿蛋白以及尿白蛋白；血肌酐和血清尿素氮的检测取所述步骤一中的8组给药小鼠，检测给药8周时小鼠的血肌酐和血清尿素氮；血清钠和血清钾的检测取所述步骤一中的8组给药小鼠，检测给药8周时小鼠的血清钠和血清钾；尿钠和尿钾的检测取所述步骤一中的8组给药小鼠，分别检测给药4周以及给药8周时小鼠的尿钠和尿钾；体重和肾脏指数的检测取所述步骤一中的8组给药小鼠，在给药的8周时间内，每周称量小鼠体重一次至给药结束,通过计算肾脏指数；步骤三、病理学的统计通过所述步骤二对小鼠各项指标的检测，分别统计给药4周和给药8周后，RH对模型组小鼠整体生理状况以及葡萄糖耐量，尿量、尿蛋白以及尿白蛋白，血肌酐和血清尿素氮，血清钠和血清钾，尿钠和尿钾，体重和肾脏指数的影响；步骤四、统计结果分析将步骤三统计的结果分别做给药4周和给药8周的柱形图，通过柱形图得出RH可降低空腹血糖，降糖效果与高剂量黄连素相同；RH可降低血清总胆固醇及甘油三酯水平，与黄连总生物碱效果相同；RH可降低24h尿量、尿蛋白和尿白蛋白排出量；RH可降低血尿素氮和血肌酐；RH可升高血钠、降低血钾，尿钠排出增多、尿钾排出减少；RH对早期糖尿病肾病具有治疗作用。所述步骤一中的正常饲料为5％脂肪，53％碳水化合物，23％蛋白，总热量在25kJ/kg；高脂饲料为22％脂肪，48％碳水化合物，20％蛋白，总热量在44.3kJ/kg。通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：一种参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法，通过实验对比证明参连饮降糖速崩片的有效成分RH具有显著降低糖尿病患者血糖值，对早期糖尿病肾病具有一定的治疗作用。附图说明以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：图1为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法流程示意图。图2为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周检测血糖值柱状示意图。图3为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周检测血清总胆固醇值柱状示意图。图4为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周检测甘油三脂值柱状示意图。图5为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周检测24h尿量值柱状示意图。图6为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周检测尿蛋白排出量柱状示意图。图7为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周检测白蛋白排出量柱状示意图。图8为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周检测血尿素氮柱状示意图。图9为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周检测血肌酐柱状示意图。图10为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周检测血钠柱状示意图。图11为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周检测血钾柱状示意图。图12为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周检测尿钠柱状示意图。图13为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周检测尿钾柱状示意图。图14为本发明参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法给药8周肾脏重量柱状示意图。具体实施方式参连饮降糖速崩片降糖功效的实验分析方法，如图1所示，包括以下步骤，步骤一、选取实验分组选取250只C57小鼠，取其中20只组成CON对照组，其余230只制备为糖尿病肾病模型组；CON组喂食正常饲料，模型组喂食高脂饲料，喂养四周后，向C57小鼠腹腔注射30mg/kg的链脲佐菌素STZ两次，一周后，向CON组给予与STZ体积相同的枸橼酸缓冲液，注射STZ四周后，测量空腹血糖，空腹血糖＞7.8mmol/L为糖尿病的判断标准；取10只CON组小鼠给溶媒8周，取模型组小鼠20只给溶媒8周，取模型组小鼠20只给含人参皂苷与黄连总生物碱的混合物RH80+320mg/kg的参连饮降糖速崩片8周,取模型组小鼠20只给40+160mg/kg的RH8周，取模型组小鼠20只给20+80mg/kg的RH8周，取模型组小鼠20只给80mg/kg的人参总皂苷GG8周，取模型组小鼠20只给320mg/kg的黄连总生物碱TBG8周，取模型组小鼠20只给8mg/kg的卡托普利CAP8周；各组分别治疗8周后，小鼠禁食12h～16h,取眼球血，进行离心分离血清；取小鼠肾脏组织，其中一部分用10％的福尔马林固定，另一部分在-80℃的冰箱内保存备用；步骤二、生理化指标的检测包括小鼠空腹血糖、总胆固醇以及甘油三脂的检测，葡萄糖耐量的检测，尿量、尿蛋白以及尿白蛋白的检测，血肌酐和血清尿素氮的检测，血清钠和血清钾的检测，尿钠和尿钾的检测，体重和肾脏指数的检测；小鼠空腹血糖、总胆固醇以及甘油三脂的检测对经所述步骤一分得的8组小鼠分别在给药前和给药8周后检测空腹血糖、总胆固醇以及甘油三脂，采用葡萄糖氧化酶法进行检测血清葡萄糖浓度，采用甘油三脂和总胆固醇酶法进行检测甘油三脂和总胆固醇；葡萄糖耐量的检测取所述步骤一中注射STZ四周后的小鼠，进行口服葡萄糖耐量测定，小鼠禁食12h～16h，自由饮水，腹腔注射40％葡萄糖，在葡萄糖注射前及在葡萄糖注射后30min，60min，120min断尾取血，3500×g离心15min，吸取血清，采用葡萄糖氧化酶法测定各时间点血清中葡萄糖含量；尿量、尿蛋白以及尿白蛋白的检测取所述步骤一中的8组给药小鼠，分别检测给药4周以及给药8周时小鼠的尿量、尿蛋白以及尿白蛋白；血肌酐和血清尿素氮的检测取所述步骤一中的8组给药小鼠，检测给药8周时小鼠的血肌酐和血清尿素氮；血清钠和血清钾的检测取所述步骤一中的8组给药小鼠，检测给药8周时小鼠的血清钠和血清钾；尿钠和尿钾的检测取所述步骤一中的8组给药小鼠，分别检测给药4周以及给药8周时小鼠的尿钠和尿钾；体重和肾脏指数的检测取所述步骤一中的8组给药小鼠，在给药的8周时间内，每周称量小鼠体重一次至给药结束，通过计算肾脏指数；步骤三、病理学的统计通过所述步骤二对小鼠各项指标的检测，分别统计给药4周和给药8周后，RH对模型组小鼠整体生理状况以及葡萄糖耐量，尿量、尿蛋白以及尿白蛋白，血肌酐和血清尿素氮，血清钠和血清钾，尿钠和尿钾，体重和肾脏指数的影响；步骤四、统计结果分析将步骤三统计的结果分别做给药4周和给药8周的柱形图，通过柱形图得出RH可降低空腹血糖，降糖效果与高剂量黄连素相同；RH可降低血清总胆固醇及甘油三酯水平，与黄连总生物碱效果相同；RH可降低24h尿量、尿蛋白和尿白蛋白排出量；RH可降低血尿素氮和血肌酐；RH可升高血钠、降低血钾，尿钠排出增多、尿钾排出减少；RH对早期糖尿病肾病具有治疗作用。所述步骤一中的正常饲料为5％脂肪，53％碳水化合物，23％蛋白，总热量在25kJ/kg；高脂饲料为22％脂肪，48％碳水化合物，20％蛋白，总热量在44.3kJ/kg。本发明中给药RH80+320mg/kg记为RH高或复方高、RH40+160mg/kg记为RH中或复方中、RH20+80mg/kg记为RH低或复方低RH对糖尿病小鼠整体生理状况的影响在实验过程中，对各组实验动物的生理状态进行观测并记录。正常对照组(CON)动物精神活跃，活动频繁，毛发顺滑有光泽，进食饮水量均正常，尿量正常，体重增加趋势稳定且迅速；模型组(DM)动物精神萎靡，活动频率低，眼球缺血苍白，毛发枯燥无光泽，呈现高饮水低进食现象，尿量多，垫料潮湿，需要每天更换；RH给药高、中、低、人参总皂苷、黄连总生物碱组和卡托普利组糖尿病症状有显著改善，生理状态与正常对照组接近。各实验组均存在意外死亡或丢失的动物数据，并未记录于最终统计结果中。RH对C57小鼠2型糖尿病模型的血糖与葡萄糖耐量本发明采用C57小鼠高脂饮食联合小剂量STZ制备2型糖尿病模型，模型鼠经过1个月高脂肪饮食喂养，1～2次小剂量STZ注射，STZ注射后1个月筛选糖尿病模型鼠，模拟糖尿病肾病的形成过程。C57纯系小鼠正常血糖值为5.50±0.11mmol/L，模型组血糖稳定在8.43±0.20mmol/L，多次测量血糖后发现个体差异较小，另外，葡萄糖耐量明显下降具备2型糖尿病特征。如图2所示，糖尿病模型复制成功后，给药1个月后RH低、中和高剂量均降低了空腹血糖，但血糖降低幅度不大，仅复方中剂量组与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)，黄连素高剂量降低血糖作用与模型组比较亦未有显著性差异。人参总皂苷高剂量组无降低血糖作用。给药2个月后，复方低、中和高剂量均明显降低了空腹血糖，且呈现剂量依赖性，与模型组比较具有显著性差异。复方中剂量组降血糖作用与黄连素高剂量降低血糖作用相当。人参总皂苷高剂量组无降低血糖作用。RH对糖尿病肾病小鼠血清总胆固醇、甘油三酯的影响如图3、图4所示，结果表明糖尿病模型复制成功后，血清总胆固醇和甘油三酯水平升高，与模型组比较均具有显著性差异，给药2个月后，除了复方低剂量组外，其他给药组均降低了血清总胆固醇水平，黄连总碱与复方中剂量水平相当。仅复方高剂量降低甘油三酯较模型组具有显著性差异。RH对糖尿病肾病小鼠尿量、尿蛋白和尿白蛋白排出量的影响如图5、图6、图7所示，尿量、尿蛋白和尿白蛋白排出量是糖尿病肾病早期即可检测的指标，是衡量肾功能受损的最重要的指标。给与STZ后1个月糖尿病模型成功，结果表明：与正常对照组比较，糖尿病模型组在尿量、尿总蛋白和尿白蛋白排出量均明显增加，而给药1个月后，RH组低、中和高剂量组均明显降低了24h尿量、尿蛋白和尿白蛋白排出量；复方中、高剂量组效果好于单独高剂量人参总皂苷组或黄连总碱组；复方中剂量组与阳性药卡托普利效果相当。RH对糖尿病肾病小鼠血尿素氮、血肌酐的影响如图8、图9所示，与正常对照组相比，血尿素氮和血肌酐在模型组均明显升高，表明肾小球滤过能力降低，给药2个月后，RH组低、中和高剂量组均明显降低了血尿素氮，与模型组比较具有显著性差异；复方中、高剂量组效果好于单独使用高剂量人参总皂苷组或高剂量黄连总碱组；复方中剂量组与阳性药卡托普利效果相当。血肌酐含量的变化趋势与血尿素氮相似，但由于标准差较大，因此与模型组比较，无显著性差异。RH对糖尿病肾病小鼠血清钠、血清钾、尿钠、尿钾的影响如图10、图11、图12以及图13所示，糖尿病模型血钠和血钾水平均高于正常小鼠，RH组低、中和高剂量组具有升高血钠，却降低血钾的作用，给药1月后，促进了尿钠排出增多，尿钾排出减少。RH对糖尿病肾病小鼠体重的影响如图14所示，正常对照组体重(27.6±0.72g)略高于其他各组，但均无显著性差异。给药前糖尿病成模小鼠按体重随机分组，模型组及各给药组体重均值在25.6g～26.1g。给药后每周进行测体重1次，模型组及各给药组间体重无显著性差异。RH对糖尿病肾病病理HE染色结果病理HE染色结果表明，糖尿病模型复制成功后，肾小球-肾间质变化并明显，但给STZ后3个月，糖尿病肾病模型复制成功，可见肾小球-肾间质改变：肾小球系模基质弥漫性增多，毛细血管基底膜弥漫性增厚，毛细血管腔变窄，肾小管上皮细胞颗粒样和空泡样变性及萎缩。肾间质水肿和淋巴细胞浸润。复方低、中和高剂量均改善了糖尿病肾病的肾小球-肾间质病变，其中以中、高剂量改善明显。黄连总碱高剂量，卡托普利和复方中剂量效果相当。人参总皂苷高剂量组对糖尿病肾病病理亦有改善作用。本发明采用C57小鼠，高糖高脂饮食和STZ腹腔注射造成早期2型糖尿病肾病模型。观察人参黄连组合物对C57小鼠的生理状况、血糖、尿微量白蛋白和肌酐等肾功能性病变指标的影响；通过测定血清中总胆固醇、甘油三酯、血钾、血钠、尿素氮等变化，以及肾脏组织切片的直接形态观察，来进一步研究人参黄连组合物对DN小鼠的作用及机理，疗程8周。结果发现RH能够显著降低糖尿病小鼠血糖值，降低早期DN小鼠尿微量白蛋白及血肌酐含量，降低DN小鼠总胆固醇与甘油三酯含量，平衡小鼠血液中离子水平，改善DN小鼠的肾脏组织形态。以上研究提示RH对早期糖尿病肾病具有一定治疗作用。